番木瓜胚性細胞懸浮系高效遺傳轉化體系的建立

楊敏 周陳平 李慶萌 鄺瑞彬 吳夏明 魏岳榮

DOI：10.13925/j.cnki.gsxb.20230156

摘? ? 要：【目的】建立番木瓜高效遺傳轉化體系，為番木瓜基因功能研究和重要農藝性狀改良提供新的技術支撐。【方法】以紫暉番木瓜胚性細胞懸浮系（embryogenic cell suspensions，ECS）為遺傳轉化受體，利用植物表達載體pCAMBIA1301和農桿菌介導法進行遺傳轉化，對抗生素濃度篩選、侵染時間、繼代培養、抗性胚的誘導與萌發以及植株再生整個過程進行探索，最后獲得抗性再生植株?！窘Y果】通過設置不同濃度的頭孢霉素和潮霉素處理，觀察ECS細胞狀態，篩選、確定頭孢霉素和潮霉素最適處理質量濃度分別為200 mg·L-1和5 mg·L-1。工程菌和ECS共培養侵染2 d后轉到含有頭孢霉素和潮霉素的液體篩選培養基上進行繼代培養，繼代周期為14 d。經GUS染色驗證，表明繼代3次后的ECS幾乎全部為轉化細胞。將以上ECS轉移到液體胚誘導培養基中進行培養，2個月后可獲得大量球形體細胞胚，且GUS組織染色為藍色。將球形體細胞胚轉到半固體成熟培養基上培養，2個月后可獲得成熟子葉期體細胞胚。子葉期體細胞胚在萌發培養基上光培養30 d后，可獲得再生芽。任意選取再生芽進行GUS染色，均可染成藍色?？剐栽偕拷洿俑囵B可成功獲得再生植株。利用PCR檢測抗性再生植株，可以確定GUS基因已經整合到番木瓜基因組中。【結論】成功建立了一種以番木瓜ECS為轉化受體的農桿菌介導的高效遺傳轉化體系。在該技術體系中，經農桿菌侵染后的ECS繼代篩選3次后，幾乎全部為轉化細胞，這些轉化細胞經體胚誘導、成熟、萌發和生根過程可成功獲得再生植株，抗性體胚得胚率為43.65%，抗性體胚萌發率為73.26%，植株再生率為80.55%，大大提高了番木瓜遺傳轉化效率。該體系為番木瓜基因功能研究和分子育種提供了新的途徑。

關鍵詞：番木瓜；胚性懸浮系；根癌農桿菌；遺傳轉化；共培養

中圖分類號：S667.9 文獻標志碼：A 文章編號：1009-9980（2023）10-2089-09

Establishment of a high-efficiency genetic transformation system for papaya using embryogenic cell suspensions as genetic transformation receptors

YANG Min， ZHOU Chenping， LI Qingmeng， KUANG Ruibin， WU Xiaming， WEI Yuerong*

（Institute of Fruit Tree Research， Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Key Laboratory of South Subtropical Fruit Biology and Genetic Resource Utilization， Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Guangdong Province Key Laboratory of Tropical and Subtropical Fruit Tree Research， Guangzhou 510640， Guangdong， China）

