裂褶菌高產菌絲體發酵培養基的優化

孫 暢, 宋鵬煒, 李翹楚, 王紅艷

(中國農業大學 煙臺研究院, 山東 煙臺 264670)

0 引言

【研究意義】裂褶菌(Schizophyllumcommune)又稱白參、樹花和雞毛菌等,隸屬于真菌門擔子菌綱傘菌目裂褶菌科裂褶菌屬(Schizophyllum),是一種珍貴的藥食兩用菌[1-2]。裂褶菌為木腐菌,自然狀態下一般于春秋季生于闊葉樹及針葉樹的枯枝及腐木上,廣泛分布于世界各地,在我國主要分布于河北、黑龍江、遼寧、內蒙古及云南等20余個省(區、市)。裂褶菌子實體不僅味道鮮美,且富含蛋白質、免疫性多糖、多種人體必需氨基酸和微量元素[3-6],具有免疫調節、抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥及抗疲勞等多種功效,尤其是裂褶菌多糖因具有藥用和保健價值而成為研究熱點[7-10]。裂褶菌已經實現人工栽培,但仍存在生產周期長、生物轉化率低、栽培規模小、產量及品質不穩定等問題,導致其活性產物的開發利用受到限制。因此,提高裂褶菌菌絲體產量對于其活性產物的開發利用具有重要意義。【前人研究進展】液體發酵技術是獲得裂褶菌菌絲體和發酵產物的重要手段,此方式具有生產周期短、不受季節和地域的限制、成本低等優勢,因此探索裂褶菌液體發酵條件可為規模化的菌絲體生產及活性產物的開發利用提供技術支持。目前,國內對裂褶菌液體發酵的研究已有少量報道[11-15],冀頤之等[13]研究確定裂褶菌產糖的最優培養基配方為葡萄糖45 g/L、酵母膏3 g/L、 KH2PO40.5 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L,在此條件下裂褶菌菌絲體最大得率為20.75 g/L;邴雪等[14]研究表明,當培養基碳源為玉米淀粉,氮源為酵母浸粉,pH 4時,發酵液中裂褶菌素的產量最高,達2.13 mg/mL。【研究切入點】已有研究均以胞外多糖產量為指標對培養基成分或培養條件進行優化,而有關培養基配方對菌絲體產量影響的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】采用搖瓶培養和正交試驗方法,以菌絲體產量為篩選指標,對1株野生裂褶菌的液體發酵培養基重要碳源、氮源及生長因子進行優化,探索液體發酵條件對該裂褶菌菌絲體生長的影響,以期為菌絲體的批量生產及其胞內活性產物開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 裂褶菌菌株 為野生菌株,由中國農業大學煙臺研究院分離保存。

1.1.2 培養基

1) 馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)。馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g及水1 000 mL,pH自然。

2) 種子培養基。土豆浸粉 8 g、蛋白胨 2 g、葡萄糖 20 g、牛肉膏 2 g、酵母膏 2 g、MgSO4·7H2O 1 g及KH2PO42 g及水1 000 mL,pH 6.0。

3) 基礎發酵培養基(g/L)。葡萄糖 20 g、酵母膏 6 g、VB10.001 g、MgSO4·7H2O 1 g及KH2PO42 g,水1 000 mL,pH 6.0。

1.1.3 主要儀器與設備 CR21GⅢ冷凍離心機,Hitachi Koki公司;電子天平,賽多利斯科學儀器(北京)有限公司;超凈工作臺,蘇州安泰空氣技術有限公司;高壓蒸汽滅菌器,上海申安醫療器械廠;電熱鼓風干燥箱,上海一恒科學儀器有限公司;SFY-10L發酵罐,鎮江市江大科技有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 種子液的制備 將裂褶菌菌種接種到PDA平板上,25 ℃培養3～5 d。用直徑1 cm的打孔器,打取4個菌絲塊,接種到裝液量為150 mL/250 mL的種子培養基中,于25 ℃、160 r/min條件下培養5 d。按5%接種量接種于新的種子培養基中,于25 ℃、160 r/min條件下培養5 d即得到新鮮的種子液。

1.2.2 最適碳源、氮源及生長因子的篩選 取種子液以5%的接種量接種于碳源、氮源和生長因子篩選培養基中,于25 ℃、160 r/min條件下培養7 d,以菌絲體干質量為考察指標篩選最適碳源、氮源及生長因子。菌絲體產量測定:將發酵液6 000 r/min離心10 min,取沉淀,用蒸餾水洗滌3次,放置50 ℃烘箱中烘干至恒重,然后稱重即得。

