核桃樹葉基質化的酸堿前處理與發酵工藝研究

王應梅， 王艷壯， 李瑩杰， 李燕， 何苗， 王曉璟， 杜紅斌

（1.塔里木大學園藝與林學學院，南疆設施農業兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300；2.四川省巴中市通江縣農業信息服務中心，四川 巴中 636700）

核桃是新疆主導產業之一，種植面積由2003 年 的9.8 萬hm2增 至2016 年 的35 萬hm2[1]，到2019 年，南疆四地州核桃栽培面積達到38.29 萬hm2[2]，栽培面積較大，且仍在持續增長中。同時，核桃葉為羽狀復葉，葉面積較大，且數量多，形成了豐富的核桃樹葉資源。為防止病蟲害等危害，一般都會將核桃落葉清理出園，隨后進行焚燒或填埋，既造成了極大的資源浪費，又污染了環境。新疆地處內陸，基質運輸成本較高，而將核桃樹葉進行發酵腐熟為基質，不僅能解決南疆地區基質需求，降低基質成本，還能促進核桃樹葉資源的利用。

堆腐發酵是有機材料基質化的常規方式，在發酵前，通常會采用一定的前處理方式調節材料性質，促進其分解發酵。柴艷芳[3]研究發現，添加松樹皮干質量0.4%~0.8%的石灰預處理1 周可以促進松樹皮的發酵。郭程程[4]采用硫酸對木耳菌糠進行酸預處理，發現合理濃度的酸預處理有利于菇渣腐熟基質性質的提高。在樹葉的處理上，姚文英[5]研究發現，采用2%（體積分數）的草酸浸泡5 mm 粒徑樹葉0.5 h，其pH 和電導率（electrical conductivity，EC）均有所降低，陳廣銀等[6]采用不同含量的石灰水噴淋粉碎后過2 cm 篩的樹葉，發現采用4.0%（質量分數）石灰預處理效果最佳。植物葉片表面都存在一層蠟質，在一定程度上會阻礙樹葉的發酵分解。這層蠟質大多由長鏈脂肪酸(C>18)及其衍生而來的醛、醇、烷、酮、酯以及一些三萜類化合物和小分子次生代謝產物構成[7]，這些物質大部分可以與酸堿溶液發生反應，由此說明采用酸堿溶液對樹葉進行前處理切實可行。在物料的基質化過程中，為促進堆腐發酵過程中微生物活動、調節發酵后基質性質等，通常會添加一些發酵輔助物質，如竹酢液、過磷酸鈣、沸石、發酵輔助酶等。張璐[8]研究發現，鼠李糖脂有利于微生物活動，能更好地促進園林廢棄物的堆腐發酵。

目前，以樹葉為材料開發基質的研究相對較少，將核桃樹葉研制為基質的報道更為鮮見，因此本研究通過對核桃樹葉進行前處理和堆腐發酵研究，探索核桃樹葉基質的研制方法，以期為核桃樹葉基質化提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及來源

核桃樹葉收集于塔里木大學園藝試驗站核桃資源圃和新疆阿拉爾市十二團核桃園，采用5 mm篩孔的粉碎機打碎。發酵菌劑為嗜熱性側孢霉（Thermophilic sporotrichum）購自新疆塔克藍生物科技有限責任公司。玉米粉（用于菌劑擴繁）購自當地糧油超市。發酵添加劑為鼠李糖脂（棕色液體，純度80%，質量濃度60 g·L-1），購自西安瑞捷生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 核桃樹葉酸堿前處理 分別設置體積分數為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0% 的草酸（C1~C6）和體積分數為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%的氨水（N1~N6）處理0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h（H1~H5），即酸堿處理各30個。

核桃樹葉前處理方法：將粉碎的核桃樹葉放入大水桶中，加等體積自來水浸泡1 d后撈出控水（不滴水）[9]；然后分別加入等體積的不同處理溶液，按照預設時長進行處理；最后控干處理液，用等體積自來水漂洗干凈，烘干后用于核桃樹葉理化性質的測定。