Abstract： 【Objecive】 Papaya （Carica papaya L.） is a wildly cultivated tropical and subtropical fruit with a high nutritional and medicinal value. However， papaya disease is very serious， which is an important problem restricting the development of papaya industry. The key to solve this problem is to use molecular breeding to breed disease-resistant varieties of papaya， and the establishment of efficient genetic transformation system is an important premise of molecular breeding. Therefore， the aim of this study was to establish an efficient genetic transformation system， and provide new technical support for the study of important gene functions and molecular genetic improvement of papaya. 【Methods】 In this study， immature zygote embryos of Zihui papaya were used as explants to obtain embryogenic cell suspensions （ECS） by induction， proliferation， screening and liquid oscillation culture. Using ECS as the receptors for genetic transformation， and the plant expression vector pCAMBIA1301 was transformed by Agrobacterium-mediated method. This study explored the suitable conditions of antibiotic concentration， infection time， subculture， induction， maturation and germination of resistant embryos， and finally obtained resistant regenerated plants. 【Results】 First， ECS were treated with different concentrations of cefotaxime sodium （0， 100， 200， 300， 400 mg·L-1） and hygromycin （0， 3， 5， 7， 10 mg·L-1） respectively， and then the growth state and cell morphology of suspended cells were observed. The results showed that the optimal concentrations of cefotaxime sodium and hygromycin were 200 mg L-1 and 5 mg L-1， respectively. After that， the engineered bacteria containing target genes were prepared， and the prepared ECS were co-cultured with the engineered bacteria for 2 days and transferred to the liquid screening medium containing cefotaxime sodiums and hygromycin for subculture. The subculture period was 14 days. GUS staining showed that after 3 subgenerations， almost all the suspended cells were transformed cells. These suspended cells were transferred to a liquid embryo induction medium for culture. After 2 months， a large number of spherical somatic embryos were obtained， and GUS tissue staining was blue. The spheroidal somatic embryos were transferred to a mature medium for culture， and the mature somatic embryos at cotyledon stage were obtained after 2 months. The average resistance somatic embryos rate was 23.2×103 mature somatic embryos per 1 mL packed cell volume （PCV） of ECS. The germination rate of resistant somatic embryos was 73.26% when cotyledon stage embryos were cultured on a germination medium for 30 days. The result of GUS staining showed that any regenerated bud could be dyed blue. By promoting root culture， the resistant regenerated buds were successfully regenerated， and the regeneration rate was 80.55%. Simultaneously， PCR amplification of the regenerated plants indicated that GUS gene had been integrated into the papaya genome. 【Conclusion】 In this study， an Agrobacterium-mediated genetic transformation system using papaya ECS as transformation receptor was successfully established. In this technology system， almost all of the ECS infected by Agrobacterium were transformed cells after three times of subselection， and these transformed cells could regenerate plants successfully through somatic embryo induction， maturation， germination and rooting. The germination rate of resistant somatic embryos was 43.65%， the germination rate of resistant somatic embryos was 73.26%， and the plant regeneration rate was 80.55%. The efficiency of genetic transformation of papaya was greatly improved. This system could provide a new approach for gene function study and molecular breeding of papaya.

Key words： Papaya （Carica papaya L.）; Embryogenic cell suspensions; Agrobacterium; Genetic transformation; Co-culture

番木瓜（Carica papaya L.）起源于墨西哥南部和哥斯達黎加地區，目前在世界各地的熱帶和亞熱帶地區都有種植。番木瓜是中國嶺南特色水果，具有很高的營養和藥用價值，有“百益果王”之稱[1-3]。然而，番木瓜環斑花葉病毒（papaya ringspot virus，PRSV）、番木瓜畸形花葉病毒（papaya leaf distortion mosaic virus，PLDMV）、炭疽病等病害嚴重制約了番木瓜產業的可持續發展，培育抗病品種是產業發展的關鍵[1，4-5]。由于番木瓜栽培品種抗病資源匱乏，遺傳基礎狹窄，傳統雜交育種難以培育出綜合性狀優異的抗病新品種[6-7]，因此分子育種是培育抗病番木瓜新品種的最有效途徑，而建立番木瓜高效遺傳轉化體系是實現這一途徑的重要前提。

番木瓜是最早進行轉基因的作物之一，主要集中在抗PRSV轉基因的研究。Fitch等[8-9]首先利用基因槍法，以番木瓜愈傷組織為轉化受體進行遺傳轉化，獲得了抗PRSV毒株HA的轉基因番木瓜品系55-1，之后不斷回交，獲得了轉基因品種SunUp。2017年Jia等[10]也利用該方法獲得了針對海南PRSV毒株的轉基因抗病番木瓜。但基因槍法轉化效率低，成本高，且轟擊會造成細胞核內DNA雙鏈斷裂，在DNA雙鏈修復過程中目的基因及其載體片段會隨機插入，這個過程極有可能導致染色體重組等非目標基因改變。1993年，Fitch等[11]首先建立了以番木瓜胚性愈傷組織為遺傳轉化受體的農桿菌共培養轉化體系，并通過體胚發生途徑獲得了轉基因番木瓜。研究人員也利用農桿菌介導法獲得了抗病品種華農一號番木瓜[12]。然而，通過番木瓜胚性愈傷組織誘導體胚發生并獲得再生植株的途徑，存在基因型依賴、體胚發育不同步、胚根生根質量差、體胚發生率和植株再生率低等問題[13]，成為限制番木瓜轉基因技術廣泛應用的瓶頸。綜上所述，當前的番木瓜遺傳轉化技術仍需進一步改進和完善，以提高轉化效率和增強實用性。

