絲素蛋白基藥物載體的應(yīng)用研究進(jìn)展

羅元澤, 戴夢(mèng)男, 李 蒙, 俞楊銷, 王建南,2

(1. 蘇州大學(xué) 紡織與服裝工程學(xué)院, 江蘇 蘇州 215123;2. 蘇州大學(xué) 紡織行業(yè)醫(yī)療健康用蠶絲制品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 江蘇 蘇州 215123)

家蠶絲(以下簡(jiǎn)稱蠶絲)是天然的蛋白質(zhì)纖維,作為紡織原料具有其它纖維無(wú)可比擬的優(yōu)越性。蠶絲是一種高純度蛋白質(zhì),是具有良好生物相容性和生物可降解性的生物聚合物,其中占比約75%的絲素蛋白可被制備成微球、水凝膠、管狀支架及多孔海綿等[1-3],已廣泛用于細(xì)胞外基質(zhì)、組織工程支架及藥物載體的研究。絲素蛋白藥物載體在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用開(kāi)發(fā)已成為國(guó)內(nèi)外研究者們極為關(guān)注的熱點(diǎn)。

隨著慢性非傳染性疾病,如癌癥、炎癥和糖尿病等發(fā)病率的不斷增加,利用可控釋放的載體進(jìn)行藥物遞送,可提高治療效果,也是最常用的治療手段。基于絲素蛋白大分子獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)及聚集態(tài)結(jié)構(gòu)特征,其在生物醫(yī)藥領(lǐng)域尤其作為藥物控釋載體的應(yīng)用,也是其它高分子無(wú)可比擬的。已有研究顯示,以絲素蛋白為載體的藥物釋放系統(tǒng)不僅可穩(wěn)定包裹各種小分子化合物[4],還可運(yùn)輸?shù)鞍踪|(zhì)[5]和核酸[6]等生物大分子,不僅能降低機(jī)體對(duì)藥物的降解作用,還能通過(guò)修飾進(jìn)行靶向給藥,從而提高生物利用度,因此,以絲素蛋白為代表的藥物遞送系統(tǒng)日益受到關(guān)注。本文綜述了以絲素蛋白為基材制備的藥物遞送載體的種類和制備方法,重點(diǎn)闡述了負(fù)載藥物的主要類型以及在生物醫(yī)藥領(lǐng)域應(yīng)用的最新研究進(jìn)展。

1 藥物遞送系統(tǒng)

藥物遞送系統(tǒng)通常是指在空間、時(shí)間和劑量等方面調(diào)控的基礎(chǔ)上,將藥物有效輸送至目的器官,從而增加藥物的利用效率,提高療效,降低成本,減少毒副作用,主要用于治療癌癥、炎癥等疾病[7-8]。關(guān)于藥物遞送技術(shù)最早的研究可追溯到19世紀(jì)50年代,醫(yī)生首次嘗試將藥物負(fù)載在膠囊中用于遞送。現(xiàn)代科學(xué)研究中,研究人員通過(guò)改變聚合物的物理化學(xué)性質(zhì)來(lái)響應(yīng)外界刺激,如pH值、活性氧、谷胱甘肽、酶、溫度和光等[9-11],達(dá)到藥物負(fù)載穩(wěn)定、延長(zhǎng)作用時(shí)間和向病變組織或器官靶向釋放的作用。

隨著醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展,藥物遞送材料開(kāi)始從合成材料向天然材料轉(zhuǎn)變,而其都應(yīng)具備可降解性。合成材料如聚乳酸[12]、聚乳酸-乙醇酸[13]等材料的藥物載體在病變部位降解后會(huì)釋放藥物,但負(fù)載親水性藥物時(shí)難以控制釋放速率,且降解后易殘留有機(jī)溶劑而危害人體健康。天然材料來(lái)源廣、毒性低且性能穩(wěn)定,具有良好的生物相容性和可降解性,降解后的產(chǎn)物對(duì)細(xì)胞無(wú)毒害作用,還能作為細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖及組織再生的營(yíng)養(yǎng)成分,如明膠[14]、殼聚糖[9]等,但這些材料存在提純工藝復(fù)雜、分子排列松散或制備不穩(wěn)定,以及體內(nèi)降解過(guò)快的缺陷。以上可降解性聚合物藥物載體也均不具備靶向性和特異性。另外,金屬材料也被廣泛用于藥物載體研究,其團(tuán)聚率小、清除率高、毒性較低,但生物降解性差仍是臨床試驗(yàn)中需要解決的主要難題[15]。目前,用于藥物遞送載體研究的材料主要有3類,其中天然材料主要有殼聚糖[9]、明膠[14]、多肽[16]、透明質(zhì)酸[17]、纖維素[18]、脂質(zhì)體[19]、淀粉[20]、膠原[21]、海藻酸鈉[22]和絲素蛋白[23]等;合成材料有聚乳酸[12]、聚乳酸-乙醇酸[13]、聚乙二醇[24]和聚己內(nèi)酯[25]等;金屬材料包括氧化鈰[15]、氧化鋅[26]等。

