平眩方對椎動脈型頸椎病模型SD 大鼠的治療作用及機制研究

王怡璇 彭 楠 肖晶晶 李騰龍▲ 李 璐

1.湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院骨傷一科，湖南長沙 410005；2.成都市雙流區(qū)第一人民醫(yī)院中醫(yī)骨傷科，四川成都 610200

椎動脈型頸椎病（cervical spondylotic arteriopathy，CSA）是頸椎病常見分型之一，是指眩暈與頸部疼痛癥狀相關(guān)聯(lián)的一種臨床綜合征[1-3]。CSA 患者被頸部疼痛及陣發(fā)性眩暈困擾，極大地影響了患者的生活質(zhì)量[4-5]。近年來，CSA 的發(fā)病率逐年攀升、發(fā)病人群逐漸年輕化[6]，找到治療CSA 的有效方法成為亟待解決的臨床問題。中醫(yī)對于頸椎病的治療獨具特色，CSA 在中醫(yī)隸屬于“眩暈”范疇。平眩方是治療CSA 的經(jīng)驗方，經(jīng)過臨床反復(fù)使用和驗證，療效安全、穩(wěn)定，患者反饋良好[7-10]。為了進一步探索平眩方治療CSA 的作用機制，本研究探討平眩方對于CSA 模型大鼠椎動脈血流情況、血液流變學、血漿內(nèi)皮素（endothelin，ET）及血清一氧化氮（nitric oxide，NO）水平、椎動脈血管壁中膜厚度的影響。

1 對象與方法

1.1 實驗動物

SPF 級SD 大鼠60 只（雌雄各半），8 周齡，體重（200±20）g，由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。在室溫（25±1）℃、濕度45%～50%的條件下飼養(yǎng)。動物許可證號：SYXK（湘）2019-0009，動物生產(chǎn)合格證號：430727221100472812。實驗已獲得湖南中醫(yī)藥大學動物倫理委員會批準（LL2022022304）。

1.2 實驗藥物

消痔靈注射液（國藥準字：Z22026175，吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司），氟桂利嗪膠囊（國藥準字：KKJ0QH5，西安楊森制藥有限公司）。平眩方的制備：半夏、天麻、黃芪、當歸、鉤藤、白術(shù)、茯苓、川芎、赤芍、桃仁、紅花、地龍、甘草的質(zhì)量比為1∶3∶6∶2∶2∶2∶2∶2∶2∶1∶1∶1∶1（湖南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院中藥房提供），加入藥物總質(zhì)量的10 倍量蒸餾水提取2 h，過濾保留濾液，濾渣加入藥物開始總質(zhì)量的8 倍量蒸餾水操作同前，將兩次濾液合并，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至2 g/ml，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 主要試劑與儀器

NO 硝酸還原酶法試劑盒（貨號：FY40104-A，江蘇菲亞生物科技有限公司）；ET 放射免疫法試劑盒（貨號：FY3509-A，江蘇菲亞生物科技有限公司）；蘇木精-水溶性伊紅染色液（貨號：BA4025，武漢貝索生物技術(shù)有限公司）；中性樹膠（貨號：10004160，中國醫(yī)藥集團有限公司）。彩色多普勒超聲診斷儀（型號：D350-VET，飛依諾科技股份有限公司）；全自動血流變測試儀（型號：ZL9100，北京眾馳自動化設(shè)備有限公司）；脫水機（Donatello，湖南迪佩斯智能科技有限公司）；包埋機（型號：JB-P5，武漢俊杰實業(yè)集團有限公司）；病理切片機（型號：RM2016，上海徠卡儀器有限公司）；組織攤片機（型號：KD-P，浙江科迪集團有限公司）；顯微鏡（型號：E100，尼康）。

1.4 實驗分組及處理

60 只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，按照隨機數(shù)字表法分為6 組：正常組，模型組，氟桂利嗪組，平眩方低、中、高劑量組，每組各10 只。除正常組外，其他組均進行造模處理。