1.2.2 核桃樹葉堆腐發酵 核桃樹葉堆腐發酵試驗于2021 年6—8 月在新疆阿拉爾市十團果色甜香果蔬農民專業合作社進行。試驗共設置9 個處理，詳見表1。鼠李糖脂添加量以粉碎后的干核桃樹葉質量計算。將進行氨水前處理的核桃樹葉（A 組）與未進行氨水前處理的核桃樹葉（B 組）分別建堆，堆體呈近圓錐形，高約0.8 m，直徑約1.6 m。將發酵菌劑（菌劑添加量為0.1%，以粉碎后的干核桃樹葉質量計算）與玉米粉混合，按量取鼠李糖脂融入水中稀釋，翻拌時均勻灑入菌劑并噴淋稀釋的鼠李糖脂溶液，使核桃樹葉、菌劑、鼠李糖脂混合均勻，最后控制堆體濕度在60%左右，覆膜發酵。每天測定發酵堆和外界的溫度，適時翻堆，補充水分。每次翻堆混勻后取樣，用于測定核桃樹葉發酵過程中碳氮質量比（C/N）、pH、電導率（electrical conductivity，EC）及胡敏酸（humic acid，HA）、富里酸含量（fulvic acid，FA）。發酵結束后，取樣檢測基質重金屬及潛在毒害元素鈉（Na）、氯（Cl）含量，并進行種子發芽試驗，檢驗基質安全性。

表1 核桃樹葉發酵處理Table 1 Walnut leaves fermentation treatments

1.3 測定指標及方法

1.3.1 容重、孔隙度、pH、EC 值和發酵溫度的測定 參照王應梅等[10]的方法測定容重、孔隙度、pH 和EC。采用北京凱安達儀器儀表有限公司生產的多通道溫度測定儀和電阻式電子數顯溫度計測定發酵溫度，分別于每日10:00 和20:00 測定發酵堆體溫度和環境溫度。

1.3.2 胡敏酸、富里酸、有機碳、全氮、重金屬和潛在毒害元素含量測定 胡敏酸（HA）、富里酸（FA）、全氮、重金屬和潛在毒害元素（鈉、氯）含量送樣于南京瑞源生物技術有限公司進行測定。有機碳含量參照標準HJ 761—2015[11]，采用灼燒減量法測定。有機碳含量和全氮含量的比值即為C/N。

1.3.3 種子發芽指數的測定 種子發芽指數（germination index，GI）參考白永娟[12]的方法，取風干樣5 g，加100 mL 蒸餾水在37 ℃條件下震蕩提取30 mim，過濾后取 9 mL濾液于鋪有濾紙的培養皿中，加入30 粒小白菜種子，放入25 ℃恒溫培養箱中培養24 h，統計發芽率并測定胚根長，以蒸餾水處理作為對照，每個處理重復6次。

1.4 數據整理與分析

采用Microsoft Office Excel 2019 進行試驗數據的整理與圖表制作，采用DPS7.05 對數據進行方差分析。通過灰色關聯度法對不同酸堿前處理后核桃樹葉理化指標進行綜合分析排序。灰色關聯度分析依據鄧聚龍[13]提出的灰色系統理論原理，將30 個草酸前處理的7 個核桃樹葉理化指標看成同一個灰色系統，30 個氨水前處理的7 個核桃樹葉理化指標看成另一個灰色系統，每個處理方法或理化指標為該系統中的1 個因素，參考楊澤敏等[14]的方法計算系統中各因素間的聯系程度。理想處理方法的設定綜合考慮蔬菜育苗基質標準[15]要求及有機物質發酵微生物生長適宜酸堿條件，分別取容重、氣水的體積比、pH、總孔隙度、通氣孔隙度和持水孔隙度最大值和EC 最小值夠成理想處理，采用變異系數法確定權重。

2 結果與分析

2.1 核桃樹葉酸堿前處理條件探究

2.1.1 酸溶液前處理條件探究 根據灰色關聯度分析原理，關聯度大的處理與理想處理接近程度大。由表2可知，等權關聯度排序前3位的草酸處理分別為C2H1、C2H2、C1H5；計算加權關聯度后，排序結果前3 位仍為C2H1、C2H2、C1H5處理，加權關聯度最大，同樣為C2H1處理。由此說明C2H1處理的綜合理化性質最好，即核桃樹葉采用1%草酸溶液處理0.5 h較為適宜。

表2 不同前處理核桃樹葉理化指標灰色關聯度排序Table 2 Ranking of correlation degree on physical and chemical indexes of walnut leaves treated by different pretreatment

2.1.2 堿溶液前處理條件探究 從表3 中可以看出， N3H2處理的等權關聯度最大，N1H4處理加權關聯度最大。但前處理對核桃樹葉各個理化指標的影響程度不同，需要根據加權排序結果篩選最佳處理，因此氨水處理核桃樹葉采用0.5%溶液處理2 h較好（N1H4）。