絲素蛋白大分子具有獨(dú)特而規(guī)整的化學(xué)結(jié)構(gòu),將其在合適的溶劑中自組裝可獲得降解可控、形態(tài)結(jié)構(gòu)和聚集態(tài)結(jié)構(gòu)可控的各種材料,因此是制備藥物控釋系統(tǒng)的理想原料,在生物醫(yī)藥領(lǐng)域受到了越來(lái)越多的關(guān)注,本文重點(diǎn)闡述絲素蛋白用于藥物遞送系統(tǒng)的最新研究進(jìn)展。

2 絲素蛋白

2.1 絲素蛋白的結(jié)構(gòu)

絲素蛋白來(lái)源于蠶絲的絲芯,包含重鏈(H鏈,約350 ku)、輕鏈(L鏈,約25 ku)和P25糖蛋白(約30 ku)3個(gè)亞單位,占蠶絲質(zhì)量的70%～80%。絲素蛋白由20種氨基酸組成,其中主要組成部分包括:親水性的絲氨酸和酪氨酸分別占12%和5%,疏水的甘氨酸和丙氨酸分別占46%和29%。重鏈和輕鏈由各自C末端的二硫鍵相互連接形成復(fù)合體,P25糖蛋白主要通過(guò)疏水相互作用與復(fù)合體相結(jié)合起穩(wěn)定作用。重鏈約占絲素蛋白分子質(zhì)量的92%[27],包含11個(gè)疏水結(jié)構(gòu)域,通過(guò)酰胺鍵的氫鍵作用形成穩(wěn)定的反平行β折疊結(jié)構(gòu),因此,絲素蛋白材料的性狀和性質(zhì)相對(duì)比較穩(wěn)定,其疏水氨基酸殘基可通過(guò)疏水相互作用和π-π堆積增強(qiáng)疏水性藥物的包封[28]。另外,絲素蛋白肽鏈上豐富的氨基和羧基經(jīng)過(guò)修飾后可賦予其靶向性[29],完成遞送后絲素蛋白在體內(nèi)降解為可溶性的氨基酸和肽段,在保留藥效的同時(shí)具備優(yōu)良的生物安全性,不會(huì)導(dǎo)致給藥部位引起炎癥反應(yīng)。再生絲素蛋白可自組裝為結(jié)晶高聚物,結(jié)晶形態(tài)主要包括Silk I和Silk II 2種,晶格中整齊緊密的鏈段排列可防止所包載藥物的突釋,延緩藥物釋放,降低突釋藥物對(duì)機(jī)體的毒性,延長(zhǎng)藥物功效,且可通過(guò)物理或者化學(xué)的方法對(duì)絲素蛋白的結(jié)晶形態(tài)和結(jié)晶程度加以調(diào)控,從而對(duì)其進(jìn)行精細(xì)的釋藥機(jī)制調(diào)控及靶向功能基修飾,尤其對(duì)于負(fù)載蛋白和基因這類易失活的藥物有著極其重要的研究意義。

2.2 絲素蛋白藥物遞送系統(tǒng)的制備方法

以絲素蛋白為原料開(kāi)發(fā)的多種形式的藥物遞送系統(tǒng)中,研究較為深入的主要有納微球[30]、水凝膠[2]和微針[31]。另外,絲素蛋白常用于合成高分子材料表面的涂層載藥修飾[32],或者制備成絲素蛋白膜[33]和多孔材料[34],通過(guò)負(fù)載藥物以提高其治療效果。圖1示出絲素蛋白用于藥物遞送的主要類型[31-32]。表1列舉了絲素蛋白用于藥物遞送載體的主要制備方法。

表1 絲素蛋白藥物載體的制備方法Tab. 1 Preparation methods of silk fibroin drug carriers

2.2.1 絲素蛋白納微球藥物載體

使用絲素蛋白納微球可繞過(guò)首過(guò)效應(yīng),減少藥物在胃腸壁和肝臟中的代謝,提高進(jìn)入體循環(huán)的藥量。將藥物包裹在納微球中還能有效避免體內(nèi)酶的降解,即使采用靜脈注射也不會(huì)造成血藥濃度的波動(dòng),從而提高藥物療效,主要用來(lái)治療癌癥。目前已報(bào)道的絲素蛋白納微球制備方法,包括自組裝法[30]、噴霧干燥法[35]和溶劑蒸發(fā)法[36]等,通過(guò)不同的制備方法可獲得粒徑不同的納微球,從而負(fù)載不同的藥物以及采用適合的臨床注射方式輸送藥物至病變部位。如采用噴霧干燥法制備的負(fù)載順鉑的絲素蛋白納微球,其粒徑大小可根據(jù)噴霧干燥器的參數(shù),如入口溫度、霧化流量和溶液進(jìn)料速率而調(diào)控,低進(jìn)料速率和高霧化流量可制備小于5 μm的納微球用于肺部給藥[35]。

