血清miR-125a-3p、miR-224-3p 表達與腦梗死患者頸動脈粥樣硬化斑塊的關系

李 星 劉京鋒 李 博

北京市和平里醫院神經內科，北京 100013

調查數據顯示，我國腦梗死年發病率為144.8/10萬，死亡率為62.2/10 萬，已成為居民死亡的主要原因之一[1]。動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）斑塊破裂引起的血管狹窄或阻塞是腦梗死發生的重要原因[2]。目前臨床主要依靠影像學檢查頸動脈粥樣硬化（carotid atherosclerosis，CAS）斑塊判斷斑塊穩定性，尚缺乏理想的生物標志物[3]。研究表明，炎癥反應和微RNA（microRNA，miRNA）在AS 發生發展中扮演重要角色[4-5]。miR-125a-3p 和miR-224-3p 是新近發現的廣泛保守的miRNA 分子，研究報道miR-125a-3p和miR-224-3p參與炎癥反應過程[6-7]。同時有研究指出，miR-125a-3p 能通過加重血管狹窄促進AS 發生[8]，miR-224-3p能通過抑制炎癥反應抑制AS 形成[9]。然而關于血清miR-125a-3p、miR-224-3p 表達與腦梗死患者CAS斑塊穩定性的關系尚不清楚，本研究對此進行分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019 年3 月至2021 年12 月北京市和平里醫院（以下簡稱“我院”）收治的120 例腦梗死患者。納入標準：①符合腦梗死診斷標準[10]；②年齡≥18 歲；③經超聲檢查證實存在CAS 斑塊；④首次診治；⑤資料完整。排除標準：①腦出血或近3 個月內顱腦手術史或外傷史；②合并造血、免疫系統損害、惡性腫瘤；③合并嚴重實質性臟器損傷；④近3 個月內有急慢性感染；⑤近6 個月內有免疫抑制劑、激素使用史。參考《中國腦卒中血管超聲檢查指導規范》[11]，將不規則斑塊（斑塊表面不光滑和纖維帽不全，管腔血流充盈不全）和潰瘍性斑塊（斑塊表面纖維帽不連續破裂，形成“火山口”征）判定為不穩定斑塊。根據CAS 斑塊穩定性將患者分為不穩定組（75 例）和穩定組（45例）。本研究經我院科教科倫理審批（2022-0015）。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集 收集患者資料，包括性別、年齡、體重指數、吸煙史、病史（高血壓、糖尿病）、總膽固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白膽固醇（high density lipoprotein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）。

1.2.2 血清miR-125a-3p、miR-224-3p 檢測 患者入院次日采集空腹靜脈血3 ml，3 000 r/min 離心15 min（半徑為10 cm），分離血清置于-80℃冰箱保存。Trizol 法提取血清總RNA，TaKaRa 反轉錄試劑盒（北京智杰方遠科技有限公司，RR036A）合成cDNA。以cDNA 為模板，按照SYBRPremix Ex TaqTM試劑盒（上海赫果生物科技有限公司，DRR820A）說明書，采用PCR 儀（美國ABI，型號：ABI7500）進行PCR 擴增。反應體系共20.0 μl：cDNA 模板1.0 μl、2×Master mix 8 μl、正向引物0.5 μl，反向引物0.5 μl、SYBRPremix Ex Taq 5.0 μl、RNase-free ddH2O 5.0 μl。反應條件：95℃90 s、95℃30 s、63℃30 s、72℃15 s，循環40 次后收集 Ct 值，2-ΔΔCT法計算血清 miR-125a-3p、miR-224-3p 相對表達量。引物設計和合成由上海劍鈍生物科技有限公司完成，miR-125a-3p 正向引物序列為5’-TAACCGCAGAGGTCACACTCAG-3’，反向引物序列為5’-CTCAGAAACTGTGGCATCCCGA-3’。miR-224-3p 正向引物序列為 5’-TAATCTCAGCTGGCAACTGTG-3’，反向引物序列為5’-GAACATGTCTGCGTA-TCTC-3’。miR-125a-3p內參U6 正向引物序列為5’-ACTTTCACGCCGCTCATCCAGT-3’，反向引物序列為5’-TCTCAGGACTGGTTCACAG-CGT-3’。miR-224-3p 內參U6 正向引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCACAT-3’，反向引物序列為5’-TTTGCGTGTCATCCTT-GCG-3’。

1.3 統計學方法

采用SPSS 28.0 統計學軟件進行數據分析。計量資料采用均數±標準差（）表示，比較采用t 檢驗；計數資料采用例數和百分率表示，比較采用χ2檢驗。采用logistic 回歸模型分析影響因素；Hosmer-Lemeshow檢驗模型擬合度；采用受試者操作特征曲線分析診斷價值。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組臨床資料比較

不穩定組吸煙者占比、糖尿病患者占比、LDL-C、miR-125a-3p 表達高于穩定組，miR-224-3p 表達低于穩定組，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組臨床資料比較

