不同品種紫花苜蓿種子萌發期耐低溫性綜合評價

張 昭,金琪凡,史彥欣,段曉桐,閆慧芳*

(1.青島農業大學草業學院,山東 青島 266109;2.黃河三角洲草地資源與生態國家林業和草原局重點實驗室,山東 青島 266109;3.青島市灘涂鹽堿地特色植物種質創制與利用重點實驗室,山東 青島 266109)

種子萌發是植物整個生命周期中最關鍵的階段,也是對環境因子響應最敏感的時期[1]。作為種子萌發過程的重要環境因子,溫度影響了大部分的種子萌發相關生理生化反應事件[2-3]。低溫冷害是常見于晚秋或早春的主要農業氣象災害[4],也是植物生命周期中極易遭受的非生物脅迫因子,嚴重限制了植物的地理分布、生長發育和產量[5-6]。當溫度低于種子萌發適宜溫度時,種子萌發受到抑制,萌發速率減慢,種子活力和幼苗生長特性均受到一定程度影響[7]。

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是世界上栽培歷史最悠久、種植面積最大的重要豆科牧草,具有適應范圍廣,產草量高,蛋白質、維生素和礦物質等營養物質豐富等特性[8]。在我國,紫花苜蓿主要栽培區域集中在北方地區,且通常于晚秋或早春季節播種,但由于溫度低及倒春寒現象,致使其因種子萌發緩慢、出苗率低而制約田間成功建植,進而影響其產量和品質[9]。此外,不同品種紫花苜蓿種子的萌發特性及萌發期對低溫的抵抗能力也存在差異[10]。近年來,盡管紫花苜蓿種子的低溫萌發和幼苗生長特性已被研究報道[7-13],但關于不同品種種子對低溫脅迫萌發響應的差異比較與綜合評價還較少。因此,深入探究紫花苜蓿種子在低溫條件下的萌發和幼苗生長特性,據此綜合比較并評價不同品種種子的耐低溫萌發能力,對其田間播種、成功建植、栽培生產十分重要,也對其適應性品種篩選、推廣及人工草地擴大種植具有重要指導意義。

本研究以22個品種紫花苜蓿種子為試驗材料,通過測定各品種在標準發芽溫度(20℃)和低溫(10℃)下的種子發芽勢、發芽率、苗長、根長等9個種子萌發和幼苗生長特性相關指標,分析比較不同品種紫花苜蓿種子萌發和幼苗生長對低溫脅迫的響應差異,并對不同品種種子萌發期的耐低溫性進行綜合評價,以期為紫花苜蓿耐低溫種質篩選、低溫響應基因挖掘以及耐低溫新品種培育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試紫花苜蓿種子材料包括22個品種,于2020年收獲后均保存于—20℃冰箱內備用(表1)。本試驗于2022年11月—2023年2月在青島農業大學草業學院實驗室進行。

表1 22個供試紫花苜蓿品種基本信息Table 1 Basic information of the 22 tested alfalfa varieties

1.2 試驗設計與方法

本試驗設置標準發芽溫度(20℃,即對照CK)和低溫脅迫(10℃)兩種處理對上述22個品種的紫花苜蓿種子進行萌發試驗與幼苗生長特性測定。挑選均勻飽滿、大小一致的紫花苜蓿種子50粒,將其均勻放置于鋪有3層濾紙的11 cm×11 cm有蓋培養皿中,濾紙用10 mL蒸餾水潤濕,每個處理設3次重復。將培養皿置于光照培養箱(GXZ-380B)中,分別在20℃和10℃、光照8 h/黑暗16 h條件下培養10 d。種子萌發期間,每天觀察統計種子發芽和幼苗生長情況,并定時補充蒸發散失的水分,以維持種子萌發和幼苗生長所需。

1.3 指標測定

以胚根突破種皮至少2 mm作為種子萌發標準,以正常種苗形態建成作為成苗標準,每天觀察統計種子萌發和成苗情況。根據每天種子萌發和成苗統計,分別于第4 d計算種子發芽勢(Germination energy,GE)、第10 d計算種子發芽率(Germination percentage,GP)和成苗率(Seedling percentage,SP)。待第10 d發芽結束后,每個培養皿隨機選取10株正常種苗,用刻度尺測定苗長(Shoot length,SL)和根長(Root length,RL),并用天平稱量幼苗鮮重(Seedling fresh weight,SFW)。此外,計算種子發芽指數(Germination index,GI)、種子活力指數(Vigor index,VI)和幼苗活力指數(Seedling vigor index,SVI)。