表3 不同水平氨水溶液及時長處理核桃樹葉理化指標灰色關聯度Table 3 Correlation degree of physical and chemical indexes of walnut leaves treated by different concentration of hartshorn and different duration

2.1.3 酸、堿溶液前處理對比 由灰色關聯度分析篩選得出草酸適宜前處理條件為1%溶液處理0.5 h；氨水適宜前處理條件為0.5%溶液處理2 h。對比草酸和氨水最優處理條件下核桃樹葉的理化性質（表4）發現，容重、孔隙度、EC等差異較小，而氨水處理后的pH 為6.61，草酸處理后的pH 為3.09。由于嗜熱性側孢霉的適宜pH 為4~8[16]，因此，氨水處理后的pH 更為適宜核桃樹葉發酵，0.5%氨水處理2 h為核桃葉前處理的最優選擇。

表4 草酸、氨水最優處理條件下核桃樹葉理化性質Table 4 Physicochemical properties of walnut leaves treated with oxalic acid and ammonia

2.2 核桃樹葉堆腐發酵

2.2.1 發酵過程中堆體溫度變化 由圖1 可知，發酵過程中堆體溫度明顯高于外界氣溫。上午堆體溫度為32.85~54.25 ℃，下午為35.63~62.28 ℃，最高溫度達62.28 ℃。建堆發酵后，堆體溫度快速上升，2 d后溫度達到最高，而后由于氧氣的消耗，溫度逐漸降低，7 月5 日翻堆后溫度又開始上升。除翻堆使溫度變化較大外，氣溫對發酵堆體溫度的影響也較大，7月12日—23日和8月14日—16日多陰雨天氣，因此堆體溫度相對較低。前期堆體的溫度變化相對滯后于氣溫變化，后期與氣溫變化同步。在9個發酵處理中，A3處理溫度最高，B9處理溫度最低；且A 組處理溫度略高于B 組處理，說明經過氨水前處理后添加0.3%的鼠李糖脂（A3）有利于核桃樹葉發酵堆體溫度的提高。

圖1 不同發酵處理堆體溫度及氣溫變化Fig. 1 Changes of heap temperature and temperature under different fermentation treatments

2.2.2 發酵過程中堆體pH、電導率變化 由圖2可知，堆體pH隨著發酵時間的延長逐漸升高，前期各處理的上升速度存在差異，但發酵結束時pH均為8.0左右，說明是否進行氨水前處理和添加鼠李糖脂對核桃樹葉堆腐后pH影響較小。對于進行過氨水前處理的A 組，其堆體電導率（EC）在發酵第1周迅速降低，而在隨后發酵過程中基本穩定不變，不同鼠李糖脂添加量處理間差異較小，說明氨水前處理有利于堆體EC的降低；而經過氨水處理后，鼠李糖脂對核桃樹葉發酵過程中堆體EC 的影響較小。對于未進行前處理的B 組，其堆體EC 隨著發酵時間的延長呈上升趨勢，其中B9處理上升較快；B3處理上升較慢，且EC始終低于B0處理，說明添加質量分數為0.3%的鼠李糖脂有利于緩解未進行氨水前處理核桃樹葉發酵過程中EC值的上升。

圖2 不同發酵處理的pH和電導率Fig. 2 pH and electrical conductivity under different fermentation treatments

2.2.3 不同發酵處理核桃樹葉腐殖情況 由圖3可知，胡敏酸（HA）含量從發酵初始至第5 周呈下降趨勢，第5 周至第7 周呈上升趨勢。發酵前期HA 含量降低可能是由于核桃樹葉中本身存在的HA 含量較高，且不穩定；發酵過程中將原本存在的HA 分解，重新合成了分子量較大、結構更為穩定的HA。在發酵過程中，A 組處理堆體的HA 含量始終低于B 組，可能是由于HA 可溶于堿性溶液，因而A 組受氨水前處理的影響HA含量較低。在發酵初始，堆體富里酸（FA）含量較高；發酵1 周后FA 含量快速降低，而后基本保持穩定，各處理間沒有明顯的規律性差異。FA是活躍的小分子有機酸，能被微生物利用，發酵初期微生物大量增值，消耗掉較多FA；發酵中后期堆體中存在有機物分解釋放和微生物的消耗及FA 向HA 的轉化，即產生與利用達到平衡，使HA 含量基本穩定。E4/E6 值是表征HA 分子大小與聚合程度的指標。由圖4 可知，A0~A9 處理的E4/E6 值在第1 周快速下降，而后呈緩慢上升趨勢；B0~B9 處理的E4/E6 值下降上升波動變化，較不穩定；且A0~A9 處理的E4/E6 值始終低于B0~B9 處理。