2.2.2 絲素蛋白水凝膠藥物載體

絲素蛋白含有大量親水性基團(tuán),在氫鍵、靜電相互作用或誘導(dǎo)劑、剪切力作用下,形成具有穩(wěn)定三維空間網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的水凝膠,因其類似細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)和良好的生物相容性,可用來(lái)負(fù)載藥物、接種細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)以及修復(fù)缺損組織。常用的制備方法有超聲波法[37]、化學(xué)交聯(lián)法[2]和凍融法[38]等。另外,通過(guò)改變絲素蛋白溶液的濃度、交聯(lián)劑濃度、溫度和pH值等因素,可調(diào)控絲素蛋白結(jié)構(gòu)中無(wú)規(guī)卷曲和α-螺旋轉(zhuǎn)變成β-折疊的過(guò)程,從而調(diào)控凝膠轉(zhuǎn)變時(shí)間。高溫和高交聯(lián)劑濃度可有效縮短凝膠時(shí)間,有研究指出,當(dāng)絲素蛋白含量為70%、pH值為7.4時(shí),制備的水凝膠具有良好的力學(xué)強(qiáng)度和溶脹行為,牛血清白蛋白在該水凝膠中可穩(wěn)定釋放48 h且釋放量達(dá)(75.1±3.1)%[2]。

2.2.3 絲素蛋白微針?biāo)幬镙d體

微針由于其便捷的使用方式和穩(wěn)定的藥效,常被用于治療糖尿病。微針可減輕皮下注射引起的疼痛,將親脂量低的藥物從角質(zhì)層輸送到皮膚層,從而保護(hù)藥物不受胃腸道惡劣環(huán)境的影響。絲素蛋白用于開(kāi)發(fā)微針載藥也受到國(guó)內(nèi)外研究者們的極大關(guān)注。大多數(shù)釋藥微針存在易斷裂、載藥量低和藥物釋放速率不可控等缺點(diǎn),而絲素蛋白微針可通過(guò)改變后處理?xiàng)l件(如溫度、濕度和水蒸氣退火)來(lái)調(diào)控微針的力學(xué)強(qiáng)度和藥物釋放速率,如用水蒸氣退火處理8 h的微針與未處理的微針相比,藥物釋放速率降低了5.6倍,這種微針在有效保留藥物活性的同時(shí)還延長(zhǎng)了藥物在體內(nèi)的作用時(shí)間[39]。

2.2.4 絲素蛋白載藥膜及表面涂層和多孔材料

絲素蛋白膜、多孔材料和對(duì)其它材料的涂層改性在生物醫(yī)療領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用研究。其中絲素蛋白膜主要用于傷口敷料和藥物控釋。絲素蛋白膜作為藥物載體可提供良好的吸附和緩釋功能,如用溶液澆鑄法制備的絲素蛋白/羊毛角蛋白復(fù)合膜負(fù)載的雙氯芬酸鈉呈梯度釋放,隨著絲素蛋白含量的降低,藥物的釋放呈梯度增加,不同比例的絲素蛋白/羊毛角蛋白復(fù)合膜在釋放8 h后藥物釋放率最高可相差30%,這證明絲素蛋白具有優(yōu)異的緩釋性能[33]。絲素蛋白因其良好的生物相容性和可生物降解性,可對(duì)合成材料或不穩(wěn)定的藥物進(jìn)行涂層改性,主要用于酶和藥物的包封。通過(guò)改變絲素蛋白涂層的厚度和結(jié)晶度可實(shí)現(xiàn)對(duì)藥物釋放的精準(zhǔn)控制[23],有學(xué)者使用不同濃度的絲素蛋白涂層于負(fù)載鹽酸萬(wàn)古霉素的聚乳酸-乙醇酸微球上,0.1%絲素蛋白涂層的載藥微球有效緩解了突釋現(xiàn)象[32]。絲素蛋白多孔材料的三維多孔結(jié)構(gòu)可為藥物或生物因子的吸附和釋放提供充足空間,以利于促進(jìn)缺損組織再生與修復(fù)。如通過(guò)冷凍干燥法制備負(fù)載雷奈酸鍶的絲素蛋白/明膠復(fù)合氣凝膠多孔材料,該多孔材料在有效吸附和釋放藥物的同時(shí)有利于細(xì)胞黏附和增殖,刺激成骨細(xì)胞的成骨分化[34]。

