施肥對鹽堿地飼用燕麥根際土壤微生物多樣性的影響

孟利芳,姚曉翠,但 瑤,許 興,郭慶茹,李 欣,毛桂蓮*

(1.寧夏大學生命科學學院,寧夏 銀川 750021;2.寧夏大學農學院,寧夏 銀川 750021;3.農業技術推廣服務中心,寧夏 石嘴山 753600;4.農業綜合開發中心,寧夏 石嘴山 753000)

土壤鹽堿化是限制作物生長發育的世界性難題[1]。據統計,全世界受鹽害影響的土地占世界總陸地面積的7%左右。我國作為世界第三大鹽堿地分布地區,現有鹽堿地面積已經超過1×108hm2[2]。土壤微生物作為“植物-土壤-微生物”有機系統中的重要組分[3],其群落結構多樣性易受鹽堿化的影響[4]。有學者研究發現,鹽漬化會造成土壤微生物增殖受限、數量驟減,土壤中脲酶、蔗糖酶等酶活性和呼吸強度亦大幅降低[5-6]。因此,研究鹽堿地作物根際微生物多樣性對于鹽堿地的改良利用具有極其重要的理論及實踐意義。

植物生長過程中的施肥模式對土壤微生物數量、微生物多樣性及其群落結構具有重要影響。已有研究表明,與不施肥相比,任一形式的施肥均能改變土壤微生物數量,且長期單一施肥甚至對微生物多樣性產生負面影響[7]。因此,如何正確選擇施肥模式在土地生產力提升和農業資源高效利用過程中至關重要。近年來,控釋肥作為一種利用包膜技術來控制養分釋放的新型肥料,具有提高肥料利用效率、保障作物生長發育和節約生產勞動力等優勢,已經在實際農業生產過程中得到廣泛應用[8]。目前,控釋肥對作物根際微生物多樣性影響的研究主要集中在小麥(TriticumaestivumL.)[9]、大豆(Glycinemax)[10]和玉米(ZeamaysL.)[11]等作物方面。但有關控釋肥對鹽堿地飼草根際微生物多樣性的研究鮮有報道。

飼用燕麥(AvenasativaL.)是禾本科、燕麥屬的一年生草本植物,因其優良的耐鹽、耐寒、耐旱性能以及極高的飼用價值,被認為是我國西北地區的優質草食動物飼料和優良種質資源[12]。有關飼用燕麥施肥的研究較多,但控釋肥對鹽堿地飼用燕麥根際微生物的影響的研究少之又少。鑒于此,本研究以鹽堿地飼用燕麥根際土壤為試驗對象,對不施肥、施常規肥和施控釋肥3種施肥模式下飼用燕麥根際土壤細菌和真菌的菌群結構、土壤理化性質及二者關系進行探究,以期為鹽堿地飼用燕麥的高效施肥模式篩選提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗區概況

試驗地位于寧夏平羅縣高莊鄉惠威村(東經106°54′,北緯38°96′),海拔約1 104 m,地勢較為平坦,全年光照約3 008 h。該試驗地由于降雨少、風沙大而引起的干旱氣候導致其年蒸發量約為降水量的10倍左右。該試驗區是典型的鹽堿土,土壤類型為白僵土,土質黏重。土壤本底值為：pH值為8.6,全鹽含量為3.18 g·kg-1,有機質含量為17.28 g·kg-1,全磷含量為0.69 g·kg-1,堿解氮含量為79.33 mg·kg-1,速效磷含量為11.43 mg·kg-1,速效鉀含量為135.53 mg·kg-1。

1.2 試驗設計

試驗采用隨機區組設計(表1)。飼用燕麥于2022年3月6日播種,每個小區面積8 m×11 m,每個處理重復3次,共9個小區。對種植的飼用燕麥進行3種施肥處理方式,對照組均不施肥;處理組T1施常規肥(N∶P2O5∶K2O為10∶12∶5);處理組T2施控釋肥(N∶P2O5∶K2O為10∶12∶5)。播種前控釋肥1次性基施,常規肥分基施和追施(兩次)。待燕麥蠟熟期采集根際土樣。采用分點取樣法,挖取燕麥植株,晃動震落燕麥根部松散的土壤后,用無菌毛刷將飼用燕麥根部表面厚度約5 mm的土壤輕輕刷入無菌自封袋中,同一小區內按對角線取樣,每種施肥方式處理設置3個重復,共9份土壤樣品。將采集好的土壤樣品置于冰中運輸至實驗室,經液氮速凍后,送至美吉生物科技有限公司進行測序。

