紫花苜蓿花期調控基因MsCOL2的克隆及功能研究

盧棟宇,王 雪,蔣 旭,張云秀,張麗麗,栗亞靜,康俊梅

(中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所,北京 100193)

開花是植物從營養生長向生殖生長過渡的轉折點,是高等植物繁衍后代,延續物種的重要生理過程[1]。開花時間是由植物內源信號與外界環境因子共同精細地調控[2]。開花時間的早晚對飼草作物的產量和品質有重要的影響。開花前植物處于營養生長時期,光合產物主要用于營養體生長;開花后光合產物發生重新分配從營養器官轉向了繁殖器官,并伴隨著木質化程度的增加,導致飼草品質顯著下降[3]。因此,花期調控的分子機制一直是植物發育生物學研究的熱點和難點。

植物在長期的進化過程中形成了復雜精確的調節機制,通過響應內源信號和環境變化來調節開花時間[4]。通過對模式植物擬南芥開花發育及遺傳學分析表明,開花調控主要有6條途徑,分別為光周期途徑、赤霉素途徑、春化途徑、溫度途徑、年齡途徑和自主途徑[5-6]。其中光周期是影響植物開花的重要因素之一。研究表明,CONSTANS-Like(COL)基因家族成員具有保守的B-box和CCT結構域[7],在光周期開花誘導過程中起關鍵作用[8],在不同物種中COL的功能復雜多樣[9-12]。在擬南芥中,CO在長日照條件下作為正調控因子促進開花[13];過量表達COL5可以誘導短日照條件下擬南芥的開花[14]。對COL1和COL2的研究表明,它們對擬南芥的開花時間幾乎沒有影響,但過量表達COL1能夠縮短晝夜節律的周期[15]。在擬南芥中過表達COL8和COL9導致晚花表型[16-17]。COL開花的功能在其他物種中也有研究。水稻中的Headingdate1(Hd1),與擬南芥CO同源,在短日照條件下誘導開花,在長日照(LD)條件下則會抑制開花[18]。大豆中GmCOL1a和GmCOL1b在長日照條件下起到抑制開花作用[19]。大麥中CO的同源蛋白HvCO9有助于延遲大麥的開花[20]。在楊樹中,CO1和CO2在楊樹CO同系物中與擬南芥CO的序列相似性最高,但對開花時間沒有明顯的調節作用[21]。芒果中MiCOL1A和MiCOL1B在LD條件下抑制開花[22]。雖然在擬南芥、水稻、大豆等植物中開展了對COL的功能研究,但在紫花苜蓿中未見相關報道。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是多年生優質豆科牧草,其產草量高、蛋白質含量豐富,對奶業等草牧業的健康發展具有不可替代的作用[23]。紫花苜蓿的產量和品質與開花時間密切相關,其最佳刈割期是現蕾期和初花期,此時產量和品質均為最佳。收割的時間過早,苜蓿的產量會受到影響,收割時間過晚會導致苜蓿的品質下降。而苜蓿產量的增加,主要以增加營養體的產量為目標,如果延遲開花,就可以延長營養體生長的時間,從而達到提高產量和品質的目標。因此,晚花苜蓿品種的培育可以為苜蓿生產帶來較大的經濟效益,具有廣闊的應用前景。本研究克隆了紫花苜蓿MsCOL2基因,分析了其在不同組織與花發育時期的表達差異以及不同誘導條件下MsCOL2的表達模式;通過對過表達MsCOL2轉基因紫花苜蓿株系開花表型的觀測,揭示了MsCOL2調控開花的功能,本研究為解析MsCOL2調控紫花苜蓿開花的分子機制奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

用于表達模式分析和遺傳轉化的材料為‘中苜1號’紫花苜蓿(MedicagosativaL.‘Zhongmu No.1’),由中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所育成并保存。