2.2 腦梗死患者CAS 斑塊穩定情況的影響因素分析

以吸煙（是=1；否=0）、糖尿?。ㄓ?1；無=0）、LDL-C（原值錄入）、miR-125a-3p（原值錄入）、miR-224-3p（原值錄入）為自變量，CAS 斑塊穩定性（不穩定=1；穩定=0）為因變量進行多因素分析，結果顯示，吸煙、糖尿病、LDL-C、miR-125a-3p、miR-224-3p 為腦梗死患者CAS 斑塊不穩定的影響因素（P＜0.05）。見表2。

表2 腦梗死患者CAS 斑塊穩定情況的影響因素分析

2.3 腦梗死患者CAS 斑塊不穩定的預測模型及其診斷價值

以CAS 斑塊不穩定的獨立影響因素構建預測模型Log=P/（1-P）=0.973×吸煙+1.161×糖尿病+1.866×LDL-C+0.034×miR-125a-3p-0.668×miR-224-3p。Hosmer-Lemeshow 檢驗結果顯示模型擬合效果良好（χ2=14.377，P=0.072）。受試者操作特征曲線分析顯示，該模型預測腦梗死患者CAS 斑塊不穩定的曲線下面積為0.915（95%CI：0.850～0.958，P＜0.05），截斷值為0.625，約登指數、靈敏度、特異度分別為0.751、84.00%、91.11%。見圖2。

圖1 腦梗死患者頸動脈粥樣硬化斑塊不穩定預測模型的受試者操作特征曲線

3 討論

炎癥反應貫穿AS 發生發展的全過程，在AS 初期炎癥反應能損害血管內皮和促進血管平滑肌增殖、遷移等促進AS 形成和發展，在AS 后期炎癥反應能誘導細胞外基質降解增加和合成減少，導致斑塊纖維帽變薄，最終引起斑塊不穩定和破裂[12-17]。近年來隨著生命科學的快速發展，研究發現，miRNA 能通過引發mRNA 降解或轉錄后沉默，通過調控炎癥反應等參與AS 發生發展[18-20]。miR-125a-3p 定位于人染色體19q13.41，參與炎癥反應發生發展，Wang 等[21]研究報道，下調miR-125a-3p 能靶向Wnt/β-連環蛋白和核因子κB 通路抑制成纖維細胞樣滑膜細胞的炎癥反應。Wang 等[22]研究報道，下調miR-125a-3p 能靶向酪氨酸蛋白激酶Fyn 抑制核因子κB 通路，抑制成牙母細胞的炎癥反應。上述研究提示，miR-125a-3p 具有促炎作用。同時有研究指出，miR-125a-3p 表達上調會加重低密度脂蛋白誘導血管內皮細胞損害，促進AS 形成[23]。本研究顯示，不穩定組血清miR-125a-3p表達升高，進一步分析發現，血清miR-125a-3p 表達升高為腦梗死患者CAS 斑塊不穩定的獨立危險因素，提示血清miR-125a-3p 表達上調與腦梗死患者斑塊不穩定有關，分析原因可能與miR-125a-3p 表達上調通過促進炎癥反應發展，誘導AS 斑塊不穩定有關。劉演龍等[24]研究也發現，抑制miR-125a-3p 能減輕AS 斑塊炎癥反應和細胞外基質降解，增強AS斑塊穩定性。

miR-224-3p 定位于人染色體Xq28，研究報道[25]miR-224-3p 能通過抑制白細胞介素-1β 減輕軟骨細胞炎癥反應。Wang 等[26]研究指出，上調miR-224-3p能減輕血管內皮炎癥反應，發揮內皮保護和抗AS 作用。這些研究提示，miR-224-3p 具有抗感染作用。本研究結果顯示，不穩定組血清miR-224-3p 表達降低，進一步分析發現，血清miR-224-3p 表達升高為腦梗死患者CAS 斑塊不穩定的保護因素，提示血清miR-224-3p 表達下調與腦梗死患者斑塊不穩定有關，分析原因可能是miR-224-3p 表達下調導致炎癥進展，進而引起AS 斑塊不穩定。巨噬細胞在AS 炎癥反應發生發展中發揮重要作用，研究表明，miR-224-3p 能靶向腫瘤壞死因子超家族成員14 抑制巨噬細胞向炎癥表型轉換，減輕巨噬細胞內脂質積聚，進而增強AS 斑塊穩定性[27]。

本研究結果顯示，吸煙、糖尿病和LDL-C 升高也會增加腦梗死患者CAS 斑塊不穩定，分析原因可能是吸煙和糖尿病均能增強機體炎癥反應，通過破壞斑塊纖維帽導致斑塊不穩定性增加[28]；LDL-C 是AS 斑塊形成的必要條件，LDL-C 升高會促進AS 進一步發展，導致斑塊不穩定性風險增加[29-31]。本研究聯合吸煙、糖尿病、LDL-C、miR-125a-3p、miR-224-3p 構建腦梗死患者CAS 斑塊不穩定的預測模型，結果顯示該模型的曲線下面積為0.915，提示其預測價值較高。

綜上所述，腦梗死患者血清miR-125a-3p 表達升高，miR-224-3p 表達降低，可能成為腦梗死患者CAS斑塊不穩定的輔助評估指標。但本研究結果還需多中心大樣本研究證實。