苯二氮卓類策劃藥氯硝唑侖的研究進展

蔣金芳,杜宇,劉琪,陳紹璞,王志浩

(中國刑事警察學(xué)院 法醫(yī)病理教研室,遼寧 沈陽 110854)

苯二氮卓類藥物(Benzodiazepines,BZDs)具有抗焦慮、肌松、催眠、抗驚厥和鎮(zhèn)靜作用,其大量衍生物及其不同的藥理作用導(dǎo)致此類化合物被廣泛應(yīng)用。患者為了取得治療效果而延長使用時間,往往會導(dǎo)致苯二氮卓類藥物的濫用。近年來,一類被稱為苯二氮卓類策劃藥(Designer Benzodiazepines,DBZDs)的新型精神類活性藥(New Psychoactive Substances,NPS)因其可獲得性在非法藥物市場中受到關(guān)注。DBZDs中最活躍的化合物之一便是阿普唑侖(Alprazolam)的衍生物氯硝唑侖(Clonazolam)[1]。2015年,在瑞典查獲毒品中,歐盟毒品預(yù)警系統(tǒng)檢索到關(guān)于氯硝唑侖的信息。此后在全球非法藥物緝獲中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)氯硝唑侖,并且毒物信息中心關(guān)于氯硝唑侖相關(guān)的查詢也有所增加[2]。本文對氯硝唑侖的應(yīng)用、檢測以及鑒別檢驗等進行系統(tǒng)綜述,以期為氯硝唑侖的相關(guān)研究提供參考。

1 氯硝唑侖概述

氯硝唑侖(Clonazolam,CAS-33887-02-4)于1971年首次合成,屬于苯二氮卓類化合物中最活躍的化合物之一[3]。氯硝唑侖化學(xué)式為C17H12CIN5O2,是注冊藥物氯硝西潘的三唑類似物,其核心苯二氮卓骨架中含有氯、硝化和甲基化的三唑取代基,摩爾質(zhì)量為353.9 g/mol[4];沸點為(576.0±60.0) ℃;在水中的溶解度為0.042 6 mg/mL。

氯硝唑侖具有催眠、抗焦慮、鎮(zhèn)靜、肌肉松弛和抗驚厥作用,可被用作全身性癲癇的初期治療藥物[5]。氯硝唑侖在20～44歲的年輕人中濫用現(xiàn)象很普遍,以30～34歲的男性為主[6]。氯硝唑侖常存在于片劑、膠囊、丸劑、溶液中,使用劑量為0.5～4 mg[7]。

氯硝唑侖與大腦中的γ-氨基丁酸A受體(GABA-A)結(jié)合。γ-氨基丁酸(GABA)是一種活躍于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。在三種GABA受體亞型A、B、C中,GABA-A是苯二氮卓類藥物作用的受體[8]。當(dāng)氯硝唑侖與GABA-A受體結(jié)合時,氯離子通道的構(gòu)象發(fā)生變化,氯離子通道頻繁開放,導(dǎo)致氯離子的電導(dǎo)性增強,在突觸后間隙中高濃度的氯離子降低了膜電位,進而降低了神經(jīng)元放電,導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制,主要涉及的神經(jīng)區(qū)域包括杏仁核和網(wǎng)狀激活系統(tǒng)[9-12]。GABA-A受體可按其α亞基類型細(xì)分為α1、α2、α3和α5。GABA-A-α1受體負(fù)責(zé)鎮(zhèn)靜,GABA-A-α2受體引起肌肉松弛[13]。從生理學(xué)角度來看意味著機體出現(xiàn)鎮(zhèn)靜和放松。

氯硝唑侖具有很強的藥效,服用氯硝唑侖后能引起愉快的印象并消除恐懼,低劑量服用可引起明顯的鎮(zhèn)靜和失憶。服藥后30～40 min內(nèi)效果緩慢增加,產(chǎn)生輕微放松感、鎮(zhèn)靜感和所謂的“懸浮感”,大約1～1.5 h后達到效果高峰[14]。