采用改良注射硬化劑法[11-13]制作CSA 大鼠模型：腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，將大鼠放置呈右側(cè)臥位，從左側(cè)肱骨頭上緣垂直頸椎進針注射5 ml/kg 消痔靈注射液于大鼠左側(cè)第3～5 頸椎橫突孔周圍肌肉，1 周后重復(fù)注射。

造模4 周后大鼠灌胃給藥，根據(jù)人與大鼠體表面積折算法[14]計算各組給藥劑量。氟桂利嗪組給予0.9 mg/kg 氟桂利嗪膠囊（相當于成人劑量10 mg/d，用0.9%NaCl 配成0.1 mg/ml），平眩方中劑量組給予15.6 g/kg 平眩方濃縮液（臨床有效劑量，相當于成人劑量130 g/d），平眩方低、高劑量組分別予7.80、31.2 g/kg平眩方濃縮液，正常組及模型組不予治療。連續(xù)給藥2 周，1 次/d。

1.5 觀察指標及檢測方法

1.5.1 大鼠椎動脈經(jīng)顱多普勒超聲（transcranial doppler，TCD）檢測 末次給藥后，所有大鼠禁食禁水12 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，枕后及頸部備皮，TCD 測定左側(cè)椎動脈平均血流速度（mean velocity，Vm）、搏動指數(shù)（pulsation index，PI）、阻力指數(shù)（resistance index，RI）。

1.5.2 大鼠血液流變學及血漿NO、血清ET 表達的檢測末次給藥后，所有大鼠禁食禁水12 h，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉，下腔靜脈取血5 ml，置肝素管進行全血黏度[低（1/s）、中（5/s、30/s）、高（200/s）切變率下檢測]、全血低/高切相對指數(shù)和紅細胞聚集指數(shù)測定；全血經(jīng)25℃、3 000 r/min離心10 min，取血漿測定血漿黏度，所有樣本在4 h 內(nèi)檢測完畢。另取1 ml全血于普通管靜置30 min 后，樣品離心取上層血清（4℃，離心半徑8 cm，3 000 r/min，10 min），按試劑盒說明書檢測血清中NO 水平；另取1 ml 全血于肝素管中混勻30 min 后，樣品離心分離上層血漿（4℃，離心半徑8 cm，3 000 r/min，30 min），按試劑盒說明書檢測血漿中ET 水平。

1.5.3 大鼠椎動脈血管壁中膜厚度的檢測 取大鼠左側(cè)椎動脈3～5 mm 組織，4%多聚甲醛固定48 h，石蠟包埋，切片，蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀測血管壁中膜厚度。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 27.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較均采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t 檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠左側(cè)椎動脈血流TCD 檢測

與正常組比較，模型組左側(cè)椎動脈Vm 降低，PI與RI 升高（P＜0.05）；與模型組比較，平眩方中、高劑量組左側(cè)椎動脈Vm 升高，PI 與RI 降低（P＜0.05）；與平眩方低劑量組比較，平眩方中、高劑量組的左側(cè)椎動脈Vm 升高，PI 與RI 降低（P＜0.05）。見圖1。

2.2 各組血液流變學指標比較

與正常組比較，模型組低、中、高各切變率下的全血黏度，血漿黏度、全血高/低切相對指數(shù)、紅細胞聚集指數(shù)均升高（P＜0.05）；與模型組比較，平眩方中、高劑量組血液流變學各指標均降低（P＜0.05）；與平眩方低劑量組比較，平眩方中、高劑量組血液流變學各指標均降低（P＜0.05）。見圖2～3。

圖2 各組大鼠全血黏度比較（n=10）

圖3 各組大鼠血漿黏度、全血高/低切指數(shù)、紅細胞聚集指數(shù)比較（n=10）

2.3 各組血漿ET、血清NO 含量比較

與正常組比較，模型組血漿ET 水平升高，血清NO水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，平眩方中、高劑量組血漿ET 水平降低，血清NO 水平升高（P＜0.05）；與平眩方低劑量組比較，平眩方中、高劑量組血漿ET水平降低，血清NO 水平升高（P＜0.05）。見圖4。