實驗用載體：植物表達載體pCAMBIA3301-MsCOL2,大腸桿菌感受態DH5α,農桿菌感受態EHA105。

1.2 實驗方法

1.2.1苜蓿培養與處理 挑選飽滿大小均勻一致的紫花苜蓿種子,置于鋪有雙層濾紙的培養皿中發芽7 d,待子葉展開后移栽到1/2 Hoagland營養液中,置于植物培養箱(16 h光照/8 h黑暗,溫度 24℃,濕度 60%～70%),每周更換一次營養液,培養3周后進行光周期和激素處理。長日照處理為16 h光照/8 h黑暗,短日照處理為8 h光照/16 h黑暗,分別在0,4,8,12,16,20,24 h共7個時間點收集幼苗葉片部分;激素處理分別用50 μmol·L-1赤霉素(Gibberellic acid,GA3)和100 μmol·L-1水楊酸(Salicylic acid,SA)處理,分別在0,1,3,6,12 h共5個時間點收集幼苗葉組織。不同組織及花發育時期目標基因的表達分析所用材料為‘中苜1號’扦插苗,連續刈割兩次挑選生長狀態一致的植株,分別取葉、莖和花,其中葉、莖組織取樣時期為花芽分化期,花組織分別取花芽分化期的花苞、初花期尚未開放的花蕾和盛花期開放的花朵。所取試驗材料置于液氮中冷凍,保存于-80℃冰箱備用。測試材料均為3個生物學重復。

1.2.2植物總RNA的提取及cDNA合成 植物總RNA的提取利用RNA提取試劑盒(Promega,上海普洛麥格生物技術有限公司),詳細步驟參照試劑盒說明書。RNA完整性采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并用紫外分光光度計(NanoDrop 2000)檢測RNA的濃度。cDNA的反轉錄,利用反轉錄試劑盒(北京金沙生物科技有限公司),實驗過程詳見試劑盒說明書。

1.2.3MsCOL2的克隆 利用紫花苜蓿MsCOL2全長CDS序列設計PCR引物(表1),以紫花苜蓿cDNA為模板,利用ExTagDNA聚合酶進行PCR擴增,反應體系為50 μL：cDNA 2 μL,TakaRa EX Taq 0.5 μL,10×EX Taq Buffer 5 μL,dNTP Mixure 4 μL,MsCOL2引物各2.5 μL,去離子水33.5 μL。反應程序為95℃ 5 min;95℃ 30 s,52℃ 30 s,72℃ 1 min 20 s,25個循環;72℃ 5 min。PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后純化。

1.2.4組織差異性及不同誘導條件下的表達模式分析 利用qRT-PCR檢測MsCOL2的表達水平,以紫花苜蓿Actin為內參。將cDNA稀釋20倍備用,實時熒光定量PCR體系為20 μL,反應體系如下：10 μL 2×Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix;0.4 μL qCOL2-F;0.4 μL qCOL2-R;2 μL cDNA;7.2 μL去離子水。引物序列見表1。

表1 基因克隆及載體構建引物序列Table 1 Primer sequences for gene cloning and vector construction

1.3 生物信息學分析

利用NCBI的ORF finder(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)預測最大開放閱讀框;通過DNAMAN進行氨基酸同源序列比對;MEGA11.0軟件使用鄰接法構建進化樹,Bootstrap設置為1 000次[24];利用Protscale(https：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)預測跨膜結構域;利用ExASy(https：//web.expasy.org/cgi-bin/computepi)預測MsCOL2蛋白分子量大小、理論等電點和親水性;利用Plantcare(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/)預測分析啟動子區域(起始密碼ATG上游2 kb)順式作用元件。利用SOPMA(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)預測蛋白的二級結構;利用Cell-PLoc 2.0(http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/)進行蛋白亞細胞定位分析。以上軟件均使用默認參數進行分析。