氯硝唑侖的藥代動學(xué)仍處于研究階段。相關(guān)研究認(rèn)為,一般情況下氯硝唑侖的半衰期為3.6 h[15]。由于在組織中快速再分布,氯硝唑侖主要通過肝臟系統(tǒng)代謝,因此在老年人和肝損傷患者中半衰期較長[5]。大多數(shù)苯二氮卓類藥物體內(nèi)作用時間主要取決于其活性代謝物的代謝速率,氯硝唑侖作用持續(xù)時間為6～10 h[16]。氯硝唑侖呈中等脂溶性,可被酶分解成代謝物,包括還原(8-氨基氯硝唑侖)、乙酰化(8-乙酰氨基氯硝唑侖)、羥基化(羥基氯硝唑侖)和葡萄糖醛酸化[17]。本體和代謝物均經(jīng)腎臟通過尿液排出。

苯二氮卓類策劃藥中許多是制藥行業(yè)幾十年前開發(fā)但從未上市,而其他多是在秘密實驗室合成后出現(xiàn)在非法藥物市場或在互聯(lián)網(wǎng)上非法銷售,未被任何國家批準(zhǔn)用于醫(yī)療用途[7]。目前,氯硝唑侖在英國屬C類藥物,持有、生產(chǎn)或供應(yīng)都是非法行為[5];美國食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)尚未批準(zhǔn)氯硝唑侖用于治療[1]。

2 氯硝唑侖的檢測

苯二氮卓類策劃藥是藥物輔助性侵犯(Drug-facilitated Sexual Assault,DFSA)案件的常用藥物,在低劑量下具有高效活性,快速分布,并且可以容易地口服給藥。此外,DFSA犯罪的典型特征是受害者延遲報案或選擇沉默,原因或是由于藥物產(chǎn)生健忘特性,或是受害者恐懼、羞恥的心理特點[18]。因此對藥物檢測帶來了額外的挑戰(zhàn)。氯硝唑侖半衰期僅為3.6 h,代謝和排泄迅速。體液內(nèi)低濃度含量和短時間范圍需要采用高靈敏度的分析方法來檢測本體及其代謝物。

氯硝唑侖的檢測可以提取現(xiàn)場發(fā)現(xiàn)的可疑藥劑、粉末、受害者飲用過的剩余液體等,還需提取服用者血液、尿液、毛發(fā)、指甲等常規(guī)檢材[19]。其中尿液和血液在臨床檢測中最常用,其他組織檢材則作為備選。

為獲得最佳檢測結(jié)果,在檢測前通常需要對樣品進行前處理。由于許多苯二氮卓類策劃藥及其相應(yīng)的I期代謝物在其II期代謝過程中與葡萄糖醛酸結(jié)合,因此通常在樣品制備前進行結(jié)合步驟,以增強對非結(jié)合分析物的檢測并提高整體靈敏度[20]。

樣品處理方法取決于分析物的理化性質(zhì)以及特定分析所需的靈敏度和特異性水平[21]。可以使用蛋白質(zhì)沉淀法、液-液提取法(LLE)、鹽析輔助液-液提取法(SALLE)、固相提取(SPE)或微波輔助提取(MAE)等方法提取血樣[22-23]。尿液樣本的提取可通過固相萃取或液-液提取(LLE)[21]。與血液和尿液基質(zhì)相比,毛發(fā)在提取目標(biāo)分析物之前需要多步預(yù)處理程序。碎片化的毛發(fā)可提高回收率,毛發(fā)分割粉碎后還需要去污處理,隨后將粉碎或分段的頭發(fā)在不同溶劑下混合孵化24 h左右[24]。

精神活性類藥物的檢測和鑒定方法通常由兩個分析步驟組成,即初篩實驗和確證實驗[21-25]。使用初步篩選方法來篩選陽性樣本,從而進行后續(xù)確證檢測。

紅外光譜可對疑似氯硝唑侖的化合物進行檢驗。何思陽等[26]研究發(fā)現(xiàn),在選定測試條件下,氯硝唑侖在1 700～500 cm-1中紅外區(qū)域內(nèi)有明顯特征峰,1 512和1 351 cm-1處出現(xiàn)芳香族NO2的反稱和對稱吸收峰。