圖3 核桃樹葉發酵過程中胡敏酸、富里酸和E4/E6值變化Fig. 3 Changes in HA， FA， and E4 / E6 values during the fermentation of walnut leaves

圖4 不同發酵處理的C/N變化和T值Fig. 4 C/N and Tvalue under different fermentation treatments

2.2.4 不同發酵處理C/N 變化及T值差異 由圖4 可知，在核桃樹葉發酵過程中，堆體C/N 呈下降趨勢。其中B0~B9處理緩慢下降，除B6處理在發酵中期C/N 較高外，其余3個處理的C/N 均低于B0 對照，說明添加鼠李糖脂利于核桃樹葉發酵堆體C/N 的降低；A0~A9 處理在第1 周時下降快速，隨后緩慢降低，不同鼠李糖脂添加量處理間差異較小。發酵結束后，A0~A9 處理堆體的C/N 均低于B0~B9 處理，說明氨水前處理有利于核桃樹葉發酵過程中C/N 的降低，可以促進核桃樹葉的發酵分解。T值是發酵結束時的C/N 與初始物料的C/N 之比，由圖5 可知，B0 處理的T值最高，為0.58；A3 處理最低，為0.36。進行氨水前處理的A組堆體T值顯著低于未進行前處理的B 組；在同組內不同鼠李糖脂添加量處理間差異較小。

圖5 不同發酵處理核桃樹葉基質浸提液種子發芽指數Fig. 5 Seed germination index of substrate extracts under different fermentation treatments

2.2.5 不同發酵處理核桃樹葉基質安全性分析 國標GB/T 33891—2017 綠化用有機基質[17]對潛在毒害元素和重金屬含量進行規定，鈉離子含量小于1 000 mg·L-1，氯離子含量小于1 500 mg·L-1；園藝用基質重金屬含量應該達到標準Ⅰ級要求。由表5 可知，不同處理條件下發酵結束后核桃樹葉基質的重金屬和潛在毒害元素含量均符合要求。

表5 不同發酵處理核桃樹葉基質重金屬和潛在毒害元素含量Table 5 Contents of heavy metals and potentially toxic elements in walnut leaf substrate

種子發芽指數是檢測基質安全性和腐熟度最為直觀有效的方法。當種子發芽指數大于50%時，認為基質基本腐熟；大于80%認為基質完全腐熟[18]。由圖5 可知，B0 處理的發芽指數為70.56%，大于50%，基本達到腐熟；其余基質的發芽指數均達到80%以上，即基質完全腐熟。由此表明，所有處理基質均安全可用。

3 討論

酸堿前處理是調節核桃樹葉理化性質、促進其分解發酵的一種手段。本研究結合基質理化指標要求、基質原始材料在發酵過程中的變化[19-21]和基質原始材料發酵條件，分別取酸堿前處理后核桃樹葉的容重、氣水體積比和pH均值和總孔隙度、通氣孔隙度和持水孔隙度最大值及EC最小值構成理想處理，創新地采用了灰色關聯度法分別篩選酸堿溶液的適宜處理水平與處理時長組合，降低了數據分析的難度，同時使處理后的核桃樹葉更適宜后期發酵。通過灰色關聯法篩選出的草酸適宜前處理條件為體積分數1%溶液處理0.5 h；氨水的適宜前處理條件為體積分數0.5%溶液處理2 h。對比草酸和氨水各自適宜處理條件下核桃樹葉的理化性質，發現氨水處理后的pH更適宜核桃樹葉發酵，因此，確定體積分數0.5%氨水處理2 h為適宜的核桃樹葉前處理條件。

在物料堆腐發酵過程中，溫度是監測發酵情況的重要指標，陳漢才等[22]認為，發酵堆體溫度在55 ℃條件下保持3 d以上或50 ℃以上保持5~7 d，可以有效殺滅物料中的致病微生物，確保堆肥衛生指標合格。本研究發現，在6月28日至7月3日發酵堆體的溫度都在50 ℃以上，且保持高溫6 d，達到高溫要求，衛生指標合格。堆體溫度變化受到外界溫度的影響，但前期（6 月28 日—8 月16 日）堆體溫度的變化相對滯后于氣溫的變化；后期與氣溫變化同步，說明前期堆體快速發酵產熱，而后期產熱較少，表明核桃樹葉基本發酵腐熟。在發酵過程中，堆體pH隨發酵時間的延長逐漸升高，這可能與發酵過程中堿性物質的生成有關； A0~A9 處理的電導率呈降低趨勢，而B0~B9處理的電導率呈上升趨勢，說明氨水前處理有利于控制堆體電導率的升高。