胚性細胞懸浮系（embryogenic cell suspensions，ECS）被認為是理想的遺傳轉化受體材料。以ECS為受體，利用農桿菌介導等方法在柑橘[14]和香蕉[15]等作物中均獲得了轉基因植株。課題組前期建立了成熟的番木瓜均質ECS和高效再生技術體系[7]，筆者在本研究中以此為基礎，旨在建立一種以番木瓜ECS為遺傳轉化受體、農桿菌介導的高效遺傳轉化體系，為番木瓜基因功能研究和分子育種提供技術支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

本研究所利用的遺傳轉化受體為紫暉番木瓜（廣東省農業科學院果樹研究所雜交培育的新品種，品種權號：CNA20201005052）的ECS，由廣東省農業科學院果樹研究所利用未成熟合子胚為外植體，經胚性愈傷組織誘導、增殖、篩選和液體振蕩培養等過程建立獲得[7]。供試菌株為根癌農桿菌菌株EHA105，供試載體為pCAMBIA1301：含有β-葡萄糖甘酸酶基因（β-glucuronidase，GUS）和潮霉素磷酸轉移酶基因（Hygromycin B phosphotransferase，HPT）。本研究所用培養基組成參照魏岳榮等[7]的配方，并根據實驗需要略作改動（表1）。

1.2 頭孢霉素和潮霉素最適濃度的篩選

為了明確液體增殖培養基中可抑制根癌農桿菌生長的頭孢霉素（Cef）濃度和篩選陽性植株的潮霉素濃度，筆者在ML培養基中分別添加了不同質量濃度的頭孢霉素（0、100、200、300、400 mg·L-1）和潮霉素（0、3、5、7、10 mg·L-1），在黑暗條件下，（27±1）℃、110 r·min-1 振蕩培養，觀察ECS增殖生長情況，并利用顯微鏡觀察細胞狀態，確定合適的篩選濃度。

1.3 工程菌的制備

將含有目的基因的根癌農桿菌在YEB（含有50 mg·L-1卡那霉素）的固體培養基上劃線，（27±1）℃條件下培養，然后挑取單菌落繼續在含有50 mg·L-1卡那霉素的YEB液體培養基中，150 r·min-1振蕩培養至對數期（OD600=0.8～1.0），將菌液離心棄去上清液后，重懸于含有100 ?mol·L-1乙酰丁香酮（AS）的液體共培養培養基中，制備工程菌備用。

1.4 侵染與液體共培養

取在ML液體培養中繼代培養10 d的ECS，離心去上清液后，加入經1.3步驟獲得的工程菌液，在（27±1）℃、黑暗條件下靜置1～2 h，然后在（27±1）℃、黑暗、50 r·min-1振蕩條件下共培養2 d，將培養物離心、去除上清液后，清洗3次，轉移至含有100 ?mol·L-1 AS、200 mg L-1頭孢霉素和5 mg L-1潮霉素的液體篩選培養基LSM中，繼續黑暗培養，每14 d繼代1次。

