基于多光譜成像技術鑒別不同紫花苜蓿品種的種子

倪浩然,王 潤,胡 昊,劉俊澤,田沛鑫,賈善剛

(中國農業大學草業科學與技術學院,北京 100193)

多光譜成像(Multispectral imaging,MSI)技術是一種新型的分析檢測技術,它將空間成像系統和光譜探測系統相結合,能夠同時獲取被測物的光譜和空間信息。該技術具有簡便易行、使用可靠、成本較低等優點,且不會對被測物造成破壞[1-3]。歸一化標準判別分析(Normalized canonical discriminant analysis,nCDA)是一種基于MSI變換的監督變換構建方法,能夠將圖像分割成具有不同光譜特征的感興趣區域,當兩個不同品種具有不同的光譜特征時,在nCDA變換后的圖像中,它們會表現為兩個不同的感興趣區域,更便于解釋和分割,以便進行后續數據分析[1]。Shrestha等[4]使用nCDA對11個番茄(SolanumlycopersicumL.)品種進行配對判別,正確識別率達到100%,只有少數幾個品種的識別率低于85%。王雪萌等[5]采用多光譜成像的無損檢測方法,成功地對紫花苜蓿硬實種子和非硬實種子進行了識別,準確率高達96.8%～99.0%。

抗壞血酸(Ascorbic acid,AsA)又稱維生素C,化學名為L-蘇糖型-六-2-烯醇-1內酯[6],植物體內有效的抗氧化劑和自由基清除劑,參與植物體內許多物質代謝和氧化還原反應,可以減少膜脂過氧化對細胞造成的傷害[7-10]。國內外許多研究表明,AsA有利于種子的萌發。如尚瑞廣等[11]發現,300 mg·L-1AsA處理的瑪咖(LepidummeyeniiWalp.)陳種子發芽率最高。Dolatabadian等[12]發現AsA對向日葵(HelianthusannuusL.)和油菜(BrassicanapusL.)種子萌發有顯著的促進作用。Zhao等[13]研究發現0.1 mmol·L-1AsA通過抑制過量的ROS產生、降低離子毒性和上調抗氧化系統來促進紫花苜蓿種子的萌發和誘導耐鹽性。

紫花苜蓿(Medicagosativa)為多年生豆科牧草,具有營養價值高、產量高、適應性好、抗逆性強等特點[14-15],在我國農業、畜牧業發展和生態環境保護中發揮著重要的作用[16],被稱為“牧草之王”[17]。目前,國內外使用多光譜技術來進行牧草種子尤其是紫花苜蓿種子品種區分的研究較少,且AsA含量與種子的多光譜參數間是否存在一定的關聯還未知。因此,本研究利用多光譜技術對25個不同紫花苜蓿品種的種子形態特征和光譜特征進行采集,同時結合nCDA算法,對不同品種種子的形態特征和光譜特征進行了分析,以期為多光譜成像技術在牧草品種識別領域的推廣應用提供一些思路。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

25個紫花苜蓿品種分別為：WL系列品種‘298’‘319’‘343’‘349’‘354’‘358’‘363’‘377’‘440’‘525’和‘712’,以及‘阿爾岡金’‘東苜2號’‘甘農1號’‘甘農9號’‘公農1號’‘驚喜’‘可汗’‘龍牧803’‘龍牧806’‘苜豐’‘中草3號’‘中蘭2號’和‘中苜1號’。WL系列種子由北京正道種子公司惠贈,其它苜蓿種子由育種單位與代理公司提供,或本實驗室保存。

1.2 多光譜信息采集

使用多光譜成像儀VideometerLab(Videometer A/S,Herlev,Denmark)來進行種子圖像信息的采集[18]。

在獲取種子的RGB圖像后,導出種子形態特征數據,包括面積(Area)、長度(Length)、寬度(Width)、長寬比(RatioWidthLength)、緊實度圓(Compactness Circle)、形狀參數(BetaShape)、顏色參數(CIELab)、飽和度(Saturation)、色調(Hue)等指標;然后在“statistic”模塊中導出種子的光譜特征數據,包括從種子圖像像素中計算的19個波長反射光的平均反射率[19]。

1.3 多光譜數據分析

利用VideometerLab中的MSI-Transformation Builder將形態特征差別最大的‘阿爾岡金’和‘WL377’分別標記為紅色和藍色,以此作為標準,依次輸出其余23個紫花苜蓿品種的nCDA圖像。

使用R語言中的factoextra包來進行k-means聚類分析。

1.4 發芽率與AsA含量測定與特征參數分析

各品種均采用紙上發芽,將種子以10×10擺放在發芽盒上,每個品種3次重復。參照《草種子檢驗規程發芽試驗》GB/T 2930.4-2017[20]進行操作,將培養箱溫度設置為恒溫20℃,模擬正常光照條件,發芽第10天測定發芽率。

