無芒雀麥和燕麥種子萌發過程中葉綠體光合變化

田沛鑫,宋 瑞,李超然,倪浩然,王 潤,劉 萍,張 涵,毛培勝,賈善剛

(中國農業大學草業科學與技術學院,北京100193)

光合作用是植物通過光反應和暗反應兩個階段,將太陽光能轉變為化學能,以維持植物生長發育的重要生物過程[1]。葉綠體是高等植物進行光合作用的場所,由葉綠體雙層被膜、葉綠體基質和類囊體構成。種子萌發是植物生命周期的起點,種子從土壤中萌發到破土的過程,伴隨著葉綠體從前質體到黃化質體,再到成熟葉綠體3個發育階段[2]。高等植物葉綠體的生物發生過程中伴隨著各種生理生化的變化,如光合色素的含量變化。光合色素位于葉綠體類囊體膜上,主要分為葉綠素、類胡蘿卜素和藻膽素三大類[3-4]。其中,在植物細胞對光能的捕捉過程中,葉綠素起主要作用,類胡蘿卜素(包括胡蘿卜素和葉黃素)和藻膽素則是對葉綠素捕獲光能的補充,又被稱為輔助色素。光合色素含量的高低代表著植物的光合能力,在一定程度上也代表著植物生長發育的狀態[5]。此外,葉綠素具有熒光現象,其熒光強弱與光合作用碳同化存在相關性,可以作為光合作用研究的重要指標[6]。葉綠素熒光儀基于葉綠素熒光效應,可用于測定植物光合熒光參數,包括：暗適應下最小熒光(Fo)、最大熒光(Fm)、PSII最大光化學量子產量(Fv/Fm)、光適應下PSII反應中心的實際光化學效率(ФPSII)、電子傳遞效率(Electron translate ratio,ETR)等[7-8]。

多光譜成像技術(Multispectral imaging,MSI)是一種表型組學研究工具,采用了LED濾波技術,組合測量多達20個不同波長并集成到1張高分辨光譜圖像中。VideometerLab4是常用的光譜成像設備,集成了照明、相機以及計算機技術,具有數字圖像分析以及數據統計能力,用于快速、有效測定生物材料表面顏色、質構、化學組分等[9-12]。該儀器可將植物內在特征轉換為不同的光譜信息,結合標準化典型判別分析(Normalized canonical discriminant analysis,nCDA)、線性判別分析、偏最小二乘判別分析和隨機森林等數學多元分析模型等,鑒定樣品之間的差異[11]。近年來,隨著多光譜成像技術的發展,MSI技術已經應用于植物和種子的表型及生理分析。紫花苜蓿(MedicagosativaL.)表型組學研究結果表明,MSI技術能夠高準確度識別和鑒定牧草種子的形態特征、判定種子的發芽率和生活力等質量指標[13-15]。Pan等研究成果表明多光譜成像可實現葉綠素a、b含量的無損鑒定[16]。因此,利用多光譜技術快速無損地分析植物表型、關聯研究植物生理生化指標的變化規律與響應特性,具有較高的應用前景。