3 絲素蛋白遞送系統(tǒng)的研究進(jìn)展

慢性疾病的有效治療不僅要持續(xù)釋放藥物,還要延長(zhǎng)血液中藥物的循環(huán)時(shí)間,減少給藥頻率,減弱藥物不良反應(yīng),提高患者的依從性。絲素蛋白藥物載體裝載技術(shù)可通過(guò)化學(xué)交聯(lián)[29]或表面包覆[47]等多種方式實(shí)施,其中有效載荷的原理主要是通過(guò)藥物與絲素蛋白大分子間的疏水相互作用或氫鍵作用,將藥物穩(wěn)定在絲素蛋白載體中。以絲素蛋白為載體的藥物遞送研究中,裝載的藥物主要是抗腫瘤藥物、抗菌消炎藥物以及蛋白類生物因子和基因(見(jiàn)圖2)。

3.1 絲素蛋白用于抗腫瘤藥物載體

常見(jiàn)的抗腫瘤藥物分為疏水性和親水性藥物,疏水性藥物包括姜黃素、喜樹(shù)堿和紫杉醇等,而親水性藥物包括阿霉素、吉西他濱和長(zhǎng)春新堿等[48-50]。

疏水性藥物姜黃素是一種來(lái)源于姜黃的天然多酚,具有良好的抗癌和抗炎特性,在體液中不穩(wěn)定且代謝較快。有研究指出絲素蛋白對(duì)疏水性藥物具有更優(yōu)的負(fù)載能力,如對(duì)絲素蛋白和絲素蛋白/殼聚糖2種納米顆粒負(fù)載姜黃素用于對(duì)抗乳腺癌細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn),絲素蛋白/殼聚糖納米顆粒的包封率小于純絲素蛋白納米顆粒的包覆率,這是因?yàn)闅ぞ厶堑挠H水性影響了對(duì)疏水性姜黃素的負(fù)載[7]。通過(guò)超臨界CO2工藝制備的絲素蛋白納米顆粒可提高姜黃素的溶解度,該納米顆粒的最高載藥率和包封率可達(dá)(12±0.62)%和(36±1.9)%[51]。改變絲素蛋白載體的pH值也是調(diào)節(jié)其載藥能力的一種手段。有研究認(rèn)為在低pH值下制備的絲素蛋白微球具有更好的化學(xué)和蛋白水解穩(wěn)定性,以及更持久的藥物釋放性能,當(dāng)pH值為3.6時(shí)可獲得約為60%的包封率(姜黃素),這歸因于姜黃素可通過(guò)疏水相互作用和絲素蛋白在等電點(diǎn)附近形成更多的β折疊結(jié)構(gòu)[28]。另外,研究人員將納米二氧化硅與絲素蛋白復(fù)合制備的微膠囊對(duì)姜黃素的包封率高達(dá)95%,復(fù)合微膠囊的體外藥物釋放持續(xù)時(shí)間比純絲素蛋白微膠囊長(zhǎng),且可通過(guò)調(diào)整絲素蛋白的含量來(lái)調(diào)節(jié)藥物釋放速率,這是由于納米二氧化硅和絲素蛋白之間的強(qiáng)靜電相互作用,使得復(fù)合微膠囊的外殼孔隙更少且更加致密,從而延緩了姜黃素通過(guò)殼基質(zhì)的擴(kuò)散(見(jiàn)圖3)[4]。最近有研究報(bào)道了在絲素蛋白裝載姜黃素的納米顆粒表面進(jìn)行環(huán)五肽(cRGD)修飾來(lái)實(shí)現(xiàn)靶向給藥,結(jié)果顯示人膀胱腫瘤細(xì)胞對(duì)cRGD功能化的絲素蛋白/姜黃素納米顆粒的攝取能力比未功能化的絲素蛋白載藥納米顆粒有顯著提高,這是因?yàn)?cRGD對(duì)整合素αvβ3和αvβ5具有高親和力,而這2種整合素在腫瘤細(xì)胞上被過(guò)度表達(dá),腫瘤細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)的整合素αvβ3和αvβ5會(huì)主動(dòng)識(shí)別cRGD功能化后的絲素蛋白載藥納米顆粒。這種靶向藥物載體可有效提高癌癥類重大疾病的治療效率并保護(hù)正常細(xì)胞[29]。

圖3 二氧化硅納米粒子穩(wěn)定的乳狀液和絲素蛋白微膠囊的形成過(guò)程及其在輸送系統(tǒng)中的應(yīng)用示意圖Fig. 3 Schematic of process for formation of pickering emulsions and silk microcapsules and their applications in delivery systems

