氮引發對白羊草種子抗氧化性能的影響

李尹琳,趙慶華,夏方山,王 勃,曾 佳

(山西農業大學草業學院,山西 太谷 030801)

氮素是植物生長發育所必需的大量營養元素[1],其水平高低直接決定著植物的產量和質量的高低[2]。沉降到土壤中的大氣氮素是植物中氮素的主要來源[3-5]。氮沉降的強度不僅會影響草地植被的蓋度和豐富度[6],還會影響草地土壤的理化性質及物質循環,從而影響到整個草地生態系統的多樣性和穩定性[7-8]。研究發現,氮沉降能夠提高草地生態系統的生產力[9],促進其生物量的積累[10]。此外,氮沉降還能促進草地植物種子的萌發及生長發育[11],提高草地植物的種子質量,對禾本科植物的影響尤為明顯[12-13]。然而,過量的氮沉降則會造成草地土壤出現“氮飽和”現象,使土壤pH值降低而嚴重酸化,最終造成草地植被的生產力下降[14-15]。目前,氮沉降對草地的影響研究主要集中在草地生態系統、植被多樣性及植物種子繁殖等方面,但關于氮沉降對草地植物種子的抗氧化性能有何影響尚不清楚,因而無法系統揭示氮沉降對草地植物種子萌發及適應性的內在機理。

白羊草(Bothriochloaischaemum)是禾本科孔穎草屬的多年生優質牧草,其根系發達,適應性廣,具有耐貧瘠、抗寒、抗旱等優良特性[16]。白羊草群落是我國暖性灌草叢類草地的中旱生草本群落[17],也是黃土高原丘陵地區草地群落的建群種和優勢種[18],因具有保持水土的特性在維護區域生態景觀和保持生態質量等方面發揮著不可或缺的作用[19-20]。山西省白羊草資源豐富,分布面積占到了草地總面積的36%以上,是山西省發展草牧業的重要優質飼草資源和生態草資源,因而白羊草種子的需求量逐年增長[21-22]。氮素作為植物生長所必須的元素,對白羊草的生長發育也有很大的影響,但不同植物對于氮素的需求量存在差異[23]。因此,本研究以白羊草種子為試驗材料,探討不同硝酸銨濃度模擬氮沉降對其抗氧化性能的影響,為進一步了解白羊草種子萌發所需的最佳氮素水平提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試草種為‘太行’白羊草,種子由山西農業大學牧草種子試驗室于2019年10月收集,并密封保存于-20℃條件下至2021年3月試驗進行。種子正常發芽率在65%左右。

1.2 試驗設計

1.2.1引發處理 將均勻飽滿的白羊草種子在25℃黑暗條件下分別浸入濃度為0,70,140,280和1 120 mmol·L-1的NH4NO3溶液中0(CK),3,6,9和12 h后,用蒸餾水快速沖洗3次,并用濾紙吸干其表面水分后,25℃黑暗條件下自然風干2 d。每個處理設4次重復,每個重復約1.0 g種子。

1.2.2生理指標測定 粗酶液按照Kibinza等[19]的方法提取,上清液在4℃下保存備用。超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)活性參照Rao等[20]的方法測定;谷胱甘肽還原酶(Glutathione reductase,GR)活性參照Madamanchi等[21]的方法測定;抗壞血酸過氧化物酶(Ascorbate peroxidase,APX)活性參照Nakano等[22]的方法測定;過氧化氫酶(Catalase,CAT)活性參照Clairbone[23]的方法測定;丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量參照Bailly等[24]的方法測定;可溶性蛋白質含量采用考馬斯亮藍法測定,所用試劑盒購于南京建成科技有限公司。

1.3 數據處理與分析

采用Excel 2010處理數據,采用SPSS 23.0統計分析軟件進行方差分析,用Duncan’s法進行多重比較(P=0.05),結果用平均值±標準誤表示。

2 結果與分析

2.1 外源氮引發對白羊草種子超氧化物歧化酶活性的影響

由表1可知,引發時間相同時,白羊草種子SOD活性隨著NH4NO3濃度的增加呈現先升高后降低的趨勢,引發3～6 h時,白羊草種子SOD活性在NH4NO3濃度140 mmol·L-1時顯著高于其他濃度(P<0.05);引發9～12 h時,白羊草種子SOD活性在NH4NO3濃度70～140 mmol·L-1時顯著高于其他濃度(P<0.05)。NH4NO3濃度為0 mmol·L-1時,白羊草種子SOD活性在引發3時顯著高于其他引發時間(P<0.05);NH4NO3濃度為70 mmol·L-1時,白羊草種子SOD活性在引發3 h～9 h時顯著高于其他引發時間(P<0.05);NH4NO3濃度為140 mmol·L-1時,白羊草種子SOD活性在引發3～6 h時顯著高于其他引發時間(P<0.05);NH4NO3濃度為280 mmol·L-1時,白羊草種子SOD活性在引發3～6 h時顯著高于引發9～12 h(P<0.05);NH4NO3濃度為1 120 mmol·L-1時,白羊草種子SOD活性在3～12 h時顯著低于CK(P<0.05)。在NH4NO3濃度為140 mmol·L-1引發6 h時,白羊草種子SOD活性最高。