葉綠體是光合作用主要場所,種子萌發過程中胚芽葉綠體的發育狀態對植株生長活力、結實和生物產量極其重要[17]。目前葉綠體發育相關研究多集中在模式植物擬南芥中,且對葉片葉綠體的關注較高,針對禾本科牧草胚芽葉綠體的研究極少。無芒雀麥(BromusinermisLeyss.)是一種多年生的禾本科草本植物,具有較強的抗旱、抗寒性[18-19]。無芒雀麥營養成分豐富,適口性好,家畜喜食,是一種優質牧草[20]。燕麥(AvenasativaL.)為一年生禾本科植物,作為一種古老的糧食作物,具有高蛋白、低碳水化合物等特點[21]。燕麥不但可以作為糧食作物,其籽實作為優質飼料還可用于飼喂雞、豬等家畜家禽[22-24]。因此,了解兩種不同的多年生禾本科牧草種子在萌發過程中胚芽葉綠體的發育,對提高牧草光合潛力和產量具有重要意義。本研究以無芒雀麥和燕麥為研究材料,通過模擬種子從黑暗土壤中破土并在光照下生長的過程,測定胚芽出土后光合色素含量和葉綠素熒光參數指標,分析兩種試驗材料在萌發過程中的表型變化,探究無芒雀麥和燕麥種子萌發過程中葉綠體光合變化和生物發生過程,為葉綠素熒光和多光譜成像技術在牧草種子萌發過程中葉綠體光合變化的相關研究中提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用的無芒雀麥品種為‘原野’,在2021年于河北承德市國營魚兒山牧場基地收獲。燕麥品種為‘挑戰者’,購買于BrettYoung公司,源于加拿大。無芒雀麥和燕麥種子發芽率分別為94%和99%,發芽勢為86%和92%,于中國農業大學牧草種子生理與生產實驗室貯藏6個月,貯藏溫度為25℃,濕度35%。

1.2 試驗設計

對無芒雀麥和燕麥種子進行出土預試驗,土壤基質配比為營養土∶蛭石=1∶1,種子播種于花盆內(直徑26 cm,高度23.5 cm),播種深度為2.5 cm,花盆放置于人工氣候培養室。預試驗結果表明,無芒雀麥和燕麥種子出土所需的時間分別是6天和5天,此結果用于后續的遮光處理。

采用培養皿發芽法,在10個方形培養皿(11.5 cm×11.5 cm)中放置3層濾紙作為種床,每個培養皿中放置50粒大小均勻一致的種子,將擺放好種子的培養皿分為兩組。為模擬種子胚芽出土前的黑暗生長條件,用錫紙將培養皿包裹兩層進行遮光處理,遮光時間按照預試驗中胚芽出土時間設置,遮光結束后揭開錫紙,代表種子出土,在光照8 h,黑暗16 h的光周期下繼續培養。光照第1天(E0h～E8h)每隔一定時間進行試驗測定,光照第2天到光照第4天(E2d～E4d)在上午10點和下午6點進行測定。

1.3 測定指標與方法

1.3.1發芽指標的測定 各取100粒大小均勻一致的無芒雀麥和燕麥種子,放置于方形培養皿(11.5 cm×11.5 cm)中,加入3層濾紙作為種床,用移液槍注入10 mL去離子水將濾紙濕潤,置于20℃恒溫培養箱中培養,每個處理設置4個重復。培養期間每天于固定時間點對發芽種子數進行統計,并根據規定計算種子的發芽勢和發芽率。

(1)

(2)

1.3.2多光譜成像系統數據采集 使用VideometerLab光譜成像設備,組合測量多個不同波長并集成到1張高分辨光譜圖像中,進行兩種試驗材料在萌發過程中的表型變化判定分析,對拍攝所得到的圖像進行歸一化典型判別分析(nCDA)、灰度圖分析和RGB分析。采集多光譜數據之前,需要針對不同光譜特征的種子,對指定樣品的光譜信息進行標準化,對不同光譜強度的感興趣區域進行標記和著色。本研究分別使用紅色和藍色對初始和最終的幼苗MSI圖像進行標準化,其他圖像采用Videometer軟件version 4中MSI-transformation Builder的nCDA函數進行相應的轉換[8]。

1.3.3種子萌發過程中光合色素含量的測定 揭開錫紙后以隨機重復的方式收集無芒雀麥胚芽,稱重記錄,設置3個重復。將胚芽剪成細絲轉移到2 mL的試管中,加入1.5 mL濃度80%丙酮,在遮光、室溫(22℃)條件下過夜浸提,直到胚芽完全變白。以80%丙酮為空白樣品,使用分光光度計測定663 nm,645 nm和470 nm處的吸光度值[25-27]。根據以下公式計算葉綠素和類胡蘿卜素的濃度：