親水性藥物代表阿霉素是一種周期非特異性藥物,對(duì)各種生長(zhǎng)周期的腫瘤細(xì)胞都有殺滅作用。有學(xué)者嘗試制備負(fù)載阿霉素的絲素蛋白納米顆粒,當(dāng)阿霉素與絲素蛋白的質(zhì)量比為1∶24時(shí),納米顆粒對(duì)阿霉素的包封率高達(dá)95%[48],該納米顆粒可有效作用于溶酶體營(yíng)養(yǎng)型抗癌納米藥物并克服多藥耐藥性,但缺乏腫瘤靶向能力且藥物療效較低。研究發(fā)現(xiàn)將葉酸偶聯(lián)于絲素蛋白制備的絲素蛋白/葉酸納米載體提高了被乳腺癌細(xì)胞攝取的能力,從而實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向性[52]。葉酸是細(xì)胞合成核苷酸的必要營(yíng)養(yǎng)物,葉酸受體可在正常細(xì)胞上低表達(dá)而在腫瘤細(xì)胞上過(guò)表達(dá),因此可利用這個(gè)生物學(xué)原理制備納米載體用來(lái)靶向給藥、提高治療效率[53]。使用化學(xué)交聯(lián)法制備的藥物載體容易殘留少許有機(jī)溶劑,對(duì)人體健康存在影響,而使用磁性靶向法可不對(duì)載體進(jìn)行化學(xué)修飾,不涉及有機(jī)溶劑,是一種具有生物安全性的藥物載體靶向性改性手段。如采用鹽析法制備的氧化鐵/絲素蛋白微球負(fù)載阿霉素,其載藥量為3.3%,藥物包封率為76%,氧化鐵/絲素蛋白微球被人宮頸腫瘤細(xì)胞顯著內(nèi)吞,并會(huì)選擇性地積聚在人宮頸腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中,起到靶向治療的作用[42]。在最近的一項(xiàng)研究中,學(xué)者結(jié)合光療和化療制備了一種負(fù)載光敏劑和阿霉素的透明質(zhì)酸/絲素蛋白納米粒子,由于透明質(zhì)酸可被癌細(xì)胞高表達(dá)的糖蛋白CD44所結(jié)合,因此該載藥粒子可被腫瘤細(xì)胞特異性內(nèi)化,促進(jìn)藥物在靶細(xì)胞中的積累。研究指出該載藥粒子的藥物釋放機(jī)制動(dòng)力來(lái)自多個(gè)路徑:絲素蛋白載藥納米顆粒的透明質(zhì)酸層在透明質(zhì)酸酶的作用下降解,從而暴露內(nèi)部結(jié)構(gòu)釋放藥物;光敏劑吸收近紅外光后會(huì)引起高熱或產(chǎn)生細(xì)胞毒性單線態(tài)氧或其它活性氧,高熱使得分子間運(yùn)動(dòng)加劇從而讓藥物從內(nèi)部擴(kuò)散;而藥物還有依賴活性氧濃度釋放的特性等,因此該納米顆粒在腫瘤微環(huán)境中可通過(guò)多個(gè)途徑響應(yīng)性釋放抗腫瘤藥物,以提高治療效果[11]。

3.2 絲素蛋白用于抗菌消炎藥物載體

阿司匹林是一種常見(jiàn)的抗菌消炎藥物,被廣泛應(yīng)用于疾病的治療中。通過(guò)微球包裹阿司匹林可有效提高藥物利用率,從而減小對(duì)患者的胃部刺激,有學(xué)者制備了包裹阿司匹林的絲素蛋白微球,微球的載藥率為6.15%,包封率為67.66%,實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明負(fù)載藥物的絲素蛋白微球可在腸道中緩慢釋放[8]。通過(guò)靜電紡絲也可加載藥物,如靜電紡絲法制備的負(fù)載阿司匹林的聚乳酸/絲素蛋白復(fù)合納米纖維膜,隨著負(fù)載阿司匹林含量的增加,納米纖維的直徑減小,比表面積增大,藥物釋放速率增加。這種復(fù)合納米纖維中當(dāng)聚乳酸與絲素蛋白的質(zhì)量比為8∶3時(shí),藥物釋放速率達(dá)到最大[47],而且阿司匹林在發(fā)揮抗菌消炎作用的同時(shí)賦予了復(fù)合纖維抗凝血效果,也成為用于研發(fā)藥物洗脫支架的潛在候選物。另外,一項(xiàng)研究指出,生物活性玻璃的摻入有助于提高藥物的加載率和釋放率,采用溶膠-凝膠法制備的生物活性玻璃/絲素蛋白復(fù)合支架進(jìn)行載藥實(shí)驗(yàn),復(fù)合支架中阿司匹林的加載率顯著高于純絲素蛋白支架;在體外釋放實(shí)驗(yàn)中,3 d后復(fù)合支架釋放的阿司匹林也顯示出比純絲素蛋白支架更好的釋放率[54]。

3.3 絲素蛋白用于蛋白類藥物的載體

大量研究表明,絲素蛋白載體對(duì)負(fù)載的蛋白質(zhì)如生長(zhǎng)因子和生物酶有穩(wěn)定作用,加上絲素蛋白與這類生物因子同屬蛋白質(zhì),彼此相容,使其即使在高溫和高濕等極端條件下也能保持生物活性和結(jié)構(gòu)完整性。現(xiàn)有這類載體研究中涉及的生長(zhǎng)因子如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、類胰島素生長(zhǎng)因子[36]和血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子[55],主要功能是刺激相應(yīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化。關(guān)于生物酶如過(guò)氧化物酶[56]和L-天冬酰胺酶[57]能起到催化、合成抗生素以及抗腫瘤作用,使用絲素蛋白作為載體可克服它們半衰期短、穩(wěn)定性差和組織滲透有限的缺點(diǎn)。

