微生物菌劑的茶園抑草效果及對茶葉品質的影響

林占軍, 湯江武, 陳小龍, 李達, 李清聲*

(1.葳龍生物科技 (浙江) 有限公司, 浙江 杭州 310021; 2.浙江省農業科學院, 浙江 杭州 310021;3.浙江農藝師學院, 浙江 杭州 310021)

除草劑是指可使雜草徹底地或選擇性地發生枯死的藥劑, 可分為選擇性除草劑與非選擇性除草劑。目前, 除草劑已成為農業生產過程中至關重要的物料。據統計, 2020 年全球除草劑市場份額占農藥總市場的44.2%, 超過殺菌劑 (27.1%) 和殺蟲劑 (25.3%)。但隨著農業安全生產要求和公眾健康意識的提高, 長期使用化學除草劑既有污染環境的風險, 也存在食品安全隱患[1-2]。研制廣譜、高效、低毒的生物除草劑既有重要性與必要性, 且迫在眉睫。

生物除草劑是指自然界中可用于除草的生物(包括微生物、植物和動物) 或其組織、代謝物的生物制劑[3-4]。自然界中的植物致病微生物 (真菌、細菌、病毒) 是開發生物除草劑的重要來源[5]。微生物發酵所得的活性產物包括病毒毒素、細菌毒素和真菌毒素等, 相關毒素具有特定或廣譜的抑草能力[6]。本研究前期發現, 枯草芽孢桿菌、膠凍樣類芽孢桿菌等系列微生物菌劑與發酵所得的代謝產物具有抑草能力, 現將發酵所得微生物菌劑施用于茶園以評價除草效果與對茶樹生理形態、生化指標、感官品質的影響。通過該研究希望能夠為生物除草劑研發提供思路, 并為茶葉領域應用做好基礎工作。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用微生物菌劑為枯草芽孢桿菌、膠凍樣類芽孢桿菌等系列微生物發酵所得。試劑包括沒食子酸、咖啡堿、兒茶素單體 (8 種)、氨基酸 (20種) 等, 均購于Sigma 公司; 乙腈、甲醇、乙酸為色譜純, 購于Aladdin 公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗條件與周期

本研究抑草效果試驗布置于浙江省農業科學院試驗基地 (120.21°E, 30.31°N), 茶葉生理生化與品質評價試驗布置于杭州茗竹生態農業有限公司茶葉基地 (119.87°E, 30.40°N)。將微生物菌劑稀釋為3 個組別, 分別是75 倍 (75 組)、150 倍(150 組)、300 倍 (300 組)。

抑草效果試驗: 菌劑稀釋液噴施于幼齡茶行間雜草植株上或土層表面, 每667 m2稀釋液施用量為40 L, 菌劑施用時間為2022 年6 月25 日, 試驗周期為7 d; 抑草效果與草銨膦對比, 草銨膦根據使用說明噴施相當的施用量。

茶葉生理指標與感官審評: 菌劑稀釋液噴施于成齡茶行間雜草植株或土層表面, 每667 m2稀釋液施用量為40 L, 菌劑施用時間為2022 年6 月25日, 茶樣取樣時間為2022 年9 月25 日; 對照組(CK) 為同區域未施用微生物菌劑的茶樹。

1.2.2 茶樹抑草效果鑒定

草銨膦與微生物菌劑噴施后, 分別于0、3、7 d 拍照取證, 觀察茶園雜草的枯萎和死亡狀況,并作對比。

1.2.3 茶樹生理指標

在茶樹鮮葉采摘前, 每個處理小區隨機取3 個點, 調查每個點 (33.3 cm×33.3 cm) 10 cm 葉層范圍內萌動芽以上的芽梢數。在茶園隨機取100 個一芽一葉, 稱重, 重復3 次, 取平均數記為百芽重。