葉綠素濃度=葉綠素a+葉綠素b

=(12.21×A663-2.81×A645)+(20.13×A645-5.03×A663)

=7.18×A633+17.32×A645

類胡蘿卜素濃度=(1000×A470-3.27×Ca-104×Cb)÷229

光合色素含量(mg·g-1)=C(mg·L-1)×提取液總量(mL)/稃片重量(g)×1000

式中,Ca為葉綠素a濃度;Cb為葉綠素b濃度。A663,A645和A470分別為葉綠體色素提取液在波長663 nm,645 nm和470 nm下的吸光度。

1.3.4葉綠素熒光參數測定 使用FMS-2便攜脈沖調制式熒光儀對無芒雀麥的胚芽葉綠體熒光參數進行測定,隨機重復3次進行試驗。由于胚芽過于纖細,故需要將多個胚芽無間隙地擺放在一起進行測定,測量部位統一位于胚芽的中上部。在測定過程中先進行光適應參數(Fs,Fm′,Fo′,Fv′,Fv′/Fm′,ФPSII,ETR)的測定,待經過20 min的遮光處理后再進行暗適應參數(Fo,Fm,Fv,Fv/Fm)的測定[28-29]。

1.4 數據分析

利用Excel 2019對數據進行整理和計算,借助軟件GraphPad Prism 8對試驗結果進行作圖分析,所有結果用“均值±標準差(mean±SD)”表示。

2 結果與分析

2.1 無芒雀麥和燕麥胚芽的多光譜圖像分析

通過nCDA圖、RGB圖和灰度圖的分析,無芒雀麥胚芽在照光后,在E0h,E2h,E3hE4h,E5h,E6h,E2d,E3d,E4d表型存在劇烈的變化(圖1a)。隨著光照的時間的延長,無芒雀麥胚芽表型由黃變綠,nCDA圖由藍色變黃,最后變為紅色。

隨著光照時間的延長,燕麥胚芽表型由黃變綠,nCDA圖由藍色向紅色轉變,變化較為劇烈的時間節點分別為E0h,E0.5h,E1h,E1.5h,E2h,E3.5h,E4h,E4.5h,E7h,E9h,E2d,E3d(圖1b)。

2.2 無芒雀麥種子萌發胚芽生理生化變化

2.2.1無芒雀麥種子萌發過程中光合色素的變化 如圖2所示,在經過為期5天的光照后,葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量均增加。在胚芽見光的第1天,即從E0h—E8h時間段內葉綠素a和葉綠素b含量接近于0,在E2.5h含量略微上升,在E1d開始迅速積累,類胡蘿卜素在E8h時達到較高值,在E1d時迅速下降后又迅速上升。葉綠素、葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素在第5天時的含量分別達到了第1天含量的9.322,12.311,3.412和1.813倍。

圖1 揭開錫紙前3天無芒雀麥(a)和燕麥(b)胚芽的多光譜nCDA圖Fig.1 MSI nCDA images of plumule during the first 3 days after being exposed to light in smooth bromegrass (Panel a) and oat (Panel b)

2.2.2無芒雀麥種子萌發過程中葉綠體熒光參數的變化 通過測定無芒雀麥暗適應下葉綠體熒光參數發現,各項指標隨種子萌發時間延長均呈現上升趨勢,初始熒光產量Fo、最大熒光產量Fm呈現出相似的變化趨勢,在E0h—E8h呈上升趨勢,在E1 d大幅度下降。PSII最大光學效率Fv/Fm在E0h—E1h略微下降,E1h—E1d迅速上升,E1d后數值趨于穩定(圖3)。光適應參數Fs,Fo′,Fv′,Fm′與暗適應變化規律相似,在E1d時下降到較低點,隨后進入快速上升階段,E4d時達到P值。PSII有效光化學量子產量Fv′/Fm′與Fv/Fm變化趨勢相似,Fv′/Fm′以E2.5h為轉折點,在E2.5h—E1d時間段內Fv′/Fm′逐漸上升后穩定。暗適應下的初始熒光產量、最大熒光產量均高于光適應時期數值。PSII實際光化學效率ФPSII和PSII電子傳遞速率ETR變化趨勢與Fv/Fm和Fv′/Fm′相似,在E40min出現下降,在E1h—E1d數值波動變化(圖4)。