1.4 過表達載體的構建與遺傳轉化

利用測序正確的pTOPO-MsCOL2質粒擴增帶有同源臂的PCR產物,將帶有同源臂的擴增產物與pCAMBIA3301載體進行同源重組。

將構建好的載體轉入EHA105農桿菌中,采用根癌農桿菌侵染法[25],以紫花苜蓿葉片為外植體進行遺傳轉化。將轉化后的外植體在無抗性SH3a培養基上共培養24～48 h,移入SH3a(2 mg·L-1草銨膦、400 mg·L-1頭孢霉素)培養基中,置于人工培養箱避光培養6～8周。將愈傷組織轉入MSBK培養基(2 mg·L-1草銨膦、400 mg·L-1頭孢霉素)中,進行光照培養(16 h光照/8 h黑暗,溫度22℃,濕度60%),誘導叢生芽生長。2～3周后將含有叢生芽的愈傷組織轉入SH9a培養基(2 mg·L-1草銨膦、400 mg·L-1頭孢霉素)中誘導根芽分化,直至長出幼苗和強壯的根系,移入土壤生長(營養土∶蛭石=1∶1),置于人工氣候室培養(條件同上)。

1.5 紫花苜蓿陽性苗鑒定及MsCOL2的表達分析

遺傳轉化的紫花苜蓿再生植株提取基因組DNA采用快檢法：剪取20 mg葉片放入200 μL DNA提取液中研磨,研磨完全后13 000 r·min-1離心15 min,隨后吸取160 μL上清液轉移到一個新的1.5 mL離心管中,加入160 μL異丙醇吸打混勻,將混合液13 000 r·min-1離心15 min,棄上清液,將離心管倒置30 min,倒置結束后向離心管中加入20 μL滅菌水懸浮,所得DNA溶液,保存在-20℃冰箱。以提取的DNA為模板,利用通用引物35S-F/GUS-R(表1)進行PCR擴增,擴增體系如下：5 μL 2×taq PCR Mix,0.5 μL 35S-F,0.5 μL GUS-R,1 μLDNA,3 μL去離子水。用移液槍輕輕吹打混勻,瞬時離心后進行PCR反應,PCR擴增體系為：95℃ 5 min,95℃ 30 s,50℃ 30 s,72℃ 1 min,25 cycles,72℃ 5 min。反應結束后將PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.6 開花相關基因的表達分析

開花相關基因的表達對植物的開花有重要影響。為探究過量表達MsCOL2對紫花苜蓿開花相關基因表達的影響,選取2個MsCOL2表達量較高的轉基因株系進行功能驗證分析。本研究挑選了已報道的12個開花相關的基因,其中促進開花基因為MsPHYA,MsGI,MsFKF1,MsFTa1,MsSOCa1,MsSPL13,MsCO和MsLFY,抑制開花相關基因為MsSVP,MsTOCa1,MsELF4和MsEFM(引物序列見表2)。

表2 研究所用的定量引物序列Table 2 Sequences of the quantitative primers used in the study

2 結果與分析

2.1 MsCOL2的克隆與生物信息學分析

以紫花苜蓿cDNA為模板克隆了MsCOL2,CDS序列長度為1 206 bp,編碼401個氨基酸。Blast結果和系統進化樹分析表明,該基因編碼蛋白的氨基酸序列與豆科模式植物蒺藜苜蓿的COL親緣關系最近,相似度為95.28%,故命名為MsCOL2(圖1,2)。

通過同源氨基酸多重序列比對分析和保守結構域預測,MsCOL2基因編碼的氨基酸序列含有兩段由44個氨基酸組成的典型BBox保守區和一段由43個氨基酸組成的典型CCT保守結構域(圖1)。為了預測MsCOL2的功能,利用PlantCARE軟件預測該基因的順式作用元件,結果顯示,該基因啟動子包含多個順式作用元件,其中包括GT1,G-box等一系列光響應元件,還包含有GARE-motif和P-box等赤霉素和水楊酸響應元件(表3)。

ExPASy在線預測MsCOL2蛋白分子量為43.96 kDa,理論等電點為5.00;MsCOL2全部氨基酸的平均親水系數為-0.527,表明其為親水性蛋白質(圖3A)。對MsCOL2蛋白分析結果顯示,該蛋白的二級結構以無規則卷曲為主,占總體的57.11%,α-螺旋占29.43%,β-折疊占2%,轉角為11.47%(圖3C);TMHMM預測該蛋白無跨膜結構域(圖3B);通過Cell-PLoc 2.0軟件預測,該蛋白定位在細胞核上(圖3D)。