種子發芽率=(末次計數時全部正常發芽粒數/供檢種子數)×100%。

使用蘇州科銘生物技術有限公司提供的還原型AsA含量測定試劑盒進行AsA含量的測定。

1.5 數據分析

使用IBM SPSS Statistics 26進行單因素方差分析(One-way ANOVA),使用R語言中的heatmap函數來繪制特征參數相關性熱圖。

2 結果與分析

2.1 不同品種紫花苜蓿種子的多光譜形態與光譜特征分析

利用不同品種種子的多光譜形態與光譜特征參數,繪制25個品種種子的折線圖(圖1)。選取差異較大的4個形態參數,進行25個品種的比較,結果顯示,與其他各品種相比,品種‘WL298’的飽和度、顏色參數A和顏色參數B差異較大,而其余各品種間也有一定區別(圖1a)。隨著波長的增加,光譜反射率呈上升趨勢,其中品種‘WL298’在365,405和430 nm三個波長下的光譜反射率與其他品種相比差異較大(圖1b)。其余各品種在各個波長下的光譜反射率也顯示出一定差異。

圖1 不同品種種子的多光譜形態與光譜特征參數Fig.1 MSI morphology and spectral data for seeds of 25 different varieties注：(a)不同品種紫花苜蓿種子的形態特征參數,從中選取顏色參數L、顏色參數A、顏色參數B、飽和度繪制折線圖;(b)不同品種紫花苜蓿種子的光譜特征參數Note：(Panel a) Morphological data for different alfalfa varieties seeds,“CIELab”and “Saturation”were selected;(Panel b) Spectral data for different alfalfa varieties seeds

2.2 不同品種紫花苜蓿種子的特征參數聚類分析

利用形態特征參數進行聚類,結果顯示6個國外WL系列品種(‘WL525’‘WL354’‘WL712’‘WL366’‘WL363’‘WL377’)被歸為一類(II),第Ⅲ類也偏向于國外品種。而品種‘WL298’被單獨歸為一類(I),這顯示其形態上的顯著不同(圖2a)。第Ⅳ類包括10個偏向于國內的品種。利用VideometerLab中的MSI-Transformation Builder輸出nCDA圖像,可以看到‘WL298’‘WL525’‘WL354’‘WL712’‘WL366’‘WL363’‘WL377’這幾個品種均顯示為均勻的藍色,其中品種‘WL298’的藍色則最為均勻,紅黃色種子則偏向于集中在第Ⅲ類和第Ⅳ類。

圖2 基于形態和光譜特征參數的聚類分析Fig.2 K-means clustering of morphological and spectral data注：(a)基于多光譜形態參數的聚類分析樹狀圖,外圈為各品種對應的nCDA圖像;(b)基于光譜特征參數的聚類分析樹狀圖,外圈為各品種對應的RGB圖像Note：(Panel a) K-means clustering of morphological data,the outer is the nCDA images corresponding to the tested individual varieties;(Panel b) K-means clustering of spectral data,the outer is the RGB images corresponding to the tested individual varieties

基于光譜特征進行聚類分析,結果顯示從‘驚喜’到‘龍牧806’的18個品種被歸為一大類(III),‘品種WL298’被單獨歸為一類(I)。雖然基于形態聚類結果沒有將一些品種區分開,如品種‘WL349’和‘甘農1號’‘東苜2號’,但是它們在光譜聚類中能夠區分。這說明,結合形態參數和光譜參數,可以將本實驗25個品種區分開。此外,除品種‘WL298’外,各品種種子的RGB圖像差別不大,無法從肉眼上進行區分。

2.3 不同品種紫花苜蓿種子的發芽結果與AsA含量

比較各品種種子發芽率,我們發現有14個品種的發芽率都在90%以上,僅有‘阿爾岡金’的發芽率低于80%(圖3a)。經過相關性分析后發現,發芽率與各個參數間的相關性很低。

比較各品種種子的AsA含量,發現品種‘WL363’的AsA含量最高,為1 856.15 mg·g-1,‘苜豐’的AsA含量最低,為845.41 mg·g-1(圖3b)。

圖3 不同品種發芽率及AsA含量Fig.3 Germination rate and AsA content of 25 different varieties注：(a)各品種紫花苜蓿種子正常萌發第十天發芽率;(b)各品種紫花苜蓿種子AsA含量。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)Note：(Panel a) Germination rate for different alfalfa varieties seeds on the tenth day;(Panel b) AsA content of alfalfa seeds of different varieties.Different lowercase letters indicate a significant difference at the 0.05 level

2.4 特征參數相關性分析

對AsA含量和形態、光譜特征參數分別進行相關性分析,繪制出參數相關性的熱圖(圖4)。AsA含量與形狀參數a、形狀參數b、長寬比以及緊實度呈一定的負相關關系,相關系數分別為-0.59,-0.58,-0.67,-0.68,而與其余形態特征參數則有一定的正相關關系,但相關性較弱(圖4a)。另外,各個形態參數之間存在一定的相關性,在熱圖中大致分為三個區域。與此同時,AsA含量與光譜特征參數的相關性較弱,而各波長下的光譜反射率之間存在一定相關性,也同樣被分為三個區域(圖4b)。

