Box-Behnken響應面法優化楓香樹葉總酚酸提取工藝

周燕霞,雷英,樂志艷

(江西醫學高等專科學校 藥學院,江西 上饒 334000)

楓香樹葉(Liquid-ambarformosanaHance)為金縷梅科楓香屬植物楓香的干燥葉片,早在《唐本草注》《南方草木狀》《蜀本草圖經》《本草綱目》等均有記載,現收載于《江西省中藥材標準》(1996年版)[1]。楓香樹葉多在秋天采收,性辛;味苦;有小毒,歸脾;腎;肝經,具有清熱解毒、祛風除濕、行氣止痛、消炎殺菌之功效,主要用于治療急性胃腸炎、痢疾、癰腫瘡瘍、產后風、小兒臍風、創傷出血等病癥[2-3]。化學成分研究顯示,楓香樹葉中主要含有酚酸、黃酮、揮發油、萜類以及黑色素等成分[4-8],其中酚酸類成分主要包括沒食子酸、沒食子酸乙酯、原兒茶酸等,具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、抗菌、抗病毒、抗突變、抗自由基、保護肝臟等多種生物學活性[9],已廣泛應用于醫藥化工、食品生物等領域,也可能是楓香樹葉發揮消炎殺菌、行氣止痛作用的主要有效成分。目前,對于楓香樹葉中酚酸類成分的研究報道相對較少,僅有學者對楓香樹葉中沒食子酸的含量進行了測定研究[10],對其酚酸類成分的提取工藝及藥理活性研究還未見報道。Box-Behnken響應面法是一種通過非線性數學模型連續對實驗的各個水平進行綜合試驗設計,再通過對回歸方程的精確分析以尋求最優工藝參數的優化方法,可有效考察影響因素之間的交互作用,具有試驗次數少、周期短、精密度高、預測性能好等優點,被廣泛用于中藥有效成分的提取工藝優化[11]。為進一步深入研究楓香樹葉中酚酸類成分的開發價值,本研究以總酚酸的含量為評價指標,采用Box-Behnken響應面法篩選楓香樹葉總酚酸的最佳提取工藝,以期為楓香樹葉質量評價、藥理作用、資源開發等研究提供依據。

1 儀器與試藥

HAD-752N型紫外分光光度計(日本島津公司);KQ5200B型超聲機(昆山超聲儀器公司);MeilenMCS220型電子天平(深圳美孚電子科技有限公司);RT-08型粉碎機(北京開創同和發展有限公司);EPED-10TH超純水儀(易普易達科技發展有限公司)。對照品沒食子酸(批號111081-20191102,純度99.2%)購自曼斯特科技有限公司。楓香樹葉藥材購買于揭陽中藥市場,經江西醫學高等專科學校中藥鑒定教研室黃平藥師鑒定為金縷梅科楓香屬植物楓香樹(Liquid-ambarformosanaHance)的干燥葉,無水乙醇、三氯化鐵、濃鹽酸均為分析純,水為去離子水。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的沒食子酸對準品5.0 mg,加入到100 mL容量瓶中,加入無水乙醇至刻度線,配成質量濃度為50 μg/mL的標準品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備

精密稱取粉碎后的楓香樹葉1.0 g,置50 mL的具塞錐形瓶中,加入一定量的提取溶劑,在一定條件下超聲提取,過濾,定容至50 mL,取1 mL濾液置100 mL容量瓶中,定容,得供試品溶液。

2.1.3 標準曲線的繪制

參照文獻[12],精密吸取上述配置質量濃度50 μg/mL的沒食子酸標準溶液0,0.25,0.50,1.00,2.50,5.00,10.00 mL分別置于25 mL的容量瓶中,分別依次加入4.0 mL的無水乙醇溶液、2.0 mL的0.3%十二烷基硫酸鈉以及1.0 mL的0.6% FeCl3和0.9%K3[Fe(CN)6]的混合溶液,搖勻,在黑暗處放置5 min,隨后再加入0.1 mol/L的HCl至刻度,搖勻顯色,繼續在黑暗處放置20 min后,在最大吸收波長720 nm處測定吸光度,設置空白對照。以沒食子酸濃度C為橫坐標,吸光度A為縱坐標繪制標準曲線,得回歸方程A= 0.264 7C+0.015 2(R2= 0.999 5),表明沒食子酸在質量濃度為0.50～20.0 μg/mL范圍內與吸光度呈良好的線性關系。

