非小細胞肺癌患者血清miR-374b-5p、VEGF-C 的表達及與預后的關系

李敏婕 劉淑紅 陳洪云 余海青

1.山東省臨沂市腫瘤醫院內三科，山東臨沂 276000；2.山東省臨沂市腫瘤醫院內五科，山東臨沂 276000

肺癌是世界范圍內第二常見和死亡率最高的惡性腫瘤，2020 年全球新發和死亡病例達220.7、179.6萬例，我國肺癌新發和死亡病例達81.6、71.5 萬例，居全球首位[1]。臨床超過80%為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC），晚期NSCLC 患者5 年生存率不足5%[2-3]。研究顯示，微RNA（microRNA，miRNA）參與NSCLC 發生和進展[4-5]。有研究報道，miR-374b-5p在黑色素瘤和乳腺癌等惡性腫瘤的進展有關[6-7]。研究表明，血管生成與腫瘤發生發展密切相關[8]。血管內皮生長因子C（vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C）是VEGF 家族的新成員，在血管生成中發揮重要作用[9]。研究報道，VEGF-C 參與膀胱癌、卵巢癌等惡性腫瘤細胞的侵襲和轉移過程[10-11]。基于此，本研究探討血清miR-374b-5p、VEGF-C 表達與NSCLC 患者病理參數和預后的關系。

圖1 miR-374b-5p 與VEGF-C 結合位點圖

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018 年2 月至2019 年9 月山東省臨沂市腫瘤醫院（以下簡稱“我院”）收治的105 例接受手術切除的NSCLC 患者為NSCLC 組，其中男60 例，女45例；年齡41～82 歲，平均（59.27±8.32）歲。納入標準：①經病理證實為NSCLC；②初診且未接受過抗腫瘤治療；③TNM 分期Ⅰ～Ⅲ期；④接受根治手術；⑤年齡≥18 歲。排除標準：①合并其他部位惡性腫瘤；②合并血液、免疫系統損害；③院內死亡或不能接受隨訪。另選取我院同期54 名體檢健康者為對照組，其中男31 例，女23 例；年齡24～77 歲，平均（58.15±7.17）歲。兩組一般資料比較，差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究受試者或家屬知情并簽署知情同意書，并經我院倫理委員會批準（2018 倫字011）。

1.2 研究方法

采集NSCLC 組入院次日和對照組體檢時靜脈血3 ml，離心后取上層血清，取部分血清通過Trizol 法提取血清總RNA，微量分光光度計驗證純度、濃度合格后使用TaKaRa 反轉錄試劑盒（上海翌圣生物科技股份有限公司，編號：11111ES）合成cDNA。參考SYBRPremix Ex TaqTM試劑盒（廣州威佳科技有限公司，編號：RR902Q）說明書進行擴增，miR-374b-5p：正向引物5’-TCAAGGAGAAGAGACTATATTTGC-3’，反向引物5’-ACTCCAAACTCCTTCCCCACAT-3’；內參U6：正向引物5’-CAACAGCCTCAAGATCATCAGC-3’，反向引物5’-TTCTAGACGGCAGGTCAGGTC-3’；引物設計和合成由上海新貝生物科技有限公司完成。95℃90 s，95℃30 s、63℃30 s、72℃15 s，循環40 次反應結束后，2-ΔΔCT法計算血清miR-374b-5p 相對表達量。剩余部分血清采用酶聯免疫吸附試驗法（上海瓦蘭生物科技有限公司，編號：E01585）檢測VEGF-C水平。

1.3 分組方法

患者出院后通過門診或電話隨訪3 年（截至2022 年9 月）。根據NSCLC 患者血清miR-374b-5p、VEGF-C 表達平均值分為miR-374b-5p 高、低表達組和VEGF-C 高、低表達組，統計不同組別患者生存情況。