發芽勢(GE)=(N4/N)×100%

發芽率(GP)=(N10/N)×100%

成苗率(SP)=(G10/N)×100%

種子發芽指數(GI)=∑(Nt/Dt)

種子活力指數(VI)=(∑Nt/Dt)×SFW

幼苗活力指數(SVI)=(SL+RL)×SP

上述公式中,N4和N10分別為第4 d和第10 d統計時的萌發種子數,G10為第10 d統計時的正常種苗數,N為供試種子總數,Nt為第td統計時的萌發種子數,Dt為萌發天數。

1.4 耐低溫性綜合評價

采用耐冷系數(Cold tolerance coefficient,CTC)、綜合耐冷系數(Comprehensive cold tolerance coefficient,CCTC)、隸屬函數、系統聚類分析的綜合評價方法[14]對22個供試品種紫花苜蓿種子萌發期耐低溫性進行評價。

耐冷系數(CTC)=低溫脅迫條件的指標平均值/常溫條件的指標平均值

參考韓瑞宏等[15]的方法,以供試品種各指標測定值為依據,采用隸屬函數法對22個品種紫花苜蓿種子萌發期耐低溫性進行綜合評價。同時,基于綜合耐冷系數和隸屬函數值,采用歐氏距離中的組間連接法進行系統聚類分析。

μ(Xi)=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin),i=1,2,3……n

式中,μ(Xi)為某一測定指標的模糊隸屬函數值平均值;當指標與種子萌發耐低溫性成負相關時用1-μ(Xi)表示;X為某一測定指標平均值;Xmax和Xmin分別為某一測定指標的最大值和最小值。再將各品種種子的各測定指標隸屬函數值累加,求隸屬函數平均值,值越大表示紫花苜蓿種子萌發期耐低溫性越強。

1.5 數據統計與分析

采用Microsoft Excel 2021軟件進行數據整理,SPSS 25.0軟件進行顯著性統計分析與聚類分析。所有數值均以3個重復的“平均值±標準誤”(Mean±SE)表示,并用單因素方差分析(ANOVA)檢驗計算相關參數。

2 結果與分析

2.1 不同品種紫花苜蓿種子萌發期耐低溫性的差異比較分析

相比于CK,低溫脅迫后各項測定指標的平均值均有所下降,且在不同品種間存在明顯差異,達到極顯著水平(P<0.01),說明低溫脅迫對紫花苜蓿種子萌發和幼苗生長特性所有測定指標影響顯著。

標準萌發溫度下各測定指標的變異系數范圍為2.16%～19.49%,而低溫脅迫下各測定指標的變異系數范圍為2.38%～20.72%,表明不同測定指標所受低溫脅迫的抑制程度存在差異。低溫脅迫下,紫花苜蓿種子活力指數與幼苗活力指數所受影響較大,下降幅度分別為69.05%和63.55%,而種子發芽勢與發芽率所受影響較小,下降幅度分別為4.15%和1.08%(表2)。基于此,不同品種紫花苜蓿種子萌發期的耐低溫性存在差異,可進一步利用其他統計分析方法對其進行分析與綜合評價。

表2 不同品種紫花苜蓿種子各測定指標相關統計參數Table 2 Statistical parameters related to various measured indicators of different varieties of alfalfa seeds

2.2 不同品種紫花苜蓿種子萌發期測定指標的耐冷系數分析

根據CK和低溫脅迫條件下各測定指標值,計算各品種測定指標的耐冷系數和綜合耐冷系數。結果發現,各品種紫花苜蓿種子萌發期對低溫脅迫的耐受程度不同,其中‘賽迪10號’的綜合耐冷系數最大,為0.683;而‘英斯特’的綜合耐冷系數最小,為0.523,且各項測定指標的耐冷系數值也均小于‘賽迪10號’,表明‘賽迪10號’種子萌發期耐低溫性最強,而‘英斯特’種子萌發期耐低溫性最弱(表3)。

表3 不同品種紫花苜蓿種子各測定指標的耐冷系數Table 3 Cold tolerance coefficient of various measured indicators of different varieties of alfalfa seeds