圖1 MsCOL2與其他物種的多序列比對Fig.1 Multiple sequence alignment of MsCOL2 with other species注：方框內為BBox結構域,下劃線為CCTmotif。Gm為大豆;Mt為蒺藜苜蓿;At為擬南芥;Zm為玉米;Os為水稻;Ta為小麥Note：The BBox domain is inside the box and underlined is CCTmotif.Gm stands for Glycine max;Mt stands for Medicago truncatula;At stands for Arabidopsis thaliana;Zm stands for Zea mays;Os stands for Oryza sativa;Ta stands for Triticum aestivum

圖3 MsCOL2生物信息學分析Fig.3 Bioinformatics analysis of MsCOL2注：A為MsCOL2的親水性;B為MsCOL2無跨膜結構;C為MsCOL2的二級結構;D為MsCOL2的亞細胞定位預測Note：A stands for Hydrophilicity of MsCOL2 protein predicted by Protscale;B stands for Non-transmamrane domain for MsCOL2 protein predicted by TMHMM;C stands for Secondary structure of MsCOL2 predicted by SOPMA;D stands for Prediction of MsCOL2 subcellular localization by Cell-Ploc

表3 啟動子作用元件分析Table 3 Predictive analysis of promoter acting elements

2.2 MsCOL2表達模式分析

2.2.1MsCOL2組織特異性及花的不同發育時期的表達分析 為了明確MsCOL2基因在不同組織中的表達特性,利用qRT-PCR 分析了該基因在花、莖、葉以及花芽分化期、初花期、盛花期的表達水平,結果顯示,MsCOL2在花、莖、葉中均有表達,且在花中表達量最高,是莖中的3倍(圖4A)。花不同發育時期表達分析結果表明,MsCOL2在花芽分化期表達量最高,為初花期的1.6倍,為盛花期的2.7倍(圖4B)。

2.2.2光周期和外源激素誘導下MsCOL2的表達分析 光周期是影響植物開花的重要因素之一。為了明確MsCOL2對光周期誘導的表達模式,采用3周齡的紫花苜蓿分別進行了長日照(LD)和短日照(SD)處理。qRT-PCR結果分析顯示,在LD條件下,MsCOL2表達量峰值出現在光照后8 h和12 h(圖5A);而SD條件下,隨著黑暗時間的增加,MsCOL2表達量逐步上升,且在24 h達到一個高峰(圖5B)。在長、短日照條件下,該基因在轉錄水平均呈現24小時一個周期性的變化,說明MsCOL2與COL家族其他成員類似,能夠響應光周期,暗示MsCOL2可能在光周期開花調控中發揮重要作用。

圖4 MsCOL2在不同組織與花發育時期的表達分析Fig.4 Expression analysis of MsCOL2 at different tissues and flower developmental stages注：A為組織特異性表達;B為花發育的3個時期差異表達。Bar表示標準差“*”和“**”分別代表t檢驗P<0.05 和<0.01。下同Note：A：Tissue specific expressions;B：Differential expressions at three flower developmental stages.Error bars represent the standard error of the mean,“*”or “**”on behalf of P value<0.05 or <0.01 by student t test analysis.The same as below

激素在植物的開花途徑中起重要的調節作用。為了揭示施加外源激素對MsCOL2表達的影響,分析了50 μmol·L-1GA3和100 μmol·L-1SA誘導下的表達特性。研究結果表明,在GA3誘導下,MsCOL2表達量呈現先升高后降低再升高的變化趨勢,24 h時表達量達到最高水平,為對照的1.7倍(圖5C);SA誘導12 h時表達量達到最高水平,為對照的25倍(圖5D)。上述研究結果表明,MsCOL2受激素GA3和SA誘導表達。