1.5 抗性篩選和植株再生

按1.4方法，連續繼代3次以上。每次繼代培養時取0.1 mL細胞密實體積的ECS進行GUS染色實驗。取液體篩選培養3代的ECS，靜置后去上清液，將培養物轉移至液體體胚誘導培養基MSI中誘導體細胞胚，每14 d更新一次培養基，黑暗條件下培養2個月統計體細胞胚發生數量。將獲得的球形體細胞胚轉移到半固體MSI上成熟培養2個月，直至獲得成熟的子葉期體胚。將子葉期抗性體胚轉移至體胚萌發培養基MG上進行萌發培養，1個月后統計體細胞胚萌發率。培養條件為：（27±1）℃、12 h（L）/12 h（D）光周期、54 ?mol·m-2·s-1光照度。然后，將萌發的分化芽轉移至生根培養基MR，促進莖部和根系發育，培養1個月后獲得完整的轉化植株，統計植株再生率。同時以未侵染的ECS為對照，進行體胚誘導、成熟和萌發培養，直到獲得再生植株。

1.6 GUS基因的檢測及陽性植株的鑒定

1.6.1? ? GUS基因的檢測? ? 通過GUS組織染色，主要檢測對象：共培養后繼代篩選的第一代、第二代和第三代的ECS細胞團、由共培養篩選3個繼代周期后通過ECS誘導獲得的成熟體細胞胚及其再生芽以及相應的對照材料。

1.6.2? ? 陽性植株的分子鑒定? ? 利用CTAB（cetyltrimethylammonium bromide）法提取番木瓜葉片DNA，并以此為模板，利用GUS基因特異性引物：LP：5-TTACGGCAAAGTGTGGGTCA-3和RP：5-TCGGTGATGATAATCGGCTG-3，進行PCR擴增檢測，擴增長度為1233 bp，PCR反應條件為：94 ℃ 2 min、98 ℃ 10 s、58 ℃ 30 s、68 ℃ 1 min，33個循環，68 ℃延伸5 min。PCR產物利用1.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳后利用凝膠成像系統拍照保存。

2 結果與分析

2.1 頭孢霉素和潮霉素最適質量濃度的篩選

在液體篩選培養基中添加頭孢霉素主要是為了抑制共培養之后根癌農桿菌的生長，同時為了確保頭孢霉素不會對ECS的生長造成影響。在ML培養基中分別添加0、100、200、300、400 mg·L-1頭孢霉素進行暗培養，觀察其對ECS增殖生長狀態和細胞形態的影響。培養2周后，結果如表2和圖1-A所示，頭孢霉素質量濃度為0、100、200 mg·L-1時，胚性懸浮細胞為圓形或橢圓形，生長量基本正常；當頭孢霉素質量濃度達到300 mg·L-1時，懸浮細胞顏色變深，開始褐化，通過光學顯微鏡觀察，部分細胞伸長變形，ECS增殖生長受到影響；而當質量濃度達到400 mg·L-1時，出現較多的游離長月形異常細胞，ECS增殖生長受到明顯影響。以有效抑制農桿菌生長且不影響番木瓜ECS生長為原則，確定200 mg·L-1頭孢霉素為最適質量濃度。

同時，在ML培養基中分別添加0、3、5、7、10 mg·L-1潮霉素，觀察其對ECS增殖生長狀態和細胞形態的影響。結果如圖1-B和表2所示，培養2周后，當潮霉素質量濃度為5 mg·L-1時，ECS出現輕微褐化，但細胞形態和增殖量基本正常；當質量濃度達到7 mg·L-1和10 mg·L-1時，ECS顏色變白，生長狀態差，增殖量小，顯微鏡下可看到大量彎月形和長條形異常細胞，生長受到嚴重影響。以不改變細胞形態且可篩選抗性懸浮細胞為目標，確定5 mg·L-1潮霉素為最適質量濃度。

2.2 工程菌侵染共培養及轉化細胞的篩選

將工程菌侵染2 d后的ECS用ML培養基清洗干凈，轉移到液體篩選培養基LSM中進行繼代培養。在繼代的同時，吸取部分ECS進行GUS染色，與未轉化的ECS對照（圖2-A）相比，在篩選培養第1代的ECS中可見少許被染上藍色的轉化細胞團（圖2-B）；繼續進行第2代篩選培養，轉化細胞在篩選壓力下不斷增殖，未轉化的細胞會發生褐化死亡，能染上藍色的細胞團比例明顯增多（圖2-C）；在第3代ECS中，ECS幾乎全部染上藍色，即幾乎全部為轉化細胞（圖2-D）。由此可見，經過3代或3代以上的篩選培養，可以獲得生長良好的轉基因番木瓜ECS。