表1 氮引發對白羊草種子超氧化物歧化酶活性的變化Table 1 Changes of superoxide dismutase activities of Bothriochloa ischaemum seeds with nitrogen primings 單位：U·mg-1 protein

2.2 外源氮引發對白羊草種子谷胱甘肽還原酶活性的影響

由表2可知,引發時間相同時,白羊草種子GR活性隨著NH4NO3濃度的增加呈現先升高后降低的趨勢,引發3～12 h時,白羊草種子GR活性在NH4NO3濃度為140 mmol·L-1時最高,在NH4NO3濃度為1 120 mmol·L-1時顯著低于其他濃度(P<0.05)。NH4NO3濃度為0～70 mmol·L-1時,白羊草種子GR活性在引發12 h時最低;NH4NO3濃度為140～280 mmol·L-1時,白羊草種子GR活性在引發6 h時顯著高于其他引發時間(P<0.05);NH4NO3濃度為1 120 mmol·L-1時,白羊草種子GR活性在3～12 h時顯著低于CK(P<0.05)。在NH4NO3濃度為140 mmol·L-1引發6 h時,白羊草種子GR活性最高。

表2 氮引發對白羊草種子谷胱甘肽還原酶活性的變化Table 2 Changes of glutathione reductase activities of B. ischaemum seeds with nitrogen primings 單位：U·L-1 protein

2.3 外源氮引發對白羊草種子抗壞血酸過氧化物酶活性的影響

由表3可知,引發時間相同時,白羊草種子APX活性隨著NH4NO3濃度的增加呈現先升高后降低的趨勢,引發3～12 h時,白羊草種子APX活性在NH4NO3濃度為140 mmol·L-1時顯著高于其他濃度(P<0.05)。NH4NO3濃度為0 mmol·L-1時,白羊草種子APX活性在引發9 h時最高;NH4NO3濃度為70 mmol·L-1時,白羊草種子APX活性在引發3 h時顯著高于其他引發時間(P<0.05);NH4NO3濃度為140 mmol·L-1時,白羊草種子APX活性在引發6 h時顯著高于其他引發時間(P<0.05);NH4NO3濃度為280 mmol·L-1時,白羊草種子APX活性在引發3 h時最高;NH4NO3濃度為1 120 mmol·L-1時,白羊草種子APX活性在3～6 h時顯著高于其他引發時間(P<0.05)。在NH4NO3濃度為140 mmol·L-1引發6 h時,白羊草種子APX活性最高。

表3 氮引發對白羊草種子抗壞血酸過氧化物酶活性的變化Table 3 Changes of ascorbate peroxidase activities of B. ischaemum seeds with nitrogen primings 單位：U·min-1·mg-1 protein

2.4 外源氮引發對白羊草種子過氧化氫酶活性的影響

由表4可知,引發時間相同時,白羊草種子CAT活性隨著NH4NO3濃度的增加呈現先升高后降低的趨勢,引發3～12 h時,白羊草種子CAT活性在NH4NO3濃度為140 mmol·L-1時最高。NH4NO3濃度為0 mmol·L-1時,白羊草種子CAT活性在引發0～6 h時顯著高于其他引發時間(P<0.05);NH4NO3濃度為70 mmol·L-1時,白羊草種子CAT活性在引發3～6 h時顯著高于其他引發時間(P<0.05);NH4NO3濃度為140 mmol·L-1時,白羊草種子CAT活性在引發6 h時顯著高于其他引發時間(P<0.05);NH4NO3濃度為280 mmol·L-1時,白羊草種子CAT活性在引發3 h時顯著高于0 h和9～12 h(P<0.05);NH4NO3濃度為1 120 mmol·L-1時,白羊草種子CAT活性在0～3 h時顯著高于其他引發時間(P<0.05)。在NH4NO3濃度為140 mmol·L-1引發6 h時,白羊草種子CAT活性最高。

表4 氮引發對白羊草種子過氧化氫酶活性的變化Table 4 Changes of catalase activities of B. ischaemum seeds with nitrogen primings 單位：U·min-1·mg-1 protein

