高效液相色譜法快速測定醬油中四種防腐劑

馬曉年，陳俊秀，農(nóng)蕊瑜，李 潔，李 怡

（昆明市疾病預(yù)防控制中心，昆明 650228）

醬油主要是以大豆、小麥、淀粉等為原料，經(jīng)預(yù)處理、制曲、發(fā)酵及配制等工藝［1］生產(chǎn)的具有特殊色香味的液體調(diào)味品，以咸味為主，亦有鮮味、香味等，能增加和改善菜肴的口味，是日常餐桌上不可或缺的調(diào)味品。研究表明，醬油具有抗氧化、降血壓、降低膽固醇、抗癌、抗過敏、降血脂等功能［2］，且富含多種人體必需的營養(yǎng)物質(zhì)，如糖類、氨基酸、礦物質(zhì)、維生素等［3，4］。

醬油在長期存儲中易受微生物污染而發(fā)生變質(zhì)，在醬油中添加食品防腐劑可抑制微生物的繁殖，改善其質(zhì)量，延長保質(zhì)期。化學(xué)防腐劑因經(jīng)濟、有效、便捷等優(yōu)點被廣泛用于醬油防腐。因丙酸及其鹽類毒性低，苯甲酸在酸性環(huán)境下對多種微生物有抑制作用且溶解性好，山梨酸能與微生物酶系統(tǒng)中的巰基結(jié)合，從而破壞許多重要酶系的作用，達到抑制微生物增殖及防腐的目的，脫氫乙酸對霉菌、酵母菌、細菌有很強的抑制力［5］，故這些物質(zhì)被廣泛用作醬油防腐［6，7］。但化學(xué)防腐劑對人體有不同程度的損害［8-10］，只能限量使用［11，12］。因此，建立簡單、快速、準確的檢測方法對于防腐劑使用的控制具有重要意義。有學(xué)者對這4 種防腐劑進行了研究，廖敏等［13］采用高效液相色譜法（HPLC）測定了醬油中的苯甲酸及山梨酸；王蘭等［14］采用高效液相色譜法測定了黃豆醬油、白樺樹汁飲料、薄荷糖、月餅及牛肉醬中苯甲酸及山梨酸的含量；周純潔等［15］建立了高效液相色譜法同時測定醬油中苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的檢測方法；張小芳等［16］建立了高效液相色譜法同時測定醬油和食醋中苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的檢測方法；夏靜等［17］將醬油樣品經(jīng)Oasis HLB 柱進行固相萃取凈化，利用高效液相色譜法同時測定醬油中苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的含量。梁立廣等［18］建立了頂空技術(shù)串聯(lián)氣相色譜法檢測醬油中丙酸鹽的含量。賴國銀等［19］利用凱氏定氮蒸餾裝置，建立了同時檢測蠔油、醬油、魚露中丙酸鈉（鈣）的高效液相色譜法；李霞等［20］采用氫火焰離子化檢測器-氣相色譜測定食品中丙酸及丙酸鹽的含量。本研究建立了高效液相色譜檢測方法，可以同時測定醬油中丙酸、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸含量，以期為這方面研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

U3000 型高效液相色譜儀（附二極管陣列檢測器，美國賽默飛公司）；電子天平（0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司）；賽多利斯Arium? pro DI 超純水系統(tǒng)（德國賽多利斯公司）。

丙酸標準物質(zhì)、山梨酸標準物質(zhì)、脫氫乙酸標準物質(zhì)（壇墨質(zhì)檢-標準物質(zhì)中心）；苯甲酸標準物質(zhì)（中國計量科學(xué)研究院）；乙腈（色譜純，美國JT Baker 公司）；磷酸二氫鉀（分析純，汕頭市西隴化工廠有限公司）；試驗用水為超純水。

樣品為市購醬油。

1.2 試驗方法

1.2.1 混合應(yīng)用液的配制 準確量取丙酸、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸標準溶液，用超純水稀釋定容至100 mL，得到500.0 mg/L 的丙酸、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸混合應(yīng)用液。混合應(yīng)用液于4 ℃條件下保存。

1.2.2 樣品溶液的制備 準確稱取2.00 g 試樣于50 mL 有蓋離心管中，加25 mL 超純水渦旋混勻，轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中，并用超純水潤洗離心管至容量瓶，定容至刻度，混勻。

1.2.3 色譜條件 色譜柱為Agilent Eclipse C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相A 為0.01 mol/L 磷酸二氫鉀溶液，流動相B 為乙腈，梯度洗脫；流速為1.0 mL/min；檢測波長為214 nm；進樣量為10 μL；柱溫為室溫。洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.2.4 檢測波長的選擇 參考國標GB 5009.28—2016［21］在230 nm 波長處對苯甲酸和山梨酸進行測定，參考國標GB 5009.120—2016［22］在214 nm 波長處對丙酸進行測定，參考國標GB 5009.121—2016［23］在293 nm 波長處對脫氫乙酸進行測定。