2.3 體胚的誘導、成熟、萌發和植株再生

將繼代3次的ECS先轉到液體體胚誘導培養基MSI上，2個月后可見大量白色圓球形體細胞胚（圖3-A～B）。對抗性球形胚進行GUS染色鑒定表明，誘導形成的抗性球形胚幾乎全部都可以染上藍色，即全部為轉化體細胞胚（圖3-C）。經統計，篩選繼代3次的番木瓜ECS具有很強的體細胞胚發生能力，平均抗性體細胞胚獲得率為23.2×103個·mL-1 PCV，抗性體胚得胚率為43.65%，與對照ECS的平均體細胞胚獲得率相近（表3）。將球形體細胞胚轉移到半固體MSI上培養2個月，可逐步發育為成熟的子葉期體細胞胚（圖3-D～E）。

挑選子葉期體細胞胚接種于體細胞胚萌發培養基MG上進行光培養，3 d后可見體細胞胚開始萌發，10 d后可見到萌發的綠色子葉（圖4-A），同時體細胞胚根段開始出現愈傷化。培養30 d后，體細胞胚已具備完整的下胚軸、子葉和芽（圖4-B）。經統計，經遺傳轉化的子葉期體細胞胚萌發率為73.26%，低于對照（97.58%）（表3）。以未轉化芽作對照，任意切取再生抗性芽進行GUS染色鑒定，均可被染成藍色（圖4-C～D）。再生芽于生根培養基MR上培養10 d后開始生根，1個月后可獲得發育良好的小植株，植株再生率為80.55%，與對照（81.36%）相近（圖4-E，表3）。

2.4 轉化植株的分子鑒定

為了確定GUS基因在番木瓜基因組中的整合情況，筆者對獲得的具有GUS活性的10株（2～11號泳道）番木瓜轉基因植株進行了PCR檢測。電泳結果表明，與未轉化的番木瓜植株（1號泳道）相比，在獲得的具有GUS活性的番木瓜轉基因株系中均可擴增出目的條帶（圖5），進一步說明GUS基因轉化成功，已經整合到番木瓜基因組中。

3 討 論

目前，番木瓜轉基因研究采用的遺傳轉化受體材料主要是胚性愈傷組織，采用的轉基因方法包括基因槍法、農桿菌介導法和花粉管通道技術[9-13，16]。雖然在番木瓜轉基因的研究中應用這些方法都可獲得轉基因植株，但是需要進一步改進和完善轉化體系，以提高轉化效率和增強實用性。筆者在本研究中從受體材料選擇、農桿菌共培養方式、侵染時間、篩選培養基選擇等方面進行了探索和優化，成功建立了番木瓜胚性細胞懸浮系的高效遺傳轉化和再生體系。

3.1 遺傳轉化方法的選擇

在番木瓜轉基因研究方面，最早應用的是基因槍法，通過該方法獲得轉基因胚的時間大概需要4個月[4]，但是基因槍轉化效率低，且轟擊會造成細胞核內DNA雙鏈斷裂，在DNA雙鏈修復過程中目的基因及其載體片段會隨機插入，這個過程極有可能導致染色體重組等非目標基因改變?；ǚ酃芡ǖ婪壳斑€沒有明確的定論。相較基因槍法，農桿菌轉化系統具有拷貝數低、變異少等優點。因此，Fitch等[11]在1993年開始利用農桿菌菌介導法進行番木瓜的遺傳轉化，結果獲得了轉基因植株，但由于受體材料的限制，篩選過程中材料損失很大，在方法上迫切需要優化。