2.3 過表達MsCOL2紫花苜蓿鑒定及開花相關基因表達分析

2.3.1過表達MsCOL2紫花苜蓿鑒定及表型分析 以pCAMBIA3301作為表達載體,通過無縫克隆構建過表達載體,用W-MsCOL2-F和GUS-R引物對含有3301-35S-MsCOL2質粒的大腸桿菌單菌落進行陽性鑒定,PCR產物經1%凝膠電泳檢測,出現單一條帶,大小約為1 200 bp左右,表明MsCOL2基因成功導入苜蓿基因組(圖6)。通過陽性鑒定共獲得8株35S：MsCOL2過表達株系,qRT-PCR分析轉基因紫花苜蓿與對照組MsCOL2的表達水平,其中,OE#1的表達量為對照的5.8倍,OE#6的表達量為對照的4.7倍。選擇上述2株轉基因植株開展后續功能驗證研究(圖7)。開花表型初步觀察發現,對照在刈割后37天開花,而過表達MsCOL2紫花苜蓿植株在刈割后的45天開花,開花時間比對照延遲9天。

2.3.2過表達MsCOL2紫花苜蓿中開花相關基因的表達分析 為了分析過量表達MsCOL2對開花調控途徑中與開花相關基因表達水平的影響,利用qRT-PCR檢測了轉基因株系中促進開花相關基因MsPHYA,MsGI,MsFKF1,MsFTa1,MsSOC1,MsSPL13,MsCO,MsTGA1,MsSARD1,MsSLY1和MsFLD的表達水平,以及抑制開花相關基因MsSVP,MsTOC1,MsELF4和MsEFM的表達水平。研究結果顯示,促進開花的相關基因MsPHYA,MsSPL13,MsFTa1,MsCO,MsTGA1,MsSARD1,MsSLY1,MsFLD和MsLFY的表達水平均下調,其中成花素基因MsFTa1的表達顯著下調,其表達量僅是對照的0.07%,MsSPL13的表達量是對照的24.4%,MsPHYA的表達量是對照的33%。本研究結果顯示抑制開花相關基因MsSVP,MsTOCa1,MsELF4和MsEFM的表達水平均上調,其中OE#1中MsELF4表達量比對照提高了30.9倍。上述結果表明,過表達MsCOL2可能抑制促進開花基因的表達,而促進抑制開花基因的表達(圖8)。

圖6 過表達MsCOL2紫花苜蓿的鑒定Fig.6 Positive identification of MsCOL2-overexpression alfalfa

圖7 轉基因紫花苜蓿MsCOL2表達分析Fig.7 Expression analysis of MsCOL2-overexpression alfalfa注：WT為野生型植株;OE#1-OE#8為過表達紫花苜蓿植株Note：WT：Wild-type plants;OE#1-OE#8：Overexpressing alfalfa plants

圖8 過表達MsCOL2紫花苜蓿開花相關基因表達分析Fig.8 Expression analysis of flowering-related genes under overexpressed MsCOL2 alfalfa注：A-L為促進開花相關基因;M-P為抑制開花相關基因Note：A-L stands for Flowering promoting genes;M-P stands for Flower inhibiting genes

3 討論

3.1 MsCOL2組織特異性及花的發育不同時期的表達分析

開花是影響植物繁殖和提高作物產量的重要農藝性狀之一[26]。為了明確MsCOL2基因在不同組織中的表達特性,利用qRT-PCR進行了組織特異性表達檢測,結果顯示,MsCOL2在花中表達量最高,預測該基因可能參與苜蓿的花期調控。本研究對花芽分化期、初花期、盛花期3個不同花發育時期的MsCOL2表達量分析表明,在花芽分化期相對表達量最高。已有研究表明花芽分化是積累營養物質以及激素調節物質、遺傳物質等共同協調作用的過程,是花器官形成的基礎,并控制開花時間[27]。推測該基因在成花初期表達水平高,可能在花蕾形成和花發育中可能發揮功能。