圖3 無芒雀麥暗適應葉綠體熒光參數Fig.3 Chloroplast fluorescence parameters under dark adaptation in smooth bromegrass

圖4 無芒雀麥光適應葉綠體熒光參數Fig.4 Chloroplast fluorescence parameters under light adaptation in smooth bromegrass

2.3 燕麥種子萌發胚芽生理生化變化

2.3.1燕麥種子萌發過程中光合色素的變化 由圖5所示,燕麥幼苗葉綠體光合色素含量總體呈現出與無芒雀麥相同的上升趨勢,其中葉綠素a和葉綠素b在E1h時基本未合成,在E2.5h后含量開始上升,主要在E1d—E5d期間合成,葉綠素含量在E1d下降到較低點后,含量迅速增加。類胡蘿卜素的初始含量為0.02 mg·g-1,在黑暗下正常合成,在E8h達到較高點,在E1d迅速下降后又上升,此后穩定在較高水平。

圖5 燕麥光合色素含量變化Fig.5 Photosynthetic pigment content of oat

2.3.2燕麥種子萌發過程中葉綠體熒光參數的變化 燕麥的暗適應和光適應各項指標整體上均呈現上升趨勢。其中,暗適應參數Fo,Fm,Fv變化趨勢相似,在E0h—E1d都沒有發生顯著變化,E1d之后數值急速增加達到最大值,E4d和E5d數值均在峰值上下波動。Fv/Fm整體呈現上升趨勢,在光照40 min時明顯上升,達到最大值,隨后在E1h迅速下降,E1h—E1d逐漸上升,E1d后趨于穩定(圖6)。與暗適應下的光合參數相比,光適應下的熒光參數Fs,Fo′,Fm′,Fv′表現出相同趨勢的變化特征,在E1d時發生輕微下降,E1d后數值迅速增加。Fv′/Fm′與Fv/Fm響應曲線相似,在E40min時出現峰值,隨后在E1h時迅速下降,在E1h—E2d逐漸上升,隨后趨于平緩。ФPSII和ETR在E1h時數值下降到原本的1/4,此后持續回升,在上下波動中趨于穩定(圖7)。

圖6 燕麥暗適應葉綠體熒光參數Fig.6 Chloroplast fluorescence parameters under dark adaptation in oat

圖7 燕麥光適應葉綠體熒光參數Fig.7 Chloroplast fluorescence parameters under light adaptation in oat

3 討論

多光譜成像技術可以快速、無損獲取不同發育狀態的種子、幼苗組織和幼苗等的光譜和形態信息,在植物幼苗光合相關生理指標表型分析研究中具有強大的應用前景。nCDA分析可以有效鑒別不同生理狀態的植株或種子狀態的差異,如判別不同活力的多年生黑麥草(Loliumperenne)種子[30]、區分老化和未老化的豇豆(Vignaunguiculata)種子[31]等。在本試驗中,我們通過nCDA模式下胚芽圖片顏色的變化,識別出了無芒雀麥和燕麥種子萌發不同時間下胚芽發育狀態的差異,發現了無芒雀麥胚芽快速發育的時間節點E0h,E2h,E3h,E4h,E5h,E6h,E2d,E3d,E4d,燕麥胚芽快速發育的時間節點E0h,E0.5h,E1h,E1.5h,E2h,E3.5h,E4h,E4.5h,E7h,E9h,E2d,E3d,在一定程度上可以反映無芒雀麥和燕麥幼苗的光合響應特征。