1.2.5 流動相的選擇 在國標方法GB 5009.28—2016 及GB 5009.121—2016 中，采用乙酸銨水溶液為水相分離苯甲酸、山梨酸及脫氫乙酸，也有研究［24］采用磷酸鹽體系為水相分離苯甲酸、山梨酸及脫氫乙酸。在國標方法GB 5009.120—2016 中采用磷酸氫二銨水溶液為水相分離丙酸，對以上水相體系對目標物質(zhì)的分離效果進行分析。

1.2.6 pH 的優(yōu)化 pH 對高效液相色譜法檢測丙酸得到的峰型影響較大，測定不同pH（分別為3.40、3.98、4.31、4.41、5.87、6.33、6.92）對4 個待測組分分離效果的影響，選擇最適宜pH。

1.2.7 校準曲線及檢出限 用超純水將混合應(yīng)用液配制成濃度分別為1.0、5.0、10.0、15.0、30.0、50.0、100.0 mg/L 的標準系列溶液，在確定的分析條件下進行測定，采用外標法以峰面積計算定量，以質(zhì)量濃度為橫坐標（x），以峰面積為縱坐標（y）繪制標準曲線。

1.2.8 回收率試驗 準確稱取2.0 g 醬油樣品9 份，分別加入一定量的防腐劑待測組分。加標樣品溶液按“1.2.2”的方法制備，按“1.2.3”色譜條件進行檢測，計算平均回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測波長的選擇

在檢測波長的選擇上，因丙酸的響應(yīng)值較低，為了兼顧苯甲酸、山梨酸及脫氫乙酸的響應(yīng)情況，試驗最終選擇214 nm 作為檢測波長。

2.2 流動相的選擇

試驗結(jié)果表明，在乙酸銨體系下，丙酸不出峰，而在磷酸鹽體系有較好的分離效果。綜合考慮，采用磷酸二氫鉀溶液為水相，乙腈為有機相分離丙酸、苯甲酸、山梨酸及脫氫乙酸。有機相比例增大時，4 種防腐劑的峰型均較好，且保留時間提前，但苯甲酸和山梨酸無法實現(xiàn)基線分離。有機相比例減小時，4 種防腐劑的峰分離度有所改善，但峰型展寬嚴重，故本試驗采用0.01 mol/L 磷酸二氫鉀溶液和乙腈為流動相進行梯度洗脫。

2.3 pH 的優(yōu)化

pH 較低時，丙酸峰型收窄，響應(yīng)值增大。增大pH，苯甲酸和山梨酸分離度增加，而苯甲酸和丙酸分離度減小。圖1 為不同pH 下4 種防腐劑相應(yīng)的保留時間。由圖1 可知，pH 在4.0 以下時，山梨酸、苯甲酸的保留時間接近，無法實現(xiàn)基線分離。pH 大于5.0 時，苯甲酸峰型前移，于山梨酸之前出峰，與丙酸的保留時間接近，無法和丙酸實現(xiàn)基線分離。考慮各待測組分的分離度及峰型，試驗最終采用pH為4.4。

圖1 pH 對4 種防腐劑保留時間的影響

2.4 校準曲線及檢出限

采用外標法以峰面積計算定量，以質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線。得到的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見表2。由表2可知，丙酸的方法檢出限為0.100 mg/g，定量限為0.300 mg/g；苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的方法檢出限均為0.005 mg/g，定量限均為0.010 mg/g。圖2 為標準品色譜，由圖2 可見，在15 min 內(nèi)4 個防腐劑均實現(xiàn)了基線分離，且峰型窄、對稱度高，分離效果較理想。

圖2 標準品色譜

表2 4 種防腐劑的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.5 回收率試驗

由表3 可知，醬油中不同防腐劑的檢測，3 個水平的平均加標回收率為65.5%～110.0%。圖3 為加標樣品色譜。由表3、圖3 可知，在醬油樣品中，4 個防腐劑組分均無基質(zhì)干擾，加標平行試驗RSD在3.6%～7.4%，說明該方法可靠，能夠?qū)崿F(xiàn)準確定量。

圖3 加標樣品色譜

表3 加標回收率結(jié)果

3 小結(jié)

該研究建立了同時檢測醬油中防腐劑丙酸、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的高效液相色譜檢測方法。樣品直接混勻、過濾后上機分析，前處理操作簡單。樣品加水渦旋混勻，0.22 μm 濾膜過濾，以乙腈和0.01 mol/L 磷酸二氫鉀溶液為流動相進行梯度洗脫，經(jīng)C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱分離，采用二極管陣列檢測器進行檢測。丙酸的方法檢出限為0.100 mg/g，定量限為0.300 mg/g；苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的方法檢出限均為0.005 mg/g，定量限均為0.010 mg/g；4 種防腐劑3 個水平的加標回收率為65.5%～110.0%。試驗結(jié)果具有較高的回收率及精密度，可滿足醬油中丙酸、苯甲酸、山梨酸、脫氫乙酸的測定要求。