八種花卉水提液美白和抗氧化效果的研究

何芊芊,宋紹嬌,陳霞,梁歡弋,張琳,范琴琴,李婷,趙秋月

(綿陽師范學院 生命科學與技術學院,四川 綿陽 621000)

化妝品的美白效果和抗氧化活性研究一直是化妝品行業及醫美行業關注的熱點問題。市面上美白材料分子的作用機制多數為通過減少黑色素的產生而改善膚色問題。其中通過抑制酪氨酸酶活性來減少黑色素產生是最常用到的方法,但一些傳統有效的抑制酪氨酸酶活性的美白原材料如曲酸和對苯二酚長期使用會引起皮膚敏感和癌變等副作用[1];同時合成抗氧化劑對健康也會造成潛在的危害,如二丁基羥基茴香醚(BHA)在通過動物試驗后證明其具有一定的致癌作用[2],所以從天然的植物材料中尋找高效、經濟、安全的天然抗氧化劑與美白成分成為目前醫美行業發展的一個必然趨勢。本試驗選取春季常見花卉為試驗材料,提取花卉水提液,系統測定其抑制酪氨酸酶活性的作用效果及清除自由基的能力,從而研究花卉水提液的美白和抗氧化效果,以期為天然植物化妝品的開發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

1.1.1 試驗材料

試驗材料見表1。

表1 試驗材料

1.1.2 主要試驗儀器

主要試驗儀器見表2。

表2 主要試驗儀器

1.2 試驗方法

1.2.1 試劑

參考崔彬淯方法配置磷酸緩沖液(PBS,pH值=6.8)、L-酪氨酸溶液、10%飽和度硫酸銨溶液、DPPH溶液[3]。

PBS緩沖液:按表3配置A、B兩種溶液,取A溶液250 mL和B溶液118 mL,混合并加蒸餾水至1 000 mL,搖勻即可得pH值6.8的磷酸緩沖溶液,配置好的緩沖液放于4 ℃進行冷藏儲存。

表3 PBS緩沖液A、B溶液的配置

L-酪氨酸溶液:準確稱取L-酪氨酸粉末22.5 mg,置于50 mL容量瓶中,加入PBS緩沖液進行溶解,超聲加速溶解至溶液澄清后定容,配置成質量濃度為0.45 mg/mL的L-酪氨酸溶液。

10%飽和硫酸銨溶液:稱取11.2 g 硫酸銨粉末,置于200 mL容量瓶中,用蒸餾水溶解并定容,25 ℃儲存。后續60%飽和硫酸銨溶液配置參照硫酸銨飽和度常用表,即在25 ℃下,硫酸銨溶液由初濃度10%調到終濃度60%時,每1 L溶液加入326 g固體硫酸銨。

DPPH溶液:準確稱取4 mg的DPPH固體粉末,置于100 mL容量瓶中,用無水乙醇溶解并定容,DPPH溶液宜臨用現配,避光保存。

1.2.2 雙孢蘑菇酪氨酸酶提取

酪氨酸酶提取參考文獻[4]方法并作調整,如圖1所示。

離心條件均為5 000 r/min冷凍離心15 min。

1.2.3 花卉水提液制備

水提液的制備參考文獻[5]方法并做一定的調整,如圖2所示。

再次以上述方法得到花卉水提液質量濃度為10 mg/mL(以干花的質量進行計算)。

1.2.4 酪氨酸酶活性測定

按照表4向試管中依次加入pH值6.8的磷酸緩沖液,花卉水提液和酪氨酸酶液,充分混合,于37 ℃水浴10 min后,加入L-酪氨酸溶液1 mL混勻,立即開始計時。體系反應10 min后,以pH值6.8的磷酸緩沖液為空白對照,測定475 nm處的吸光度值。總反應體系為5 mL[6]。

表4 反應液的組成

按照公式(1)計算水提液對酪氨酸酶的抑制率:

(1)

其中:OD1為不含水提液但含酪氨酸酶;OD2為不含水提液和不含酪氨酸酶;OD3為含水提液和酪氨酸酶;OD4為含水提液但不含酪氨酸酶。

1.2.5 清除DPPH自由基的測定

參照崔彬淯、閔玉濤的方法[3,6],取2 mL一定濃度的花卉水提液加入2 mL的DPPH無水乙醇溶液中,混合均勻,在室溫下避光靜置30 min后,迅速用分光光度計測定517 nm波長處的吸光度值,測定時以無水乙醇作為空白對照,按公式(2)計算花卉水提液對羥基自由基的清除率:

(2)

式中:Ai為2 mL花卉水提液和2 mL DPPH溶液的吸光度值;Aj為2 mL花卉水提液和2 mL無水乙醇的吸光度值;Ac為2 mL無水乙醇和2 mL DPPH溶液的吸光度值。