2.3 不同品種紫花苜蓿種子萌發期測定指標的隸屬函數分析

以供試品種各指標測定值為依據,計算各品種測定指標的隸屬函數,以比較22個品種紫花苜蓿種子萌發期的耐低溫性差異。其中,隸屬函數平均值越大,說明種子萌發期的耐低溫性越強。結果發現,低溫脅迫后,‘賽迪10號’各測定指標的隸屬函數平均值最大,為0.789,而‘英斯特’‘金皇后’‘巨能401’各測定指標的隸屬函數平均值最小,分別為0.318,0.313,0.313,表明‘賽迪10號’種子萌發期耐低溫性最強,而‘英斯特’‘金皇后’‘巨能401’種子萌發期耐低溫性較弱(表4)。

表4 不同品種紫花苜蓿種子各測定指標的隸屬函數Table 4 Membership functions of various measured indicators of different varieties of alfalfa seeds

2.4 紫花苜蓿種子萌發期耐低溫性綜合評價

根據綜合耐冷系數,通過系統聚類分析將22個供試品種紫花苜蓿種子萌發期耐低溫性劃分為4個類型,其中,強耐低溫性品種1個,占供試品種的4.55%,為‘賽迪10號’;中耐低溫性品種11個,占供試品種的50.00%;弱耐低溫性品種7個,占供試品種的31.82%;低溫敏感性品種3個,占供試品種的13.64%,為‘金皇后’‘巨能995’和‘英斯特’(圖1A)。

根據隸屬函數,通過系統聚類分析將22個供試品種紫花苜蓿種子萌發期耐低溫性劃分為4個類型,其中,強耐低溫性品種1個,占供試品種的4.55%,為‘賽迪10號’;中耐低溫性品種6個,占供試品種的27.27%;弱耐低溫性品種11個,占供試品種的50.00%;低溫敏感性品種4個,占供試品種的18.18%,為‘巨能995’‘金皇后’‘巨能401’和‘英斯特’(圖1B)。

圖1 基于綜合耐冷系數(A)與隸屬函數(B)的系統聚類分析Fig.1 Cluster analysis based on comprehensive cold tolerance coefficient (Panel A) and membership function (Panel B)注：類型Ⅰ,強耐低溫性;類型Ⅱ,中耐低溫性;類型Ⅲ,弱耐低溫性;類型Ⅳ,低溫敏感性Note：Type Ⅰ,strong low temperature tolerance;Type Ⅱ,medium low temperature tolerance;Type Ⅲ,weak low temperature tolerance;Type Ⅳ,low temperature sensitivity

因此,根據各品種測定指標的綜合耐冷系數(表3)和隸屬函數(表4),結合聚類分析結果,將供試紫花苜蓿種子萌發期相對耐低溫等級劃分為4類,分別為強耐低溫性、中耐低溫性、弱耐低溫性和低溫敏感性(表5)。

表5 供試紫花苜蓿種子萌發期相對耐低溫等級劃分Table 5 Classification of relative low temperature tolerance of different varieties of tested alfalfa during seed germination

基于綜合耐冷系數與隸屬函數兩種評價方法,以結果中重復出現(即在兩種評價方法中均被鑒定到)為依據進行綜合評價,篩選出強耐低溫性品種1個,為‘賽迪10號’;低溫敏感性品種3個,為‘金皇后’‘巨能995’和‘英斯特’。然而,進一步分析發現,低溫敏感性品種中,‘英斯特’的綜合耐冷系數值最低(為0.523),且其種子萌發與幼苗生長特性各項指標的隸屬函數平均值與‘巨能995’‘金皇后’相差不大,因此,確定紫花苜蓿種子萌發期的低溫敏感性品種為‘英斯特’。

3 討論

種子萌發是植物生長發育的起始階段,也是整個生命周期中最關鍵的時期[16]。種子萌發不僅與種子本身的生物學特性有關,還與周圍環境(如水分、氧氣和溫度等)密切相關。溫度是影響種子萌發的關鍵環境因素,適宜溫度下,種子吸脹速率和萌發進程較快,而溫度過低則會導致種子吸脹速率減慢,萌發進程受阻[17]。研究表明,發芽勢、發芽率、發芽指數、活力指數、簡化活力指數、根長、苗長、可溶性糖、淀粉等指標可以反映紫花苜蓿種子在低溫脅迫下的種子活力和幼苗生長特性[10-11,18-19]。本研究利用發芽勢、發芽率、發芽指數、種子活力指數、成苗率、苗長、根長、幼苗鮮重和幼苗活力指數9個指標進行紫花苜蓿種子萌發期耐低溫性綜合評價,結果發現,各項測定指標的平均值在低溫脅迫下均有所下降,且在不同品種間的差異均達到極顯著水平(表2),表明這些指標能夠全面地反映不同品種紫花苜蓿種子萌發期對低溫脅迫的耐受性差異,可以提高鑒定結果的可靠性。