1.2.4 茶樣制備

以綠茶固定樣制備法處理茶樣。所取茶樹新梢攤放4 h, 微波殺青1.5 min, 80 ℃烘干4 h (回潮2 次)。4 ℃冰箱儲存用于后續研究。

1.2.5 茶湯提取

稱0.150 0 g 干茶 (研磨至粉末), 加入25 mL的50%乙醇, 70 ℃浸提20 min, 隔5 min 搖一次。搖勻溶液轉入10 mL 離心管內, 5 000 r·min-1室溫離心10 min, 取上清液至新的10 mL 離心管,4 ℃儲存備用。

1.2.6 茶多酚總量測定

酒石酸亞鐵溶液配制: 稱取1 g (準確至0.000 1 g) 硫酸亞鐵, 5 g 酒石酸鉀鈉 (準確至0.000 1 g), 用水溶解并定容至1 L (低溫保存,有效期10 d)。

pH 值7.5 磷酸緩沖溶液配制: 稱取23.9 g 十二水磷酸氫二鈉, 加水溶解后定容至1 L 為1/15 mol·L-1磷酸氫二鈉溶液。稱取經110 ℃烘干2 h的磷酸二氫鉀9.08 g, 加水溶解后定容至1 L 為1/15 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液。取上述磷酸氫二鈉溶液85 mL 和磷酸二氫鉀15 mL 混合均勻。

準確取茶湯1 mL, 注入25 mL 的容量瓶中,加4 mL 水和5 mL 酒石酸亞鐵溶液, 充分混合, 再加pH 值7.5 的磷酸鹽緩沖液至刻度, 在波長540 nm 處, 以空白溶液作對照, 測定吸光度, 根據標準曲線進行計算。

1.2.7 游離氨基酸總量測定

取1/15 mol·L-1的磷酸氫二鈉溶液95 mL 和1/15 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液5 mL, 混勻為pH值8.0 的磷酸鹽緩沖液。

稱取水合茚三酮 (純度不低于99%) 2 g, 加50 mL 水和80 mg 二水氯化亞錫攪拌均勻。分次加少量水溶解, 放在暗處, 靜置24 h, 過濾后加水定容至100 mL 為2%茚三酮溶液。

稱取100 mg 茶氨酸或谷氨酸 (純度不低于99%) 溶于100 mL 水中, 作為母液, 準確吸取5 mL 母液, 加水定容至50 mL 作為工作液 (1 mL含茶氨酸或谷氨酸0.1 mg)。

分別吸取0、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 氨基酸工作液于一組25 mL 容量瓶中, 各加水4 mL、pH 值8.0 磷酸鹽緩沖液0.5 mL 和2% 茚三酮0.5 mL, 在沸水浴中加熱15 min, 冷卻后加水定容至25 mL。放置10 min 后, 在570 nm 處, 以試劑空白溶液作對照, 測定吸光度, 制作氨基酸標準曲線。

準確吸取茶湯1 mL, 注入25 mL 的容量瓶中,加0.5 mL pH 值8.0 的磷酸鹽緩沖液和0.5 mL 2%茚三酮溶液, 按上述步驟測定氨基酸含量。

1.2.8 兒茶素類及咖啡堿測定

使用HPLC (日本島津LC-20AD) 檢測兒茶素與生物堿組分。分析條件如下: 10 μL 進樣量, 流速1 mL·min-1, 安捷倫TC 4.6 mm×250 mm C18色譜柱, 35 ℃柱溫, 紫外檢測波長為280 nm; 流動相A 配比為乙腈∶乙酸∶水=3.0 ∶0.5 ∶96.5,流動相B 配比為乙腈∶乙酸∶水= 30.0 ∶0.5 ∶69.5; 梯度洗脫條件為35 min 內流動相B 從20%線性增加至65%。參照兒茶素及咖啡堿標準品的色譜行為, 對樣品中目標物質進行定性定量。

1.2.9 感官審評

采集各組別茶樣, 邀請國家評茶員參照GB/T 23776—2018 進行感官審評。取3.0 g 茶樣, 用150 mL 沸水沖泡5 min 后, 按外形 (25%)、湯色(10%)、香 氣 (25%)、滋 味 (30%) 及 葉 底(10%) 統計打分。