在有機物料發酵分解過程中，有機質大分子在堆肥前期降解為小分子物質,然后被微生物礦化為CO2排放到空氣中,或在堆肥后期通過特定途徑聚合形成腐殖質[23]。腐殖質主要包含胡敏酸(HA)和富里酸(FA),其中HA 為大分子復合物,相對穩定；而FA 分子量較小,活性較高,可被微生物分解利用[24]。研究表明，在雞糞+稻草發酵過程中，FA 呈下降趨勢，HA 在堆肥初期迅速下降后期緩慢上升[25]；在新鮮牛糞+甘蔗渣[26]與雞糞+蔬菜廢棄物[27]發酵過程中，HA含量穩步上升，FA含量逐步下降；在餐廚垃圾+水稻秸稈發酵過程中，FA先增加后降低，HA 的含量快速上升[28]。本研究發現在核桃樹葉發酵過程中HA 和FA 含量都在降低，結果與前人研究結果存在差異。這一方面是因為核桃樹葉材料本身偏酸性；另一方面與氨水前處理有關。吳陽等[29]研究表明，園林綠化廢棄物堆肥在發酵過程中E4/E6 值上升；吳夢婷等[30]進行牛糞秸稈混合堆肥發現，E4/E6 值呈先升高再降低的趨勢。本研究表明，A0~A9 處理的E4/E6 值在第1 周快速下降，后又緩慢上升；B0~B9 處理的E4/E6 值呈下降上升波動變化。發酵初始時E4/E6 值較高，說明初始時HA 分子較小，聚合度較低；發酵后E4/E6值有所下降，且A0~A9處理始終低于B0~B9 處理，說明氨水前處理有利于大分子HA 的生成，提高了HA 的聚合度；發酵結束時，E4/E6 值仍然較高，說明腐殖酸分子仍相對活躍。核桃樹葉腐殖酸和E4/E6 值在發酵過程中變化較大且規律不穩定，因而不宜用作判斷核桃樹葉腐熟的評價標準，與前人研究結果一致[31-32]。Morel等[33]提出用T值來判別堆肥的腐熟程度，當T值小于0.6 時可認為堆肥腐熟。本研究發現8 個發酵處理的T值為0.36~0.58，均小于0.6，表明所有處理核桃樹葉均發酵腐熟。在發酵所得基質安全指標上，本研究所有處理的重金屬含量都在安全范圍內，且種子發芽率除B0 處理為70.56%外其余處理都高于80%，遠超過50%，說明所有處理核桃樹葉基質都安全可用。

在核桃樹葉堆腐發酵部分，除卻分析后發現不適宜用作評價指標的HA、FA、E4/E6值外，溫度、T值、重金屬含量和基質浸提液種子發芽指數等指標都表明8個處理的核桃樹葉發酵腐熟，且所得基質安全可用，其中A3處理發酵過程中保持相對較高的溫度，T值最低，發芽指數在85%以上，堆腐效果優于其他處理。結合前期的酸堿前處理，表明核桃樹葉基質研制的關鍵工藝為體積分數0.5%的氨水處理2 h后添加質量分數為0.3%鼠李糖脂進行發酵，完整的基質化工藝流程如圖6所示。

圖6 核桃樹葉基質化工藝流程Fig. 6 Substrate process of walnut leaves

核桃樹葉基質化是將其轉化為可在田間應用的基質的過程。本研究僅對核桃樹葉的酸堿前處理和堆腐發酵進行了研究，后續工作仍需在兩方面繼續努力：一是核桃樹葉基質的應用實踐，本研究結果表明核桃樹葉基質安全可用，但實際的應用效果如何，在育苗應用上能否培育壯苗，在栽培應用上能否保證作物生長和產量，這些都需要進一步檢驗；二是本研究雖篩選出了適宜的核桃樹葉前處理條件，但處理后核桃樹葉結構的變化機理卻未知，應進一步通過顯微觀察、葉表蠟質含量測定等方法探究核桃樹葉片結構與物質組成在前處理后的變化，或可取得新的發現。