1) 碳源。設4個處理,在基礎發酵培養基其他原料不變的情況下,改變培養基中的碳源(葡萄糖)分別為淀粉、蔗糖、麥芽糖及乳糖,質量濃度20 g/L;以基礎發酵培養基為對照(CK),下同。

2) 氮源。設4個處理,在基礎發酵培養基其他原料不變的情況下,改變氮源(土豆浸粉)分別為蛋白胨、牛肉膏、酵母膏及大豆蛋白胨,質量濃度6 g/L。

3) 生長因子。設4個處理,參照文獻[16]的方法,在基礎發酵培養基其他原料不變的情況下,改變生長因子(VB1)分別為油酸、L-谷氨酸、α-萘乙酸及3-吲哚丁酸,質量濃度1 mg/L。

1.2.3 單因素試驗 在確定最佳碳源、氮源及生長因子基礎上,以菌絲干質量為考察指標分別對其最適濃度進行篩選。

1) 碳源。設5個處理(Z1～Z5),分別為10 g/L、20 g/L、30 g/L、40 g/L和50 g/L。

2) 氮源。設5個處理(B1～B5),分別為4 g/L、6 g/L、8 g/L、10 g/L和12 g/L。

3) 生長因子。設5個處理(L1～L6),分別為0.5 mg/L、1 mg/L、1.5 mg/L、2 mg/L、2.5 mg/L和3.0 mg/L。250 mL培養瓶的裝液量為150 mL,于25 ℃、160 r/min條件下培養5 d,分別測定其菌絲體的干質量。

1.2.4 正交試驗優化裂褶菌菌絲體發酵培養基 在單因素試驗的基礎上,以蔗糖〔A(g/L)〕、牛肉膏〔B(g/L)〕和L-谷氨酸〔C(mg/L)〕為試驗主要因素,通過L9(34)正交試驗(表1)優化高產菌絲體發酵培養基配方。

表1 L9(34)正交試驗優化裂褶菌菌絲體發酵培養基的因子與水平

2 結果與分析

2.1 不同碳源、氮源與生長因子處理菌絲體的產量

由圖1可知,不同碳源、氮源與生長因子對裂褶菌菌絲體產量的影響存在差異。

2.1.1 碳源 不同碳源處理裂褶菌菌絲體產量為6.76～12.22 g/L,依次為蔗糖>麥芽糖>葡萄糖>淀粉>乳糖,各因素間存在較大差異。其中,乳糖顯著低于其余碳源,淀粉顯著低于其余碳源;葡萄糖和麥芽糖作為碳源時菌絲體產量無顯著差異;以蔗糖為碳源時菌絲體產量顯著高于其余碳源,故蔗糖為最佳碳源。

2.1.2 氮源 不同氮源處理菌絲體產量為11.52～13.43 g/L,依次為牛肉膏>蛋白胨>酵母膏>大豆蛋白胨>土豆浸粉。其中,土豆浸粉顯著低于其余氮源,蛋白胨、酵母膏和大豆蛋白胨三者之間無顯著差異;牛肉膏顯著高于其余氮源,故牛肉膏為最佳氮源。

注：圖柱上不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

2.1.3 生長因子 不同生長因子處理菌絲體產量為11.79～12.52 g/L,依次為L-谷氨酸>3-吲哚丁酸>α-萘乙酸>VB1>油酸。其中,VB1、α-萘乙酸和油酸間無顯著差異,但均顯著低于其余生長因子;3-吲哚丁酸顯著低于L-谷氨酸;L-谷氨酸顯著高于其余生長因子,故L-谷氨酸為最佳生長因子。

2.2 不同因素處理菌絲體的產量

由圖2可知,裂褶菌菌絲體產量均隨不同因素濃度增加呈先增后降趨勢。

圖2 不同因素處理裂褶菌菌絲體的產量

2.2.1 蔗糖 不同濃度蔗糖處理裂褶菌菌絲體產量為9.70～19.56 g/L,依次為Z4>Z5>Z3>Z2>Z1。Z4菌絲體產量最高;蔗糖濃度繼續增加,菌絲體產量反而減少。說明,適當增加蔗糖濃度有助于菌絲體生長,而蔗糖濃度過高則會抑制菌絲體生長。因此,確定蔗糖濃度30 g/L、40 g/L和50 g/L為高產菌絲體正交試驗中碳源的3個水平。

2.2.2 牛肉膏 不同濃度牛肉膏處理裂褶菌菌絲體產量為10.63～14.53 g/L,依次為B3>B4>B2>B5>B1。牛肉膏濃度小于8 g/L時菌絲體產量隨牛肉膏濃度增加而增加;B3(牛肉膏濃度為8 g/L時)菌絲體產量達最大;牛肉膏濃度超過8 g/L菌絲體產量隨牛肉膏濃度增加而降低。因此,確定牛肉膏濃度6 g/L、8 g/L、10 g/L為高產菌絲體正交試驗中氮源的3個水平。