表1 試驗處理Table 1 Fertilization treatments

1.3 土壤樣品理化性質的測定

土壤pH值和全鹽含量分別使用pH計和電導率儀進行測定;有機質含量采用K2Cr2O7氧化外加熱法進行測定;全磷含量采用NaOH熔融法進行測定;堿解氮含量采用堿解-擴散法原理進行測定;速效磷采用NaHCO3浸提分光光度計法進行測定;速效鉀含量則采用CH3COONH火焰光度計法進行測定[13]。

1.4 土壤樣品的微生物測定

1.4.1土壤微生物總DNA提取 對基因組DNA抽提后,利用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測抽提的基因DNA。

1.4.2PCR擴增 利用2%瓊脂糖凝膠電泳對同一樣本的PCR混合產物進行檢測,將PCR產物使用AXYGEN公司的AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收,使用Tris-HCl洗脫后再用2%瓊脂糖電泳檢測回收。Miseq文庫采用TruSeqTM DNA Sample Prep Kit進行構建。細菌擴增的引物序列338F為5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′;806R為5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′。真菌的擴增引物序列ITS1F為5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′;ITS2R為5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′。

1.4.3高通量測序與數據處理 根據overlap關系首先對Miseq測序得到的PE reads進行拼接,然后對獲得的序列過濾并進行質量控制。在區分樣本的基礎上進行物種分類學分析、操作性分類單元(Operational taxonomic unit,OTU)聚類分析和多樣性指數分析、群落結構的統計分析等。在上述分析的基礎上,還進行多樣本的群落組成和土壤理化性質的多元分析等一系列深入的統計學和可視化分析。

1.5 數據統計與分析

使用SPSS 26.0和Origin 2018軟件對土壤理化性質等數據進行統計與分析;細菌和真菌群落的α、β多樣性指數運用PICRUSt 1.1.0和Qiime 1.9.1軟件進行計算;細菌和真菌基因序列的Venn圖運用R軟件繪制;土壤理化性質與微生物群落組成的冗余分析使用CANOCO 5.0軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 土壤理化性質分析

如表2所示,取樣點的根際土壤均呈堿性,與不施肥相比,施常規肥與控釋肥的土壤pH值和全鹽含量均呈降低趨勢,施控釋肥后土壤pH下降至8.13,與不施肥相比下降了0.41;施控釋肥后土壤全鹽含量下降至1.88 g·kg-1,與不施肥處理差異顯著(P<0.05),下降了1.19 g·kg-1。相較于不施肥處理,施肥后土壤養分中的有機質含量、速效磷含量、速效鉀含量和堿解氮含量均呈上升趨勢,且除有機質外含量外其它養分含量在施常規肥時的增長效果優于施控釋肥。

表2 不同施肥處理后的土壤理化性質Table 2 Soil physicochemical properties after different fertilization treatments

2.2 土壤微生物多樣性分析

2.2.1土壤樣品測序結果及深度評估 對不施肥、施常規肥和施控釋肥的3個處理組(每個處理3個重復)的9個土壤樣品進行測序,結果如表3所示。在優化過濾低質量序列后細菌的16S rRNA基因片段共獲得了516 318條優化序列,其中平均序列長度為415 bp。真菌ITS1測序后共獲得了712 696條優化序列,其中平均序列長度為237 bp。

表3 土壤微生物測序結果統計Table 3 Statistics of soil microbes sequencing analysis

2.2.2土壤微生物Alpha多樣性指數分析 Alpha多樣性指數是一種用于衡量細菌或真菌群落內物種在相同環境下相互競爭或共生的物種多樣性指標,其主要體現的是群落內物種的相對豐度[14]。表4為不施肥、施常規肥和施控釋肥3種施肥模式對鹽堿地飼用燕麥土壤微生物細菌與真菌Alpha多樣性指數的影響。從表4中可以看出,T1和T2處理的Ace指數、Shannon指數、Simpson指數和覆蓋度均高于對照組,且T2處理組的Alpha多樣性指數高于T1處理組。說明施肥均增加了細菌和真菌群落的豐富度及多樣性且控釋肥的促進作用更顯著。

表4 土壤細菌和真菌Alpha多樣性指數分析Table 4 Analysis on alpha diversity indexes of soil bacteria and fungi

2.2.3土壤微生物Beta多樣性分析 圖1是對3種施肥模式下土壤細菌、真菌OTU組成進行Beta多樣性的主成分分析,由圖1A可知,不施肥的空白對照與施常規肥和控釋肥的處理之間距離較遠,說明土壤細菌OTU組成在施肥和不施肥處理間群落結構組成差異較大。圖1B為真菌的群落組成主成分分析,PCA1為48.84%,PCA2為29.85%,分別解釋了真菌群落的差異及變化。可以看出CK,T1和T2三種施肥處理間距離較近,說明3種施肥模式處理下的土壤真菌群落結構之間差異較小。