1.4 統計學方法

采用SPSS 28.0 統計學軟件進行數據分析。計量資料用均數±標準差（）表示，比較采用t 檢驗；計數資料用例數或百分率表示，比較采用χ2檢驗；血清miR-374b-5p 與VEGF-C 的相關性采用Pearson 相關系數；miR-374b-5p 與VEGF-C 結合位點預測采TargetScan 數據庫https：//www.targetscan.org/；K-M 法繪制不同miR-374b-5p、VEGF-C 表達NSCLC 患者生存曲線；NSCLC 死亡的影響因素采用Cox 回歸分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組血清miR-374b-5p、VEGF-C 表達比較

NSCLC 組血清miR-374b-5p 表達低于對照組，VEGF-C 表達高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組血清miR-374b-5p、VEGF-C 表達比較（）

表1 兩組血清miR-374b-5p、VEGF-C 表達比較（）

注miR-374b-5p：微RNA-374b-5p；VEGF-C：血管內皮生長因子C；NSCLC：非小細胞肺癌。

2.2 miR-374b-5p 與VEGF-C 結合位點

miR-3746-5p 與VEGF-C 結合下點預測采TargetScan 數據庫https：//www.targetscan.org/miR-374b-5p與VEGF-C 的3’-非翻譯區381-388 和585-591 處存在結合位點。見圖1。

2.3 NSCLC 患者血清miR-374b-5p 與VEGF-C 表達的相關性

NSCLC 患者血清miR-374b-5p 與VEGF-C 表達呈負相關（r=-0.735，P＜0.001）。

2.4 NSCLC 患者血清miR-374b-5p、VEGF-C 表達與病理參數的關系

不同分化程度、TNM 分期、淋巴結轉移NSCLC 患者血清miR-374b-5p、VEGF-C 表達比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 NSCLC 患者血清miR-374b-5p、VEGF-C 表達與病理參數的關系（）

表2 NSCLC 患者血清miR-374b-5p、VEGF-C 表達與病理參數的關系（）

注NSCLC：非小細胞肺癌；miR-374b-5p：微RNA-374b-5p；VEGF-C：血管內皮生長因子C。

2.5 NSCLC 患者血清miR-374b-5p、VEGF-C 表達與生存時間的關系

105 例NSCLC 患者隨訪3～36 個月，失訪5 例，死亡44 例，中位生存時間為29.4 個月。miR-374b-5p高表達組（≥1.09，55 例）中位生存時間為31.9 個月，低表達組（＜1.09，50 例）中位生存時間為26.5 個月；VEGF-C 高表達組（≥651.21pg/ml，52 例）中位生存時間為32.1 個月，VEGF-C 低表達組（＜651.21 pg/ml，53 例）中位生存時間為26.6 個月。不同miR-374b-5p、VEGF-C 表達NSCLC 患者生存曲線比較，差異有統計學意義（χ2=7.402、8.108，P=0.007、0.004）。見圖2。

圖2 不同血清miR-374b-5p、VEGF-C 表達NSCLC 患者K-M 生存曲線

2.6 NSCLC 死亡的單因素和多因素Cox 回歸分析

以性別（男=1；女=0）、年齡（≥60 歲=1；＜60 歲=0）、吸煙（是=1；否=0）、病理類型（腺癌=1；鱗癌=0）、腫瘤大小（≥5 cm=1；＜5 cm=0）、分化程度（低分化=1；中高分化=0）、TNM 分期（Ⅲ期=1；Ⅰ～Ⅱ期=0）、淋巴結轉移（有=1；無=0）、miR-346-5p（連續變量）、VEGF-C（連續變量）為自變量，隨訪時間為時間變量，生存狀態（死亡=1；存活=0）為因變量進行Cox 回歸分析。結果顯示，TNM 分期Ⅲ期、有淋巴結轉移、VEGF-C 升高為NSCLC 死亡的獨立危險因素（HR=3.195、4.212、1.102，P＜0.05），miR-374b-5p 升高為獨立保護因素（HR=0.988，P＜0.05）。見表3。