3.2 光周期和外源激素誘導MsCOL2的表達

光周期是影響植物開花的重要因素之一。光響應元件能夠感知光信號,不同光照能夠調控基因表達。研究報道,在LD條件下擬南芥中AtCO的表達水平在黃昏時達到峰值,而SD條件下在夜間達到峰值。春蘭在LD條件下CgCOL的表達水平光照期間高于黑暗期間,在SD條件下,在光照下CgCOL的表達水平低于黑暗[28-31]。水稻中OsCOL16的表達水平先降低后增加,在黃昏后6 h或14 h達到峰值[32]。本研究MsCOL2在長日照和短日照條件下,表現出不同的晝夜表達模式,暗示MsCOL2可能在光周期開花調控中發揮重要作用。

激素在植物的開花調控中發揮著重要的作用,GA3,SA均參與植物的開花調控[33-34]。赤霉素可以使SOC1基因的表達水平上調,進而促進花分生組織基因LEAFY的表達上調,從而促進植物開花[35]。水楊酸可以誘導植物的花芽分化[36]。在苜蓿生殖生長的不同時期葉面噴施GA3后,會直接影響花莢激素含量的變化,從而間接影響苜蓿產量構成因子與種子產量[37-38]。對紫花苜蓿分別施加50 μmol·L-1GA3和100 μmol·L-1SA兩種激素,MsCOL2表達量上調,說明MsCOL2受到2種激素的誘導,但是施加2種激素對紫花苜蓿開花的影響,以及如何通過MsCOL2調控開花還有待于進一步研究。

3.3 MsCOL2參與紫花苜蓿開花基因表達調控

為了探究過表達MsCOL2對紫花苜蓿開花花期調控途徑中開花相關基因的影響。挑選已報道的與促進開花相關的基因MsPHYA,MsGI,MsFKF1,MsSOC1,MsSPL13,MsCO,MsLFY,MsFTa1,MsTGA1,MsSARD1,MsSLY1,MsFLD和抑制開花相關基因MsSVP,MsTOC1,MsELF4,MsEFM進行定量表達分析;結果顯示,與對照相比,過表達MsCOL2材料中促進開花基因MsFTa1和MsPHYA的表達水平顯著下調。研究表明,成花素基因FT是植物開花網絡的中心調控因子,在紫花苜蓿中沉默FTa1具有延遲開花的作用[39];PHYA作為光敏因子,主要感受遠紅光,參與到光周期開花調節途徑中[40],這些促進開花基因在過表達紫花苜蓿中的表達量均有所下調,暗示MsCOL2在紫花苜蓿開花調控過程中發揮負調控作用。GI是一種植物特有的核蛋白,具有調控開花時間、晝夜節律和光信號轉導的作用,擬南芥gi突變體能夠延遲開花[41];然而,長日照條件下過表達OsGI水稻出現開花延遲[42]。本研究中過表達MsCOL2植株中MsGI基因表達量上調,可能與水稻開花調控的機制相似。CO結合在SOC1的啟動子上正調控其表達[43],擬南芥中過表達水稻OsSOC1導致轉基因植株出現早花表型[44],而草莓中過表達FvSOC1卻抑制開花[45]。本研究分析顯示,過表達MsCOL2植株中SOC1表達量上調,表明COL對SOC1的表達有促進作用。本研究分析結果顯示,在過表達MsCOL2材料中,抑制開花基因MsTOC1和MsSVP的表達量分別上調了4.5倍和1.5倍。TOC1通過光周期調節途徑調控擬南芥對光照的響應,toc1突變會導致擬南芥的晝夜節律縮短[46-47]。SVP通過結合FT的啟動子區域,抑制其轉錄表達從而調控開花,在擬南芥中過表達SVP具有延遲開花的作用[48-50]。以上抑制開花基因在過表達MsCOL2紫花苜蓿中表達均上調。綜上,MsCOL2可能在紫花苜蓿開花途徑中發揮上調抑制開花基因表達水平的作用,從而導致開花延遲。

4 結論

MsCOL2受光周期和外源激素GA3和SA的誘導表達,暗示在光周期和激素開花調節途徑中發揮作用。MsCOL2能夠上調抑制開花基因的表達水平,下調促進開花基因表達水平。表型觀察顯示紫花苜蓿開花延遲,表明MsCOL2在延遲苜蓿開花的調控機制有重要的作用。