2.2 工藝的優化

2.2.1 單因素考察

以楓香樹葉總酚酸得率為評價指標,分別對不同的提取溶劑濃度(50%,60%,70%,80%,90%乙醇),不同的提取時間(30,45,60,75,90 min),不同的提取溫度(40,50,60,70,80 ℃),不同的液料比(10∶1、15∶1、20∶1、25∶1、30∶1)進行考察比較。結果顯示,在60%乙醇濃度、45 min的提取時間,60 ℃的提取溫度,25∶1的液料比條件下楓香樹葉總酚酸的提取效率最佳。

2.2.2 響應面設計

在單因素試驗的基礎上,選擇乙醇濃度、提取時間、提取溫度、液料比4個因素為指標,采用Box-Behnken軟件設計提取條件。具體的因素水平表見表1,中心組合設計和所得結果見表2。

表1 Box-Behnken方案設計因素和水平

表2 響應面試驗設計與結果

2.2.3 方差分析

采用Design-Exper8.0.6軟件對表2中的數據進行多元回歸擬合分析,得楓香樹葉總酚酸對乙醇濃度、提取時間、提取溫度、液料比的二項多次回歸模型方程為:Y=0.26+0.026A+0.016B+0.027C+0.016D-0.003 5AB-0.015AC-0.026AD-0.007 2BC-0.009 7BD-0.02CD-0.024A2-0.03B2-0.042C2-0.016D2。式中Y代表楓香樹葉總酚酸得率。詳細的分析及方差結果見表3。由表3的結果可知,本試驗所建立的Box-Behnken響應面模型P=0.007 1,呈現出極顯著水平,失擬誤差P=0.176 2,呈不顯著水平,說明擬合較好,模型可靠,能較好地反映出楓香樹葉總酚酸得率與乙醇濃度、提取時間、提取溫度、液料比的關系。單因素中乙醇濃度和提取溫度對總酚酸的影響最大,二次項中B2和C2的P值分別為0.017 8,0.002 1,均<0.005,呈現出顯著的水平,表明所建立的模型能夠較好地預測楓香樹葉總酚酸含量與各參數之間的變化關系。

表3 模型各項的方差分析結果

2.2.4 響應面分析因素之間交互作用

根據上述模型方差分析結果及回歸方程,繪制Box-Behnken響應面圖,結果如圖1所示。結果顯示,楓香樹葉總酚酸的最佳提取工藝參數為:乙醇濃度66.7%、提取時間49.9 min、提取溫度62.5 ℃、液料比23.4,總酚酸的預測得率為0.183%。

圖1 各因素之間的響應面圖

2.2.5 最佳提取工藝及試驗驗證

取楓香樹葉3份,每份約1.0 g,根據優化所得的最佳提取工藝進行提取。考慮到實際的可操作性,將上述優化得到的提取條件修正為:乙醇濃度67%、提取時間50 min、提取溫度63 ℃、液料比25,總酚酸的得率為0.187%,與預測得率0.183%較為接近,無顯著性差異,表明所建立的模型可行、所得的結果可靠。

3 小結

楓香樹葉具有清熱解毒、消炎殺菌、消腫止痛等多種功效,且入藥后有濃郁的香氣,既可以搗爛或研成粉末后可直接泡水飲用,還可作為臨床常用中成藥腸炎寧片的主要組成藥,是一味藥效確切、價值較高的中藥材。近年來,關于楓香樹葉的研究越來越多,但主要集中在藥理作用、化學成分、含量測定等方面[13-14],關于酚酸類成分的提取分離和工藝優化研究還相對較少,有待于進一步研究探討。本試驗采用Box-Behnken響應面法,在通過單因素確定影響楓香樹葉總酚酸提取主要因素的基礎上,選擇乙醇濃度、提取時間、提取溫度、液料比4個因素為指標,建立了楓香樹葉總酚酸提取工藝優化的Box-Behnken中心組合設計,最終優化得到楓香樹葉總酚酸的最優工藝參數為:乙醇濃度60%、液料比21∶1、超聲時間47 min,此條件下楓香樹葉總酚酸的提取率為96.78 μg/g,與預測值96.67 μg/g接近,無顯著性差異,表明方法可行,可為楓香樹葉資源的進一步開發利用提供理論依據。