無芒雀麥和燕麥是通過色素蛋白復合體對光能進行捕捉從而來進行光合作用的,幼苗光合色素含量直接反映了植物葉片光合能力的大小[5],光合色素的含量的變化可以反映出幼苗的生理情況[32-34]。本試驗在揭開錫紙后對種子萌發過程中光合色素含量進行測定,發現葉綠素a和葉綠素b的初始含量均接近于0,在光照條件下隨著萌發時間的延長,無芒雀麥和燕麥幼苗中的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量在總體上呈現出明顯的上升趨勢[35]。值得注意的是,無芒雀麥和燕麥光合色素含量表現出相同的響應規律,葉綠素a和葉綠素b在E1d后含量迅速上升,類胡蘿卜素含量在E1d時發生小幅度下降后升高。葉綠素含量與植物對外界光照強度適應能力密切相關[36],種子感光性主要受光敏色素的調控[37],因此推斷胚芽在揭開錫紙后1 h內對光照的適應能力較弱,主要在合成光敏色素響應光信號,可能導致了葉綠素含量在E0h—E1h期間含量低。類胡蘿卜素是對葉綠素捕獲光能的補充,又被稱為輔助色素,是葉綠體內重要的非酶促抗氧化系統[38],類胡蘿卜素含量在E1d時出現下降,可能與葉綠體內光保護機制有關[39-40]。

葉綠素熒光可以對光合作用進行準確而有效的反映,可以表現出PSII反應中心的活性和植物光合作用的強弱。Fo反映植物光能利用能力,Fm反映植物光合活性大小[41]。本試驗中Fo和Fm在E1d之前保持較低的水平,E1d之后數值上升,呈現上下波動的狀態,說明光反應中心在E1d前保持較高的活性,胚芽的光能利用能力逐漸增強。Fv/Fm反映了光反應中心PSII的最大光能轉換效率,無芒雀麥和燕麥Fv/Fm和Fv′/Fm′變化規律整體相似。植物在非脅迫環境下,Fv/Fm穩定在0.80～0.85,低于0.75可認為植物受到了光抑制[42]。光照前期無芒雀麥和燕麥的Fv/Fm均低于正常值,在光照一定時間后恢復正常值,說明在暗適應下,幼苗的光化學反應過程受到了一定程度的抑制。在光適應下,無芒雀麥和燕麥的Fv′/Fm′值均呈現下降后上升的趨勢。無芒雀麥Fv/Fm在E1h—E1d數值迅速上升,Fv′/Fm′值在E2.5h—E1d逐漸上升,E1d后趨于穩定。燕麥Fv/Fm和Fv′/Fm′主要在E1h—E1d期間逐漸上升,E1d后不再大幅度增加。ФPSII和ETR均可作為評價植物實際光化學效率的指標,本研究中ФPSII和ETR整體呈穩定狀態,無芒雀麥ФPSII和ETR在E40min時呈現下降趨勢,燕麥ФPSII和ETR在E1h時出現大幅度下降。綜上所述,無芒雀麥和燕麥在E1h—E1d期間,光合色素含量和PSII反應中心活性迅速增加,因此E1h—E1d可被看作是葉綠體發育的主要階段,在E1d之后光合色素和葉綠體熒光參數趨于穩定,意味著葉綠體發育基本成熟,能夠進行正常的光合作用。

4 結論

本試驗利用多光譜和nCDA分析,鑒別出無芒雀麥和燕麥種子在萌發過程中不同時間節點發育狀態的差異,并獲取了胚芽表型發生變化的關鍵時間節點(揭開錫紙1～2小時),這與胚芽內光合色素含量的變化具有相關性。隨著萌發時間的延長,無芒雀麥和燕麥種子萌發過程中光合色素含量逐漸積累,葉綠素a和葉綠素b在E1h之前未發生合成,E1h—E1d為葉綠素的快速積累階段。PSII反應中心活性在E1h—2.5h開始變化,直到E1d后趨于穩定,在此期間葉綠體逐漸發育,PSII反應中心活性迅速增加,E1d后葉綠體結構基本發育完全。