1.2.10 數據統計

各處理設置3 個重復, 使用SPSS 18 進行方差分析, 差異性用最小顯著差異法 (LSD) 分析,P<0.05 為顯著差異。

2 結果與分析

2.1 茶樹生理指標

2.1.1 抑草效果

試驗雜草對象為狼尾草, 稀釋75 倍 (75 組)與稀釋150 倍 (150 組) 的微生物菌劑均具有抑草效果, 且抑草效果與草銨膦相當; 稀釋300 倍(300 組) 的微生物菌劑的抑草效果弱于草銨膦。微生物菌劑噴施之后, 莖與葉片自3 d 起, 逐步發黃、枯萎; 7 d 時狼尾草地上部分死亡。幼齡茶苗未出現生理衰退現象, 莖干和葉片均正常生長, 且與對照組無差異 (圖1)。

圖1 微生物菌劑 (150 倍稀釋) 的抑草效果

2.1.2 發芽密度

成齡茶園以每個點 (33.3 cm × 33.3 cm)10 cm 葉層范圍內萌動芽以上的芽梢數為統計對象, 每組3 個點位。對照組茶樹發芽22.9 個, 75組茶樹發芽15.6 個, 150 組茶樹發芽24.6 個,300 組茶樹發芽25.5 個。75 組的發芽數為對照組的68.1%, 150 組和300 組的發芽數與對照組差異不顯著 (圖2)。

圖2 微生物菌劑對茶樹發芽的影響

2.1.3 百芽重 (一芽一葉)在茶園隨機取100 個一芽一葉, 稱重, 重復3次。對照組百芽重為22.33 g, 75 組百芽重為18.33 g, 150 組百芽重為20.67 g, 300 組百芽重為23.33 g。75 組的百芽重為對照組的82.1%, 150 組和300組的百芽重與對照組無顯著差異(圖3)。

圖3 微生物菌劑對茶樹百芽重的影響

2.2 茶葉生化檢測結果

2.2.1 茶多酚和氨基酸含量

對照組、75 組、150 組、300 組茶多酚含量分別為24.07%、21.91%、23.75%、24.44%; 對照組、75 組、150 組、300 組 氨 基 酸 含 量 分 別 為2.82%、3.16%、2.92%、2.78%。75 組的酚氨比最低 (表1)。

表1 茶多酚和氨基酸含量檢測結果

2.2.2 兒茶素類和咖啡堿含量

各組別兒茶素類和咖啡堿含量如表2, 其中75組表沒食子兒茶素、表兒茶素、表沒食子兒茶素沒食子酸酯、沒食子兒茶素沒食子酸酯、表兒茶素沒食子酸酯含量最低, 300 組咖啡堿含量最低。300組的兒茶素類與咖啡堿含量與對照組最接近, 75組的兒茶素類與對照組差異最明顯。

表2 兒茶素類和咖啡堿HPLC 含量 單位:%

2.3 茶葉審評

對各組別所制茶樣進行感官品質評價。其中,75 組的各項指標與總分均最高, 300 組的總分最低; 但對照組、150 組、300 組的總分差異不明顯(表3)。

表3 茶葉感官評價結果

3 結論

本試驗以微生物菌劑為試驗對象, 研究其對茶園雜草的抑草效果、茶樹生理狀態、生化指標和感官品質的影響。結果表明, 稀釋75 倍的微生物菌劑處理茶園, 使茶樹發芽密度降低31.9%、百芽重降低17.9%, 但具有降低茶多酚、提高氨基酸的作用, 且感官品質有所提高; 稀釋150 倍與稀釋300 倍的微生物菌劑處理茶園對茶樹發芽密度與百芽重影響總體不顯著, 且對茶葉茶多酚、氨基酸、感官品質影響總體不顯著。本研究初步探明以枯草芽孢桿菌、膠凍樣類芽孢桿菌等系列微生物發酵所得制劑, 具有茶園抑草效果, 且在150 倍或者更低原液濃度的稀釋條件下, 對茶樹生理生化與感官品質無影響。本研究涉及的技術有望推動微生物菌劑在茶園抑草中的應用。