2.5 外源氮引發對白羊草種子丙二醛含量的影響

由表5可知,引發時間相同時,白羊草種子MDA含量隨著NH4NO3濃度的增加呈現先降低后升高的趨勢,引發3～12 h時,白羊草種子MDA含量在NH4NO3濃度為140 mmol·L-1時最低。NH4NO3濃度為0 mmol·L-1時,白羊草種子MDA含量在引發12 h時顯著高于0～6 h(P<0.05);NH4NO3濃度為70 mmol·L-1時,白羊草種子MDA含量在引發3 h時顯著低于其他引發時間(P<0.05);NH4NO3濃度為140 mmol·L-1時,白羊草種子MDA含量在引發3 h～9 h時顯著低于其他引發時間(P<0.05);NH4NO3濃度為280 mmol·L-1時,白羊草種子MDA含量在引發3 h～6 h時顯著低于其他引發時間(P<0.05);NH4NO3濃度為1 120 mmol·L-1時,白羊草種子MDA含量在引發9 h～12 h時顯著高于其他引發時間(P<0.05)。在NH4NO3濃度為140 mmol·L-1引發6 h時,白羊草種子MDA含量最低。

表5 氮引發對白羊草種子丙二醛含量的變化Table 5 Changes of malondialdehyde contents of B. ischaemum seeds with nitrogen primings 單位：nmol·g-1 protein

3 討論

研究發現,植物種子的萌發及其幼苗生長發育均需要其內部各種酶的參與[30],因而適度的氮沉降不僅能促進草地植物的生長發育,還能改善草地植物的多樣性,最終可提高草地植物的生物量[31-32]。抗氧化酶作為植物體內清除活性氧(Reactive oxygen species,ROS)自由基的重要逆境保護系統[33],其活性高低直接決定著植物細胞應對逆境脅迫能力的強弱,對植物種子的萌發及幼苗生長具有重要作用。本研究中,在低濃度(≤140 mmol·L-1)氮引發下,白羊草種子SOD,GR,APX和CAT活性顯著上升(P<0.05),而其MDA含量顯著下降(P<0.05),這說明適宜濃度的氮引發使白羊草種子膜透性減弱,減少細胞膜損傷,促進白羊草種子萌發生長。這與喬旭等[34]研究在純硝營養下增加銨營養,小麥(Triticumaestivum)的抗氧化性能提高,從而促進其生長的結論相似。在高濃度(≥280 mmol·L-1)氮引發下,白羊草種子SOD,GR,APX和CAT活性顯著下降(P<0.05),而MDA含量顯著上升(P<0.05),這可能是由于高濃度氮引發使細胞產生滲透脅迫,細胞內ROS的積累加快,ROS的動態平衡被打破,細胞脂質過氧化程度增強[35]。因此,本研究表明,NH4NO3濃度為140 mmol·L-1時,白羊草種子抗氧化能力強,而NH4NO3濃度為1 120 mmol·L-1時,白羊草種子抗氧化能力弱。

在氮引發濃度相同時,引發時間對白羊草種子的抗氧化性能也有作用。本研究表明,除NH4NO3濃度為0 mmol·L-1和1 120 mmol·L-1時外,隨著引發時間的延長,白羊草種子SOD,GR,APX和CAT活性先升高后降低,MDA含量呈現先降低后升高的趨勢,這說明適度的引發時間能夠幫助植物清除體內產生的ROS,修復細胞膜,而引發時間過長,白羊草種子細胞內抗氧化系統遭到強烈破壞,產生的ROS不能得到有效處理,脂質過氧化嚴重[22,36]。這與前人在紫花苜蓿(Medicago sativa)[37]、燕麥(Avenasativa)[38]等種子的研究中的試驗結論相似。而NH4NO3濃度為0 mmol·L-1時,隨著引發時間的延長,白羊草種子SOD和APX活性先升高后降低,GR和CAT活性逐漸降低,MDA含量逐漸升高,說明在低濃度時,短時間內GR和CAT在抗氧化系統中起主要清除作用。NH4NO3濃度為1 120 mmol·L-1時,隨著引發時間的延長,白羊草種子SOD,GR和CAT活性逐漸降低,APX活性先升高后降低,MDA含量逐漸升高,說明在高濃度時,短時間內SOD,GR和CAT在抗氧化系統中起主要清除作用,而長時間的引發,白羊草種子抗氧化能力越弱,脂質過氧化程度越嚴重,影響其萌發[22]。本研究表明,白羊草種子在引發12 h時,白羊草種子抗氧化能力弱。綜上所知,濃度為1 120 mmol·L-1引發12 h時白羊草種子抗氧化能力最弱。因此,過量的氮引發會使白羊草種子抗氧化性能降低,從而抑制草地植物種子的萌發及生長發育。

4 結論

氮引發對白羊草種子抗氧化性能的影響與其濃度和引發時間均有密切關系。濃度≤140 mmol·L-1時的氮引發白羊草種子時,SOD,GR,APX和CAT活性顯著升高(P<0.05),而MDA含量顯著下降(P<0.05);濃度≥280 mmol·L-1時的氮引發時則相反。濃度為140 mmol·L-1的NH4NO3溶液引發6 h時,白羊草種子的抗氧化性能最好,而濃度為1 120 mmol·L-1引發12 h時則最弱。因此,140 mmol·L-1的NH4NO3溶液引發6 h是提高白羊草種子抗氧化性能的最佳處理,可能會有利于白羊草種子的萌發及生長發育。