基于免疫學(xué)的NPS篩選檢測原理是利用抗原抗體特異性結(jié)合來確定氯硝唑侖或排除其他NPS。免疫學(xué)檢測在識別苯二氮卓類策劃藥中具有成功進展,包括酶增強免疫法(EMIT)、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)、同質(zhì)酶免疫分析(HEIA)、動態(tài)微粒免疫測定(KMI)和克隆酶供體免疫測定(CEDIA)。由于其高效便捷,根據(jù)苯二氮卓類策劃藥在結(jié)構(gòu)上與母體化合物類似這一特點,使用特異性結(jié)合抗體可提高檢測靈敏度。Bergstrand等[27]研究發(fā)現(xiàn),在4種常見的免疫分析方法(CEDIA、HEIA、EIT II Plus和KIMS II)中對含有氯硝唑侖的尿液進行檢測,氯硝唑侖在每種免疫分析中的交叉反應(yīng)分別為118%,261%,49%和99%。免疫學(xué)檢測法便捷快速,適用于現(xiàn)場快速檢測或初篩檢測,但需要實驗室同步開發(fā)與新結(jié)構(gòu)特異性結(jié)合的抗體,由于開發(fā)時間和成本原因,免疫學(xué)檢測法無法全面推廣應(yīng)用。

色譜法通常用于免疫分析法初步篩選后的確證檢測,目前是實驗室的常規(guī)檢測技術(shù)。研究顯示,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)是進行驗證性檢測的常用方法[28]。大多數(shù)應(yīng)用報告使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù),不需要在氣相色譜-質(zhì)譜分析前進行繁瑣耗時的樣品制備。當(dāng)常規(guī)臨床毒物檢測到免疫分析陽性結(jié)果并通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS-MS)或類似技術(shù)進行確認(rèn)檢測時觀察到陰性結(jié)果,應(yīng)考慮可能為苯二氮卓類策劃藥。通過LC-MS/MS分析鑒定血液、尿液中的氯硝唑侖。氯硝唑侖在母體化合物在尿液中的濃度較低(7～23 ng/mL)[29]。由于氯硝唑侖濃度極低并且半衰期只有3.6 h,若無法在攝入后3 h內(nèi)進行毒理學(xué)試驗,則需要對氯硝唑侖的活性代謝物進行檢測。

Meyer等[30]通過納米液相色譜高分辨質(zhì)譜(HRMS)鑒定尿液中氯硝唑侖及主要代謝物發(fā)現(xiàn),8-氨基氯硝唑侖活性最高。因此,對氯硝唑侖篩查方法可集中于主要代謝物。

Kong等[4]利用液相色譜-四極桿/靜電場軌道質(zhì)譜(LC-Q-Orbitrap MS)來分析氯硝唑侖在人肝微粒體和斑馬魚模型的主要代謝產(chǎn)物及代謝途徑。該研究基于LC-Q-Orbitrap MS分析結(jié)果,在人肝微粒體和斑馬魚中均檢測到M1結(jié)構(gòu),通過碎片離子結(jié)構(gòu)證明M1為氯硝唑侖硝基還原生成的代謝物并建議將其硝基還原產(chǎn)物M1結(jié)構(gòu)作為檢測標(biāo)志物。此外,該研究采用的斑馬魚模型能良好地模擬人體代謝,對未來苯二氮卓類策劃藥代謝產(chǎn)物篩選的實驗研究提供了參考。

3 氯硝唑侖濫用的危害

作為近年來新發(fā)現(xiàn)的精神類活性藥,氯硝唑侖在低劑量下表現(xiàn)出極高的活性,常規(guī)劑量服用有鎮(zhèn)靜和記憶消除的作用,在急性中毒時表現(xiàn)為長時間昏迷、肌張力降低等。氯硝唑侖與酒精或其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)抑制劑聯(lián)用或引起更為嚴(yán)重的中毒后果。