3.3.1 絲素蛋白用于生長(zhǎng)因子載體

骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(rhBMP-2)可誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨和軟骨分化,胰島素樣生長(zhǎng)因子1(rhIGF-1)具有促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)的作用,有學(xué)者分別使用溶劑蒸發(fā)法和冷凍干燥法制備了聚乳酸-乙醇酸微球和絲素蛋白微球,2種微球單一負(fù)載或同時(shí)負(fù)載rhBMP-2和rhIGF-1這2種生長(zhǎng)因子,然后加入藻酸鹽和絲素蛋白溶液制備藻酸鹽支架和絲素蛋白支架。在藻酸鹽支架中,人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化能力,主要發(fā)生在負(fù)載rhBMP-2和同時(shí)負(fù)載rhBMP-2和rhIGF-1的絲素蛋白微球的支架中,而裝有相同載藥的聚乳酸-乙醇酸微球的藻酸鹽支架沒(méi)有明顯的成骨分化效果,這是由于rhBMP-2會(huì)在聚乳酸-乙醇酸微球降解后產(chǎn)生的酸性微環(huán)境中失活。另一組研究中,絲素蛋白支架裝有含2種生長(zhǎng)因子rhBMP-2和rhIGF-1的絲素蛋白微球時(shí),誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞軟骨分化的效果優(yōu)于裝載單一生長(zhǎng)因子rhBMP-2的絲素蛋白微球,這是因?yàn)閞hIGF-1增強(qiáng)了rhBMP-2誘導(dǎo)軟骨分化的效果,而在藻酸鹽支架中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)這種增強(qiáng)效果,是因?yàn)閞hIGF-1在絲素蛋白支架中的有效作用量多于藻酸鹽支架。這種將絲素蛋白微球和支架相結(jié)合的方法為遞送生長(zhǎng)因子提供了新的思路[36]。

血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子具有促進(jìn)新血管生成、骨更新、成骨細(xì)胞遷移和礦化等功能,有研究結(jié)合冷凍干燥法和靜電紡絲法,制備用于遞送血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的絲素蛋白/磷酸鈣/PLGA復(fù)合支架,這種生長(zhǎng)因子可在28 d內(nèi)持續(xù)釋放且生物活性保持在83%左右[55]。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子在刺激細(xì)胞增殖方面起關(guān)鍵作用,將此生長(zhǎng)因子負(fù)載于絲素蛋白微球中,研究發(fā)現(xiàn)在微球表面培養(yǎng)的L929細(xì)胞可充分鋪展,并產(chǎn)生膠原樣纖維基質(zhì),與純絲素蛋白微球相比,負(fù)載堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的絲素蛋白微球可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖[40]。

3.3.2 絲素蛋白用于酶載體

使用絲素蛋白作為酶的載體,是延長(zhǎng)酶發(fā)揮功能、保持活性并提高其環(huán)境穩(wěn)定性的一種重要手段。葡萄糖氧化酶最早是固定在絲素蛋白膜中開(kāi)展研究的,將3.71×10-3U的葡萄糖氧化酶固定在1.1 mg(干態(tài)質(zhì)量)的絲素蛋白膜中,60 ℃下加熱20 min后其活性產(chǎn)率仍高達(dá)98.7%[10]。之后有學(xué)者以脂質(zhì)體為模板制備負(fù)載過(guò)氧化物酶的絲素蛋白微球,再分別使用甲醇和氯化鈉處理除去脂質(zhì),獲得具有多層結(jié)構(gòu)的微球,這種微球顯著提高了過(guò)氧化物酶的負(fù)載能力[56]。然而該方法制備的微球形態(tài)不均且尺寸較大,為克服該缺點(diǎn),有學(xué)者采用丙酮沉淀法制備載有L-天冬酰胺酶的具有良好球形形態(tài)的絲素蛋白納米顆粒,該納米顆粒直徑最小可達(dá)50 nm,且酶活性回收率高達(dá)90%,對(duì)胰蛋白酶降解的抵抗也極大增加,在血清中穩(wěn)定性良好[57]。還有研究者在制備的絲素蛋白/四氧化三鐵微球表面通過(guò)光化學(xué)交聯(lián)法共價(jià)結(jié)合酵母溶壁酶,結(jié)果顯示,加載量為100 mg/g時(shí),酵母溶壁酶在微球表面的固定化效率幾乎為100%,與游離酶相比,固定化酶在最適pH值為7.5時(shí)可保持游離酶84%的活性;當(dāng)pH值為4時(shí)游離酶喪失活性,而固定化酶仍可保持游離酶初始活性的81%。固定化酶可在較寬泛的pH值范圍內(nèi)保持良好的活性,因此,這種微球在固定酶方面具有良好的應(yīng)用前景[58]。