圖1 土壤細菌、真菌群落的主成分分析Fig.1 PCA analysis on soil bacterial and fungal communities

2.3 土壤微生物群落組成和結構比較分析

圖2A和2B表明,3種處理共有的細菌OTUs數量為1 969,CK-T1,CK-T2,T1-T2特有的OTUs數量分別為125,138,196。3種施肥處理共有的真菌OTUs數量為334,CK-T1,CK-T2,T1-T2特有的OTUs數量分別為40,56,96。可見,細菌和真菌的OTU數量皆為施控釋肥時最多。

在3種施肥處理方式下根圍土壤細菌門水平的優勢菌群包括放線菌門(Actinobacteria)、變形桿菌門(Proteobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、擬桿菌門(Bacteroidota)、酸桿菌門(Acidobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、粘菌門(Myxococcota)、芽單胞菌門(Gemmatimonadota)、疣微菌門(Verrucomicrobiota)和髕骨細菌門(Patescibacteria)等10個門(圖2C)。在所有樣品中放線菌門的相對豐度最高,放線菌門的豐度平均值在3種施肥模式處理下分別為31.18%,33.92%,32.34%。與不施肥的對照相比,施常規肥和施控釋肥下的放線菌門等優勢菌群均有所變化,但在處理間差異不顯著。土壤真菌門水平的群落在3種施肥處理方式下燕麥根系周圍優勢菌群包括子囊菌門(Ascomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)和一部分未知真菌(圖2D)。其中子囊菌門(Ascomycota)的豐度最高,其豐度平均值在3種施肥處理下分別為92.33%,93.24%和93.29%。與不施肥的對照相比,施常規肥和施控釋肥下擔子菌門相對豐度呈下降趨勢,子囊菌門和其它優勢菌群的相對豐度均呈上升趨勢。

圖2E和2F是將相對豐度前20的細菌和真菌菌屬進行Heatmap圖繪制。相對豐度由低到高使用色塊由藍到紅表示。由圖2E可知,相較于對照組,施肥處理均降低了污物假節桿菌屬(Pseudarthrobacter)和游動球菌屬(Planomicrobium)的相對豐度。由圖2F可知,相較于對照組,施肥處理增加了鬼傘屬(Coprinopsis)、新赤殼屬(Neocosmospora)和被孢霉屬(Mortierella)等的相對豐度,且降低了維希尼克氏酵母屬(Vishniacozyma)、小鐮孢屬(Fusariella)和枝孢屬(Cladosporium)等的相對豐度。

2.4 土壤理化性質與微生物組成的相關性分析

圖3為種植飼用燕麥的鹽堿地的土壤理化性質與細菌、真菌門水平豐度的冗余分析。如圖3A所示,第一軸對土壤細菌變化的解釋為36.28%,第二軸對土壤細菌變化的解釋為20.93%,兩者解釋了土壤細菌群落組成57.21%的變異。在對細菌相關性分析中,pH值、全鹽含量與放線菌門和變形桿菌門相對豐度呈負相關關系。圖3B中,第一軸和第二軸對真菌變化的解釋率分別為44.48%和28.78%。子囊菌門、被孢霉門和未知真菌相對豐度與pH值和全鹽含量呈負相關關系。從土壤養分與微生物群落結構相關性來看,門水平的優勢菌門相對豐度與其它土壤養分含量均呈正相關關系,其中全磷含量與優勢菌群相對豐度相關性最高。

圖2 土壤細菌和真菌的群落組成分析Fig.2 Analysis of the community composition of soil bacteria and fungi注：A.土壤細菌的OTU維恩圖;B.土壤真菌的OTU維恩圖;C.門水平下土壤細菌群落的組成及豐度;D.門水平下土壤真菌群落的組成及豐度;E.土壤細菌群落組成熱圖,圖中未注釋的norank_f__指在屬分類學水平上沒有明確的分類信息或分類名稱;F.土壤真菌群落組成熱圖Note：Panel A displays the OTU diagram venn of bacteria in soil;Panel B the OTU diagram venn of fungi in soil;Panel C the relative abundance of bacteria phyla in soil;Panel D the relative abundance of fungi phyla in soil;Panel E the heat map of soil bacterial composition,within which the unannotated norank_f__ refers to the absence of clear taxonomic information or taxonomic names at the generic taxonomic level;Panel F the heat map of soil fungal composition