2.2.3 L-谷氨酸 不同濃度L-谷氨酸處理裂褶菌菌絲體產量為9.27～9.78 g/L,依次為L5>L4>L3>L2>L1>L6。當L-谷氨酸濃度為0.5～1.5 mg/L時,菌絲體產量隨L-谷氨酸濃度增加而緩慢增加;當L-谷氨酸濃度超過1.5 mg/L時,菌絲體產量呈明顯增加;當L-谷氨酸濃度為2.5 mg/L時,菌絲體產量達最大;之后濃度繼續增加,則菌絲體產量呈下降趨勢。因此,確定1.5 mg/L、2 mg/L、2.5 mg/L為高產菌絲體正交試驗中生長因子的3個水平。

2.3 正交試驗優化裂褶菌菌絲體發酵培養基組合

L9(34)正交試驗結果(表2～4)表明,各處理菌絲體產量為10.05～20.86 g/L,依次為T8>T9>T7>T5>T6>T4>T3>T2>T1,T8(A3B2C1)菌絲體產量最高,T9其次。從K值看出,最優培養基組合為A3B2C2,即蔗糖50 g/L、牛肉膏8 g/L、L-谷氨酸2 mg/L。進一步對正交試驗結果進行方差分析和F檢驗表明,因素A和因素B對裂褶菌菌絲體產量的影響差異顯著,而因素C對菌絲體產量的影響差異不顯著,校正模型整體具有顯著性。

表2 裂褶菌菌絲體發酵培養基正交試驗結果

表3 L9(34)正交試驗的均值、極差與最優組合

表4 正交試驗方差分析

由于根據K值分析得到的最優組合A3B2C2不在正交試驗設計中,對于其實際生產效果進行驗證(3次重復)試驗,結果表明,利用優化后的培養基,種子液以5%的接種量,250 mL培養瓶裝液量為150 mL,于25 ℃、160 r/min條件下培養7 d,菌絲體產量達21.51 g/L,是基礎培養基上菌絲體產量(10.55 g/L)的2.03倍,較正交試驗最佳處理T8提高3.1%。

3 討論

目前,裂褶菌液體發酵研究以提高胞外多糖得率為主,提高菌絲體產量以及菌絲體營養方面的研究相對較少。馬布平等[17-18]對裂褶菌培養基進行了篩選,但尚未就裂褶菌菌絲生長需要的營養條件進行探究。邴雪等[14]研究表明,裂褶菌最佳碳源和氮源分別為玉米淀粉和酵母浸粉;周瑩等[19]研究認為,可溶性淀粉和黃豆粉分別為最佳碳、氮源。孫金旭等[20]研究顯示,裂褶菌菌絲體最適的生長因子為油酸。本研究結果顯示,裂褶菌最適的碳源、氮源和生長因子分別是蔗糖、牛肉膏和L-谷氨酸。不同研究得出的結論并不一致,其原因可能是研究者選取的裂褶菌菌種不同,或試驗時所選取的營養物質種類不同導致。

裂褶菌菌絲體含有豐富的多糖等活性物質,其胞內多糖分子量大于胞外多糖[21-22],且具有胞外多糖沒有的生物活性[23]。研究結果表明,最優培養基組合為蔗糖50 g/L+牛肉膏8 g/L+L-谷氨酸2 mg/L+MgSO4·7H2O 1 g/L+KH2PO42 g/L,pH 6.0,利用此培養基,種子液以5%的接種量,250 mL培養瓶裝液量為150 mL,于25 ℃、160 r/min條件下培養7 d,菌絲體產量達21.51 g/L,是基礎培養基產菌絲體(10.55 g/L)的2.03倍,較正交試驗最佳組合A3B2C1提高3.1%。研究結果為裂褶菌胞內活性產物的工業化生產和開發利用提供了一定技術支持,但研究僅對高產菌絲體培養基的主要成分進行了優化,今后還需從其他培養基成分、培養條件及代謝產物的積累等方面開展進一步研究。

4 結論

采用搖瓶培養、單因素試驗和正交試驗方法探究1株野生裂褶菌高產菌絲體液體發酵培養基配方,對發酵培養基中的碳源、氮源及生長因子進行優化,篩選出最佳發酵培養基(蔗糖50 g/L+牛肉膏8 g/L+L-谷氨酸2 mg/L+MgSO4·7H2O 1 g/L+KH2PO42 g/L,pH 6.0),其裂褶菌菌絲體產量達21.51 g/L,是基礎培養基上菌絲體產量的2.03倍。