研究表明,低溫脅迫導致紫花苜蓿種子發芽率顯著降低,發芽時間延長,幼苗生長緩慢,細胞生理代謝受阻[20-22]。向上等[23]研究20個品種紫花苜蓿種子在4℃和8℃低溫脅迫下的萌發特性也發現,各品種種子的發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數及苗長均顯著降低,發芽時間延長。本研究中,低溫脅迫下22個品種紫花苜蓿種子各項萌發相關測定指標的平均值均低于CK的平均值,且在品種間的下降程度不同,其中種子活力指數和幼苗活力指數變化較大,而發芽勢與發芽率變化較小,這可能是因為低溫下種子生理代謝活動受到抑制,正常幼苗形態建成受阻,說明低溫脅迫對不同品種種子的萌發和幼苗生長相關指標的抑制作用存在差異(表2)。此外,種子發芽勢的高低表征了種子萌發過程中發芽種子數達到高峰的快慢。本研究中,低溫脅迫導致不同品種紫花苜蓿種子的發芽勢明顯降低,表明發芽高峰期隨溫度降低而延后。王曉龍等[10]研究發現,紫花苜蓿種子萌發時對低溫脅迫具有一定耐受作用,且6℃為其種子萌發的轉折點,溫度過低可能會因種子呼吸作用、貯藏物質分解代謝等生理活動減弱而抑制種子萌發[12]。盡管前人研究曾采用4℃或10℃作為紫花苜蓿種子萌發的低溫脅迫處理溫度[11-12,18,20,23-24],但事實上,在4℃溫度條件下種子僅能露白萌發,而不能完成正常幼苗的形態建成(預試驗結果,未發表)。因此,本研究選用10℃作為紫花苜蓿種子響應低溫脅迫的處理溫度,且該溫度對不同品種的成苗率和幼苗活力指數影響較大,植株生長較弱,這與高茜等[20]研究結果相一致。

種子萌發期對低溫脅迫的響應受多種因素影響,單一指標難以真實地反映出種子的耐低溫萌發能力,因此,需采用適宜的測定指標和多元評價方法進行綜合分析,以提高結果準確性[11]。賈祥等[18]利用隸屬函數法綜合評價了4種豆科牧草種子萌發期對低溫脅迫的響應,向上等[23]利用打分法對低溫脅迫下20個品種紫花苜蓿種子的發芽特征進行綜合評價,而侯龍魚等[12]則采用主成分分析法對6個品種紫花苜蓿種子的耐低溫萌發能力進行評價與篩選。本研究基于綜合耐冷系數和隸屬函數方法對22個品種紫花苜蓿種子萌發期的耐低溫性進行了綜合評價,初步確定‘賽迪10號’為強耐低溫性品種、‘英斯特’為低溫敏感性品種。實際生產中,仍需進一步在晚秋或早春季節對篩選的品種進行田間播種以驗證并加以利用。此外,針對強耐低溫性品種和低溫敏感性品種紫花苜蓿種子萌發期的不同階段進行測序分析,挖掘耐低溫關鍵候選基因,為紫花苜蓿種質遺傳改良與耐低溫新品種培育提供理論基礎。

4 結論

低溫脅迫下,22個供試紫花苜蓿品種的種子發芽勢、發芽率、發芽指數、種子活力指數、成苗率、苗長、根長、苗鮮重、幼苗活力指數均呈下降趨勢,其中種子活力指數和幼苗活力指數所受影響較大,而發芽勢和發芽率所受影響較小。基于綜合耐冷系數與隸屬函數進行系統聚類分析,將22個品種紫花苜蓿劃分為4個不同耐低溫類型,并篩選出強耐低溫性品種為‘賽迪10號’、低溫敏感性品種為‘英斯特’。