圖4 特征參數相關性分析熱圖Fig.4 Heat map for correlation analysis注：(a)AsA含量與形態特征參數相關性分析熱圖;(b)AsA含量與光譜特征參數相關性分析熱圖Note：(Panel a) Heat map for correlation analysis between AsA content and morphological data;(Panel b) Heat map for correlation analysis between AsA content and spectral data

3 討論

種子因外表氧化,不同儲存年限的種皮顏色會呈現一定區別,年份較遠的種子會因為氧化問題而顏色變暗,失去光澤,從而飽和度降低[21]。這可能是導致‘WL298’飽和度低于其他品種的原因。此外,CIELab顏色參數是一種由國際照明委員會推薦的用于檢驗顏色的指標,其中L*表示亮度,a*表示由綠到紅,b*表示由藍到黃[22]。該參數可以區分人眼不能察覺的顏色變化,從而消除視覺上的主觀性[23]。在本研究中,‘WL298’的CIELab a*和CIELab b*與其他品種相比差別較大,與輸出的RGB圖像結果基本一致。而其余各品種的形態參數特征差別不明顯,用肉眼也無法對他們進行區分。在光譜特征方面,品種‘WL298’在365～450 nm波長下的光譜反射率高于其他品種,也極有可能是由于種皮顏色變灰、變白導致的[24]。

基于形態特征的聚類分析顯示,大多數的來自國外的紫花苜蓿WL品種(‘WL354’‘WL363’‘WL366’‘WL377’‘WL525’‘WL712’)被歸為一類,說明這幾個品種在形態特征上的相似度極高。另外第Ⅰ,Ⅱ,Ⅲ類偏向于國外品種,第Ⅳ類偏向于國內品種,說明國外品種與國內品種在形態特征上存在一定區別,以‘WL377’和‘阿爾岡金’為標準輸出的nCDA圖像也同樣說明了這一觀點。此外,不管是基于形態特征參數還是基于光譜特征參數,結果顯示‘WL298’都被單獨聚為一類,且它的RGB圖像也與其他品種具有較大差別,可以通過肉眼觀察得到,這個結果從一定程度上說明了利用多光譜成像技術對于特征差別較大的品種的區分比較準確。因此,以上結果表明利用多光譜成像技術來對不同品種進行鑒別具有一定的效果。

許多研究表明,外源施加AsA能夠提高種子在逆境條件下的發芽率[25-30]。對不同苜蓿品種的發芽率與其內在AsA的含量進行了測定,結果顯示兩者相關性不強,可能是由于各種子貯藏年限不盡相同所導致的。對不同品種的種子內在AsA含量和形態、光譜特征參數進行了相關性分析,結果顯示AsA含量與部分形態特征參數的相關性大于與光譜特征參數的相關性。在植物中,AsA由L-半乳糖通過Smirnoff-Wheeler途徑合成[31]。Mario等[32]的研究表明,AsA濃度與組織類型和環境密切相關,尤其是光照強度。但是對AsA含量與種子多光譜形態、光譜特征參數是否有關聯的研究甚少。在形態特征參數中,形狀參數a表示通過多光譜成像儀獲取種子圖像后計算并輸出β橢圓擬合的參數a,對應于種子形狀中最尖銳部分的寬度;而形狀參數b則對應最粗鈍部分的寬度[19]。緊實度圓代表種子面積與相同長度的圓的面積之比。本研究的結果顯示AsA含量與種子的形狀參數a、形狀參數b、長寬比以及緊實度圓有一定的負相關關系,且相關性較強,但具體原因仍不清楚,后續可以進行深入研究。

不同品種的牧草種子在肉眼上難以區別,傳統的對于品種進行鑒別的方法通常包括蛋白質指紋圖譜鑒定和化學鑒定法等[33-34]。這些方法主要是基于種子的化學、物理以及生物學特性來進行鑒定[35],但是往往耗費時間長、成本高,而且這些方法會破壞種子的完整性。王芳等[36]利用太赫茲時域光譜(THz-TDS)技術對豆科牧草種子進行鑒定識別,結果表明該技術結合統計分析方法可以作為無損鑒定牧草種子真偽和識別牧草種子種類的一種有效手段,但該技術目前缺少一個標準數據庫。駱坤蘭[37]建立了基于高光譜成像技術的甜瓜(CucumismeloL.)種子識別模型,識別準確率達98%以上,但高光譜成像技術成本較高。因此,對于種子行業來說,發展一種通量高、無損、省時、成本低且準確率高的檢測技術極為重要,本研究的結果表明,多光譜成像檢測技術的應用將是一個極具潛力的發展方向。

4 結論

利用多光譜成像技術,結合形態和光譜特征參數,能夠在一定程度上將不同品種的牧草種子區分開,因此具有很大的研究潛力。此外,種子抗壞血酸含量與部分形態特征參數存在一定的相關性,后續可以對相關機理進行更深入的研究。