另外,絲素蛋白海綿和水凝膠也被研究用于裝載生物酶,有研究采用絲素蛋白海綿遞送凝血因子纖維蛋白原和凝血酶來(lái)控制出血,體外實(shí)驗(yàn)顯示,在凝血酶的誘導(dǎo)作用下,凝血因子纖維蛋白原填充了絲素蛋白海綿的孔隙,形成致密的纖維狀蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò),預(yù)示這種材料具備優(yōu)異的止血能力[59]。最近有研究以絲素蛋白為原料,通過(guò)酶促交聯(lián)法制備同時(shí)負(fù)載血紅蛋白和葡萄糖氧化酶的水凝膠。通過(guò)調(diào)節(jié)絲素蛋白和葡萄糖氧化酶的濃度可控制水凝膠的力學(xué)強(qiáng)度和凝膠時(shí)間。與游離酶相比,絲素蛋白上的酪氨酸單元在氧化過(guò)程中穩(wěn)定了血紅蛋白的結(jié)構(gòu),因此,固定化酶顯示出更高的生物催化效率。該研究團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步建立全層皮膚缺損的大鼠模型,評(píng)估了載酶水凝膠的傷口愈合能力,14 d后純絲素蛋白水凝膠的傷口愈合率為75.6%,而載酶水凝膠達(dá)92.3%,可見(jiàn)此載酶水凝膠在止血和促進(jìn)傷口愈合方面極具潛力[5]。

3.4 絲素蛋白用于基因藥物的載體

基因輸送是將遺傳物質(zhì)如質(zhì)粒DNA[60]、siRNA[6]等輸送到細(xì)胞,以取代、調(diào)節(jié)或表達(dá)細(xì)胞功能所需的基因或生物因子。絲素蛋白因其對(duì)細(xì)胞有良好的親和性、組織相容性和抗DNA酶作用等優(yōu)點(diǎn),被認(rèn)為是一種有潛力的基因遞送載體。目前已有較多研究顯示,應(yīng)用絲素蛋白納米顆粒來(lái)遞送基因效果顯著。有學(xué)者應(yīng)用基因工程技術(shù)合成了含聚賴氨酸和RGD序列的重組絲素蛋白,將其制備成負(fù)載編碼熒光素酶的質(zhì)粒DNA的納米顆粒。當(dāng)重組絲素蛋白與DNA的氮磷比超過(guò)1∶2時(shí),顆粒可有效包裝、壓縮DNA,當(dāng)?shù)妆葹?∶1時(shí),制備的納米顆粒轉(zhuǎn)染人宮頸腫瘤細(xì)胞的效率最佳,這種載體的轉(zhuǎn)染效率依賴于RGD基序的數(shù)量[60]。

聚乙烯亞胺是一種陽(yáng)離子聚合物,通常用作非病毒基因載體,被認(rèn)為是基因轉(zhuǎn)染的黃金標(biāo)準(zhǔn),但其高密度的陽(yáng)離子基團(tuán)對(duì)細(xì)胞有一定毒性。為解決其細(xì)胞毒性問(wèn)題,有研究將絲素蛋白和聚乙烯亞胺通過(guò)靜電相互作用結(jié)合,制備負(fù)載編碼內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血管生成素-1質(zhì)粒DNA的納米顆粒。結(jié)合絲素蛋白后其屏蔽了聚乙烯亞胺過(guò)多的正電荷,該納米顆粒與聚乙烯亞胺/DNA納米顆粒相比,明顯降低了對(duì)小鼠成纖維細(xì)胞的毒性作用[61]。同樣的研究將聚乙烯亞胺/編碼綠色熒光蛋白的質(zhì)粒DNA用絲素蛋白納米顆粒包被,與聚乙烯亞胺/DNA納米顆粒相比,加入絲素蛋白后有效降低了人胚胎腎細(xì)胞和人結(jié)腸腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒性,提高了轉(zhuǎn)染效率,并使目的基因有效獲得表達(dá)[62]。還有研究利用磁性靶向載體來(lái)遞送DNA,如使用鹽析法制備磁性和非磁性絲素蛋白/聚乙烯亞胺核殼納米顆粒,用于遞送c-myc反義寡脫氧核苷酸,轉(zhuǎn)染MDA-MB-231乳腺腫瘤細(xì)胞后,與非磁性納米顆粒相比,磁性納米顆粒在20 min內(nèi)通過(guò)磁感應(yīng)攝取的c-myc反義寡脫氧核苷酸要高出70%,更顯著抑制了腫瘤細(xì)胞增長(zhǎng)[63]。