3.2 受體材料及再生體系

受體材料是實現番木瓜高效遺傳轉化的重要因素。前人曾較多地報道以番木瓜胚性愈傷組織為受體進行遺傳轉化，進而誘導體細胞胚發生并獲得再生植株，但該途徑存在基因型依賴、體胚發育不同步、胚根生根質量差、體胚發生率和植株再生率低等問題[8，17-19]，限制了轉基因技術的廣泛應用。番木瓜胚性細胞懸浮系被認為是最理想的轉基因受體，但由于懸浮系制備困難，且周期較長，目前還未見相關報道。筆者在本研究中以前期制備的番木瓜胚性懸浮系為受體材料，進行遺傳轉化，發現在繼代3次以后，轉化細胞幾乎為100%，具有很高的轉化效率。同時，筆者所在課題組前期還建立了基于胚性細胞懸浮系的高效植株再生技術體系[7]，該體系可以提高細胞胚再生率、發育的同步性以及植株再生率，解決了之前報道的方法轉化效率低、同時再生難的問題。值得一提的是，多年的研究經驗表明，與香蕉等其他物種一樣，番木瓜胚性細胞懸浮系的體胚發生能力與繼代時間長短密切相關[20-21]，隨著繼代時間的延長，體胚誘導率和萌發率都會逐漸下降。因此，為了提高轉化效率，在選擇胚性細胞懸浮系作為受體時應考慮這一因素，并保持研究材料胚性細胞懸浮系的持續更新。

3.3 農桿菌侵染及繼代篩選方法

目前農桿菌侵染共培養的方法主要采用半固體培養法[8-12，22]，不但容易污染，而且容易導致受體嚴重褐化甚至損失[22]，筆者在本研究中采用液體培養方式進行農桿菌與ECS共培養，在保證懸浮細胞和工程菌充分接觸的同時，降低培養時的轉速以減緩農桿菌的生長速度，防止其過度生長。在繼代篩選時，筆者同樣使用了液體培養方式，經3次繼代篩選后，可使轉化細胞高效地快速繁殖，并淘汰非轉化細胞，操作簡便，同時能得到大量轉化胚性懸浮細胞，為后續體胚誘導、萌發、植株再生和轉基因材料的獲得提供了充足的材料基礎。由于潮霉素等抗生素在一定程度上會影響植物正常生長發育，應用本文方法經過3代及3代以上的篩選培養后，幾乎所有的ECS都已經是轉化的材料，所以在后續胚誘導、體胚萌發和生根時可適當降低或不添加抗生素，可顯著提高獲得轉基因材料的概率。值得一提的是，在本研究中筆者發現，雖然抗性體細胞胚獲得率與未轉化ECS體細胞胚獲得率基本一致，后期不添加抗生素也提高了轉基因植株獲得的概率，但是抗性體細胞胚成熟率和萌發率都會比未轉化對照的低一些，筆者認為這可能還是與液體篩選中添加了頭孢霉素和潮霉素、在抗性體細胞胚成熟和萌發培養基中添加了頭孢霉素有很大關系。

4 結 論

筆者在本研究中成功建立了一種以番木瓜ECS為轉化受體的農桿菌介導的高效遺傳轉化體系。在該技術體系中，經農桿菌侵染后的ECS繼代篩選3次后，幾乎全部為轉化細胞，這些轉化細胞經體胚誘導、成熟、萌發和生根過程可成功獲得再生植株，抗性體胚得胚率為43.65%，抗性體胚萌發率為73.26%，植株再生率為80.55%，大大提高了番木瓜遺傳轉化效率。

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收稿日期：2023-04-20 接受日期：2023-06-26

基金項目：廣州市重點研發計劃項目（2023B03J1369）；廣東省基礎與應用基礎研究基金項目（2022A1515010697，2021A1515010739）；廣東省農業科學院果樹研究所培育項目（22100）；廣東省省級鄉村振興戰略專項資金種業振興項目（2022-NPY-00-032）；國家高端外國專家引進計劃項目（G2023030034L）；國家自然科學基金項目（32102355）

作者簡介：楊敏，女，副研究員，博士，研究方向為番木瓜分子育種。Tel：020-38765869，E-mail：minyang_0123@126.com

通信作者 Author for correspondence. Tel：020-38765468，E-mail：weid18@163.com