3 討論

3.1 不同施肥模式對鹽堿地飼用燕麥根際微生物數量與群落組成的影響

根際是土壤微生物的特殊生存環境。在鹽漬化逆境下,植物可通過根際效應提高微生物活性從而活化土壤養分,增強其抵抗鹽堿脅迫的能力[15]。植物根際土壤中存在的細菌、真菌等微生物不但能夠參與有機質降解和養分交換,還能夠儲備氮、磷等養分,起調控養分的作用[16]。施肥對植物根際土壤微生物數量與種類有一定的影響,施用不同類型的肥料會產生不同程度的影響[17]。控釋肥作為新型復合肥料,可以根據釋放時間、釋放方式和作物吸收養分規律來調控養分的釋放,滿足了作物不同時期生長對養分的需求,增加了肥料的利用率[18]。本研究通過對不施肥、施常規肥和控釋肥處理下的鹽堿地飼用燕麥根際土壤微生物進行微生物物種的檢測,結果發現與不施肥處理下的土壤微生物物種相比較,施肥會在一定程度上增加鹽堿地飼用燕麥土壤細菌和真菌的OTU數量,這與唐海明等[19]、劉晶鑫等[20]報道的關于施肥顯著改變了0～20 cm土壤微生物的豐富度和多樣性研究結果一致。施肥也為微生物提供了充足的能源與養分,本研究中細菌在土壤中的作用高于真菌。這是因為細菌具有快速生長的能力,適應能力強[21]。本研究發現施控釋肥后的細菌和真菌OTU數量優于施常規肥,這可能是由于控釋肥養分釋放的長期效應促進飼用燕麥地上部分的生長,進而增加了外源碳的輸入,由此增加了土壤微生物OTU數量。

對不同施肥處理下的鹽堿地飼用燕麥根際土壤微生物的群落結構及組成進行研究結果發現,土壤細菌中,放線菌門在施肥處理中的相對豐度較高,是鹽堿地飼用燕麥土壤中優勢菌群,但在施肥處理下厚壁菌門的相對豐度顯著低于不施肥處理的對照組,施控釋肥處理下土壤中子囊菌門的相對豐度較高。在土壤真菌中,子囊菌門是優勢菌門,多為腐生菌,是土壤中主要的真菌分解者,對降解土壤有機質起著重要作用[22],說明常規肥和緩釋肥在一定程度上改變了土壤微生物的多樣性、菌群的相對豐度。但鹽堿地土壤微生物群落組成不僅僅只受到施肥模式的影響,還受到耕作方式、施肥量和作物類型等多種因素的共同作用,影響因素復雜,有待進一步研究。

3.2 不同施肥模式對土壤理化性質的影響

3.3 土壤微生物群落組成與土壤理化性質的相關性分析

土壤鹽堿化嚴重影響了土壤微生物的組成,研究發現鹽堿地的土壤微生物多樣性隨著鹽濃度的增加呈線性下降,高鹽會致多樣性降低[28]。土壤微生物多樣性能預測土壤質量的變化,是土壤質量變化最敏感的指標,也是土壤健康的決定因素[29]。土壤微生物的種類受土壤養分含量和pH值的共同作用[30]。本研究中對pH值、全鹽含量和土壤養分與細菌、真菌的群落組成進行相關性分析,通過pH值和全鹽含量相關性分析發現pH值和全鹽含量與優勢菌群相對豐度呈負相關關系。說明pH值越高,土壤微生物中的優勢菌群相對豐度會呈下降趨勢,從而影響植物生長。與土壤養分相關性分析中研究發現土壤全磷、堿解氮和速效鉀含量對細菌和真菌群落組成影響較大,其中全磷含量對細菌和真菌群落組成相對豐度的相關性影響顯著,而速效磷對其影響不顯著。全磷是土壤中磷元素的總貯量,速效磷是土壤中能被植物吸收利用的磷[31],所以施肥使土壤中磷濃度增加,但增加的磷元素是不是影響土壤微生物的主要因素還有待進一步研究。堿解氮和速效鉀含量對細菌和真菌群落組成影響較大的原因可能為施肥導致土壤中氮元素和鉀元素的增加,土壤中的氮元素會被微生物吸收利用后合成生物大分子參與重要的生理作用,而鉀元素會促進微生物對鉀的釋放從而提供作物可吸收的有效鉀養分[32]。

4 結論

常規肥和控釋肥施入后均降低了土壤pH值和全鹽含量,增加了堿解氮和速效鉀等土壤養分的含量以及飼用燕麥根際土壤微生物細菌和真菌的OTU數量和群落的豐富度,不同施肥模式下群落的組成中優勢細菌門類均為放線菌門和變形桿菌門,優勢真菌門均為子囊菌門和擔子菌門。相關性分析顯示,細菌與真菌中的優勢菌群相對豐度與pH值、全鹽含量均呈負相關,且微生物群落多樣性受土壤養分的影響顯著。說明施肥提高了根際微生物群落多樣性,使土壤微生物群落組成向有益微生物菌群增加方向轉變,其中控釋肥對提高根際微生物多樣性的效果更佳。