圖4 各組大鼠NO、ET 檢測結(jié)果（n=10）

2.4 各組血管壁中膜厚度比較

與正常組比較，模型組椎動脈血管壁中膜平滑肌細胞肥大增生明顯，血管壁中膜厚度增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，平眩方中、高劑量組血管壁中膜平滑肌細胞肥大增生明顯受到抑制，血管壁中膜厚度降低（P＜0.05）；與平眩方低劑量組比較，平眩方中、高劑量組血管壁中膜厚度降低（P＜0.05）。見圖5、表1。

圖5 各組大鼠椎動脈切片（HE 染色，200×）

表5 各組大鼠椎動脈血管壁中膜厚度比較（μm，）

表5 各組大鼠椎動脈血管壁中膜厚度比較（μm，）

注 與正常組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與平眩方低劑量組比較，cP＜0.05。

3 討論

CSA 是骨科的常見病，因頸椎內(nèi)外結(jié)構(gòu)的平衡被破壞，導(dǎo)致椎動脈受壓引起眩暈、目眩及視物模糊等一系列臨床表現(xiàn)，影響患者的生活工作，造成嚴重的經(jīng)濟負擔和心理壓力[2-5]。隨著CSA 的深入研究，改善血液流變學指標、緩解椎動脈血管痙攣是目前治療的主要思路、中醫(yī)藥治療從整體觀念、辨證論治的角度出發(fā)，為CSA 的治療帶來了新的可能、平眩方臨床效果顯著，全方具有化痰熄風、活血通絡(luò)之功，使痰散瘀消、血脈通行、眩止痛緩。本研究使用平眩方干預(yù)治療CSA 大鼠模型探討平眩方治療CSA 可能存在的作用機制。

腦供血不足是CSA 常見的病理變化，其根本原因在于椎動脈受壓，使血流速度減慢，頸椎局部炎癥刺激椎動脈痙攣，進而導(dǎo)致椎-基底動脈供血不足，腦部因缺氧而眩暈[15-16]。通過TCD 檢測椎動脈的血流變化，可以評估腦供血不足的程度及恢復(fù)情況。研究證實，CSA 發(fā)病與血液流變學波動呈正相關(guān)[17-18]。發(fā)病期間CSA 患者的血液流變學各指標明顯升高，細胞聚集性增高，血液處于高黏狀態(tài)，血流速度減慢，導(dǎo)致腦部供血減少[19]。ET 是由血管內(nèi)皮細胞分泌的生物活性多肽，能收縮血管[20-21]，NO 能抑制ET 的縮血管作用，可使內(nèi)皮下血管平滑肌細胞處于增殖靜止狀態(tài)而達到抗血管壁增殖的作用[22-23]。長期由炎癥引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)可能會引起椎動脈血管平滑肌細胞肥大、增殖，進而引發(fā)血管重構(gòu)[24]。血管壁中膜厚度是確定血管重構(gòu)的重要指標之一[24-25]。本研究將TCD 檢測血流變化、血液流變學指標、血清NO、血漿ET 和血管壁中膜厚度作為觀察指標。

本研究結(jié)果顯示，平眩方中、高劑量干預(yù)CSA 大鼠模型后，能夠升高椎動脈Vm，降低Pi 與RI，提示平眩方能夠改善椎動脈的血流情況；平眩方中、高劑量組各切變率下的血漿黏度，全血高、低切指數(shù)及紅細胞聚集指數(shù)顯著降低，提示平眩方在改善血液流變學、稀釋血液黏度、維持紅細胞形變穩(wěn)定方面具有積極作用；平眩方中、高劑量組能夠降低ET 水平、增加NO 水平、抑制椎動脈血管壁中膜增厚，提示平眩方能夠通過調(diào)節(jié)ET 與NO 的平衡關(guān)系，從而改善椎動脈痙攣、減少局部炎癥的產(chǎn)生，進一步抑制平滑肌細胞增殖，抑制血管損傷及重構(gòu)、紅細胞變形性受許多因素影響。目前有關(guān)紅細胞變形性及血管重構(gòu)與CSA 的相關(guān)研究較少，未來可以進一步研究。

綜上所述，CSA 的發(fā)病機制可能與血管收縮舒張功能失調(diào)、血流動力和血液流變學指標異常、椎動脈增殖重構(gòu)等相關(guān)。