氯硝唑侖過量服用致急性中毒表現(xiàn)為深度昏迷和輕度竇性心動過速[31-32],多數(shù)患者可在24 h內(nèi)恢復(fù)。關(guān)于氯硝唑侖過量服用致中毒的病例報告數(shù)量有限,因為使用者認(rèn)為他們攝入的是處方類苯二氮卓類藥物,而非強效類似物。Syrjanen等[2]報道多起氯硝唑侖過量服用中毒的案例。一名男性和三名女性在服用苯二氮卓類藥物后被送往醫(yī)院。其中3例出現(xiàn)竇性心動過速,格拉斯哥評分(GCS)為8～13。其中2例經(jīng)實驗室檢測氯硝唑侖及其代謝物8-氨基氯硝唑侖,質(zhì)量濃度分別為0.2～2.1 mg/L和5.9～19.1 mg/L。給予鎮(zhèn)靜通氣治療,觀察恢復(fù)正常意識狀態(tài)。Sommerfeld-klatta等[7]報道一起26歲女性因氯硝唑侖意外中毒而被收治的案例。該女子因患急性支氣管炎持續(xù)咳嗽難以入睡故服用氯硝唑侖緩解,入院前4 h服用了10 mg 非正規(guī)渠道購得的氯硝唑侖粉劑,超過了推薦劑量的20倍。該患者無慢性病,之前未服用任何精神活性物質(zhì)。患者急性中毒后表現(xiàn)為持續(xù)深度昏迷,竇性心動過速(100～110 次/min)。入院后在醫(yī)院實驗室進行的初步毒理學(xué)試驗顯示,通過免疫學(xué)定性試驗檢測到尿液中存在苯二氮卓類藥物,GC-FID在血液中未檢測出乙醇。LC-MS/MS分別檢測4,8,12 h節(jié)點血液中氯硝唑侖質(zhì)量濃度,分別為0.077,0.015和0.009 mg/L。經(jīng)過治療,患者出院后無任何后遺癥,無精神障礙也無成癮表現(xiàn)。

氯硝唑侖中毒致死者,死亡機制與氯硝唑侖引起的腦部和呼吸抑制作用一致。尸體檢驗可見大腦有明顯的水腫表現(xiàn),腦回變寬腦溝變窄;肺臟表現(xiàn)為中度肺充血和水腫,氣管和支氣管內(nèi)有大量泡沫狀液體;肝臟、脾臟等臟器異常改變不明顯[33]。在未知氯硝唑侖的情況下,實驗室檢測具有難度。尸體檢驗后采集死者靜脈血、尿液送檢進行毒物檢測。Moore等[33]報道首例單獨過量服用氯硝唑侖致死的案例。14歲男性在服用大量阿普唑侖后,次日發(fā)現(xiàn)已經(jīng)死亡。法醫(yī)學(xué)尸體檢驗以及病理分析結(jié)果確定大腦和呼吸抑制符合急性氯硝唑侖中毒的死亡機制。在最初的血液檢測中未檢出苯二氮卓類藥物,包括預(yù)期的阿普唑侖。在收到苯二氮卓類藥物的假陽性結(jié)果后,使用LC-MS/MS對氯硝唑侖的代謝物8-氨基氯硝唑侖進行檢測,結(jié)果顯示死者血液8-氨基氯硝唑侖的質(zhì)量濃度為140 ng/mL。

除中毒外,還可導(dǎo)致氯硝唑侖相關(guān)毒品促成的性侵害案件發(fā)生。Skov等[34]在2022年的一項全球藥物輔助性侵犯的回顧性研究中統(tǒng)計,存在3起使用氯硝唑侖達成的性侵害案件。

4 總結(jié)與展望

苯二氮卓類策劃藥的濫用逐漸引起人們的關(guān)注。由于動態(tài)NPS市場的快速更新,常用的快速篩查精神活性藥物的免疫測定往往無法檢測到NPS;LC-MS/MS或GC-MS檢測結(jié)果譜圖可能不包含最新的NPS,在很大程度上導(dǎo)致漏檢。NPS市場的日益復(fù)雜突出了不斷加強檢測、識別和定量此類物質(zhì)的最先進分析策略的必要性。因此,使用多種檢測手段綜合檢測是鑒別此類化合物的關(guān)鍵。除此之外,涉及藥物輔助性侵害案件中,對可疑化合物的準(zhǔn)確分析檢測結(jié)果至關(guān)重要,應(yīng)對偵查人員或醫(yī)務(wù)人員進行培訓(xùn),充分調(diào)查案情,及時收集受害者的生物檢材進行檢查。同時,對此類藥物檢測的數(shù)據(jù)譜圖應(yīng)及時更新并添加到相關(guān)檢索數(shù)據(jù)庫,可以更快地進行識別,對相關(guān)案例的匯總分析同樣有助于確定當(dāng)前的藥物趨勢,并為臨床治療以及毒物檢測提供參考。