表3 NSCLC 死亡的單因素和多因素Cox 回歸分析結果

3 討論

NSCLC 是起源于支氣管至終末肺泡所有上皮細胞惡性腫瘤的統稱，截至目前手術切除仍然是早中期NSCLC 最有效的治療方法[12]。盡管近年來腫瘤分子生物學的進展推動實現了靶向和免疫療法，但僅部分NSCLC 患者獲得臨床效益，且隨著治療時間的延長獲得性耐藥越來越多，預后也越來越差[13-14]。NSCLC的發生發展是多因素參與的復雜過程，表觀遺傳學在NSCLC 中扮演重要角色[15]。miRNA 是表觀遺傳學的新的研究熱點，能通過與mRNA 的3’-非翻譯區互補或配對引發mRNA 降解或轉錄后沉默，進而調控NSCLC 發生發展[16-17]。miR-374b-5p 定位于人X 染色體長臂13.2 處，能通過調節T 細胞分化參與免疫炎癥反應過程。近年研究發現，miR-374b-5p 參與腫瘤過程，如miR-374b-5p 能靶向高遷移率族蛋白B1/Wnt3a/β-連環蛋白通路抑制卵巢癌細胞增殖、侵襲、遷移和上皮-間質轉化和抑制凋亡[18]；同時能靶向基質金屬蛋白酶14，抑制神經膠質瘤細胞增殖、遷移、侵襲[19]。miR-374b-5p 在多種惡性腫瘤中發揮抑制作用。本研究結果顯示，NSCLC 患者血清miR-374b-5p低表達，并與分化程度、TNM 分期、淋巴結轉移有關。提示miR-374b-5p 在NSCLC 患者血清中低表達可能與其啟動子被甲基化導致表達沉默有關。而隨著miR-374b-5p 表達下調，可上調富含絲氨酸/精氨酸剪接因子7，能識別前體RNA 剪切元件招募組裝剪接體，促進NSCLC 細胞增殖、遷移、侵襲和抑制凋亡[20-21]。

腫瘤細胞持續分裂和增殖會消耗大量的氧氣和營養物質，高耗氧和營養物質缺乏不利于腫瘤細胞生長，為此腫瘤需要通過形成新的血管以獲取更多的氧氣和營養物質[22]。腫瘤新生血管的生長和成熟是血管生成促進因子和抑制因子復雜的協調過程，VEGF-C是血管生成因子VEGF 家族新發現的一個成員，能通過結合VEGF 受體2、VEGF 受體3 刺激血管內皮細胞遷移和增生，促進新生血管生成[23]。研究報道，VEGF-C 能通過促進腫瘤新生血管生成促進結直腸癌、肺腺癌等惡性腫瘤的進展[24-25]。本研究結果顯示，NSCLC 患者血清VEGF-C 高表達，并與分化程度、TNM分期、淋巴結轉移有關。提示VEGF-C 在NSCLC 患者血清中高表達可能與其啟動子被癌基因激活有關，而隨著VEGF-C 表達上調促進腫瘤新生血管生成，進而促進NSCLC 惡性進展[26]。本研究通過TargetScan 數據庫預測發現，miR-374b-5p 與VEGF-C 存在結合位點；相關性分析發現血清miR-374b-5p 與VEGF-C表達呈負相關。提示二者可能共同參與NSCLC 發生發展。趙麗霞等[27]研究報道，上調miR-374b-5p 能靶向下調VEGF-C 表達，抑制NSCLC 細胞增殖、上皮-間質轉化、遷移和侵襲。本研究結果顯示，血清miR-374b-5p 高表達和VEGF-C 低表達的NSCLC 患者中位生存時間長，且二者均為NSCLC 患者死亡的獨立影響因子。提示血清miR-374b-5p、VEGF-C 表達與NSCLC 患者預后有關，有望成為NSCLC 患者預后的潛在指標。

綜上所述，NSCLC 患者血清miR-3 74b-5p 和VEGF-C 與病理參數和預后相關，二者可能共同參與NSCLC 進展。但本研究還需進一步擴大樣本研究證實，并進一步研究miR-374b-5p、VEGF-C 參與NSCLC的機制。