1.3 數據處理

所有試驗均重復3次,數據以平均值表示,采用SPSS 20統計軟件,利用ANOVA檢驗進行統計學處理,P>0.05即表示不具有顯著性差異。

2 結果分析與討論

2.1 酪氨酸酶活性測定結果

酪氨酸酶會催化L-酪氨酸形成L-多巴,L-多巴會繼續被催化生成多巴醌。多巴醌為有色物質,在475 nm波長下有吸收,所以通過紫外吸收觀察475 nm下吸光度的值就可以判斷酪氨酸酶催化酪氨酸的活性[7]。

按照1.2.4試驗方法,提取反應體系為PBS緩沖液,反應溫度37 ℃,反應時間30 min。由圖3可見,加入酶液的體系顏色變化明顯,溶液顏色隨加熱時間逐漸變深,而加入PBS 溶液的體系無顏色變化。在475 nm波長處測得的吸光度值見表5,不同體系吸光度差異較大,表5的數據表明提取的雙孢蘑菇酪氨酸酶液可以較好地將酪氨酸催化形成多巴醌,測定吸光度值較高,所以雙孢蘑菇提取液可以作為下一步試驗中的材料。

圖3 酪氨酸體系中加入不同溶液的顏色對比

表5 酪氨酸溶液加入不同物質后的吸光度

2.2 花卉水提液對酪氨酸酶活性的抑制率測定結果

按照1.2.5的試驗方法,以L-酪氨酸為底物,通過酪氨酸酶催化反應,測定八種花卉水提液的酪氨酸酶活性抑制率,結果見表6。

表6 八種花卉水提液酪氨酸酶活性抑制率結果

由表6可知八種花卉水提液的酪氨酸酶活性均有抑制效果,抑制率最低的西府海棠為2.41%,最高的紫荊花達到59.89%,抑制率最高是最低的24.85倍。其余六種花卉水提液對雙孢蘑菇酪氨酸酶活性位于兩者之間。八種花卉水提液對雙孢蘑菇酪氨酸酶活性抑制率只有紫荊花達到50%以上。宋芳芳、任雪峰等[4,8]研究報道白玉蘭的水提液抑制率達到了99%,其他花卉水提液的抑制率與本試驗中相差不大,研究結果不一致的原因可能有以下兩點:1)采摘白玉蘭的時間不太好,白玉蘭已經處于大部分掉落的狀態,并且采摘后變色;2)參照文獻中的花為從藥店購買的干花,且本試驗的干燥步驟、干燥方法及干燥時間可能不是最佳的。桃花水提液的抑制率與文獻[9]中桃花精油的抑制率(28.33%)基本一致甚至略高,說明利用花卉水提液類化妝品美白效果較好。

2.3 水提液清除DPPH自由基的測定結果

采用清除DPPH+自由基法檢測八種花卉水提液的抗氧化性能[10]。其羥自由基清除率見表7。數據結果表明八種花卉均有抗氧化作用,但清除效果不同。八種花卉水提液的DPPH自由基清除率山茶花最高,是清除率最低的西府海棠的1.3倍,其余六種花卉的DPPH自由基清除率位于二者之間,DPPH自由基清除率也都在88%之上,清除效果較好。鄒家麗等[11]研究山茶花的清除率為90.22%較該法低8.76%,李鳳英等[12]測定櫻花(44.13%)、迎春花(29.49%)、西府海棠清除率(33.67%)均低于本試驗。本試驗采用的方法提取到花卉抗氧化活性成分較多,更適用于實際生產。

表7 八種花卉水提液清除DPPH自由基的測定結果

3 結論

利用雙孢蘑菇中提取的酪氨酸酶,測定八種花卉水提液對酪氨酸酶活性抑制率,并研究抗氧化效果。數據表明八種花卉水提液對酪氨酸酶活性抑制率由小到大依次為西府海棠、櫻花、山茶花、碧桃、桃花、白玉蘭、迎春花、紫荊花。而八種花卉水提液對DPPH自由基清除率由小到大依次為紫荊花、西府海棠、迎春花、白玉蘭、桃花、碧桃、櫻花、紫荊花、山茶花。酪氨酸酶抑制率和抗氧化效果并不完全一致。

從研究結果可知,八種花卉對蘑菇酪氨酸酶活性抑制率具有較大差異,紫荊花、迎春花卉水提液的抑制率顯著高于其他六者,因此在美白效果上,紫荊花、迎春花提取物更具有優勢,可對其進行更深入更寬泛的研究,開發出以其為原料的具有美白和抗衰老等功效的化妝品;而在DPPH自由基清除效果來看,八種花卉的提取物在DPPH自由基清除都達到了70%以上,均具有顯著清除效果,在抗氧化效果上表現出較高的應用價值。綜合分析表明對山茶花、紫荊花、櫻花、碧桃、桃花、白玉蘭提取物可進行抗氧化類化妝品的開發;紫荊花、迎春花、白玉蘭提取物可用于美白類化妝品的開發;紫荊花、白玉蘭可作為美白抗氧化化妝品的開發研究。對于花卉提取物的抑菌等效果有待進一步探索研究。