絲素蛋白微球也可用于疫苗的加載研究,如使用乳化交聯(lián)法制備的負(fù)載傳染性法氏囊病病毒DNA疫苗的絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合微球,其疫苗加載率為89.14%,將疫苗注入感染傳染性法氏囊病病毒的雞體內(nèi),2周后對(duì)雞血清的病毒抗體檢測(cè)結(jié)果顯示,相比于殼聚糖載藥微球,絲素蛋白/殼聚糖復(fù)合載藥微球注入后的體內(nèi)抗體水平更高,這是由于絲素蛋白具有非特異性免疫促進(jìn)作用[64]。

除使用顆粒狀載體外,還有學(xué)者將攜帶內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子和血管生成素-1雙基因共表達(dá)的腺病毒載體裝載于絲素蛋白多孔支架,用于Sprague Dawley(SD)大鼠全層皮膚缺損修復(fù),該支架能促進(jìn)皮膚缺損創(chuàng)面血管網(wǎng)絡(luò)的快速形成和細(xì)胞外基質(zhì)的重建[65]。經(jīng)皮免疫是將負(fù)載疫苗的貼劑貼于皮膚誘導(dǎo)產(chǎn)生全身免疫反應(yīng)的方法。有研究將含有mRNA或siRNA的醇質(zhì)體微球通過(guò)噴霧干燥法結(jié)合到再生絲素蛋白纖維的表面,制備載有mRNA疫苗(TCIP)和抗PDL1的siRNA(TDSP)的透皮貼劑,以小鼠黑色素瘤為模型進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn),即在小鼠皮膚上貼TCIP(進(jìn)行預(yù)防)后注射腫瘤細(xì)胞,然后定期貼TDSP進(jìn)行治療,這種聯(lián)合療法顯著抑制了腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng),說(shuō)明該貼劑可將核酸有效遞送到皮膚深層,且比單一使用TCIP或TDSP貼劑的治療效果更好[6]。新冠病毒已肆虐全球,使用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)可及時(shí)識(shí)別和診斷患者是否感染病毒,并從滅活的全病毒中開(kāi)發(fā)的RNA可作為陽(yáng)性對(duì)照來(lái)驗(yàn)證RT-PCR的結(jié)果,但由于RNA不穩(wěn)定,需進(jìn)行冷鏈儲(chǔ)存和運(yùn)輸以維持其完整性和活性,如能將其穩(wěn)定包埋并常溫運(yùn)輸則意義重大。有研究報(bào)道了新型冠狀病毒RNA在絲素蛋白膜中的穩(wěn)定性,與保存在無(wú)核酸酶的水中相比,絲素蛋白膜在室溫下可將新型冠狀病毒RNA穩(wěn)定保存超過(guò)21周,并驗(yàn)證了RT-PCR檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性,這對(duì)替代冷鏈運(yùn)輸RNA的方法更加簡(jiǎn)單方便是有研究?jī)r(jià)值的[66]。

4 結(jié)束語(yǔ)

隨著對(duì)絲素蛋白生物學(xué)功能的不斷發(fā)掘,在載藥形式、靶向治療以及提高藥物利用率方面已經(jīng)取得了一定的應(yīng)用研究成果。絲素蛋白除以單一材料制備成納微球、水凝膠和微針等藥物控釋載體外,還可與其它功能材料或生物因子,如納米二氧化硅、生物玻璃等復(fù)合,實(shí)現(xiàn)靶向和特異性釋藥等功能。絲素蛋白良好的生物相容性可克服許多藥物穩(wěn)定性差、半衰期短的缺點(diǎn),起到延長(zhǎng)藥效、提高藥物利用率的作用,這在生物醫(yī)藥領(lǐng)域意義重大。

雖然絲素蛋白擁有其它材料難以企及的優(yōu)異性能,但仍有不少缺點(diǎn)值得注意,例如絲素蛋白的來(lái)源和質(zhì)量不同,需要標(biāo)準(zhǔn)化提取與限定。雖然通過(guò)物理或化學(xué)修飾可賦予絲素蛋白靶向遞送藥物或功能因子的能力,但在進(jìn)入體內(nèi)后可能會(huì)受到免疫系統(tǒng)的攻擊(尤其在初期),以及藥物在循環(huán)系統(tǒng)運(yùn)行中可能提前釋放或載體瓦解,從而導(dǎo)致靶向釋藥失敗。目前關(guān)于絲素蛋白藥物遞送系統(tǒng)在臨床上的應(yīng)用還未實(shí)施,其精確性和有效性還需要長(zhǎng)期探索和臨床試驗(yàn)。隨著材料、化學(xué)科學(xué)和藥學(xué)的發(fā)展,生物相容性優(yōu)異的絲素蛋白作為藥物遞送系統(tǒng)的研發(fā)必會(huì)進(jìn)一步走向成熟和應(yīng)用。