基于CRISPR/Cas系統的生物傳感器研究進展

李倩,范高超

(青島科技大學 化學與分子工程學院,山東 青島 266042)

聚類規則間隔短回文重復序列(CRISPR)和CRISPR相關酶(Cas)統稱為CRISPR/Cas系統。CRISPR/Cas系統是在大腸桿菌中發現的一種天然微生物適應性免疫系統,其主要功能是作為分子剪刀破壞入侵的核酸,通過切割特定的外源DNA或RNA來保護細菌免受外源基因的入侵[1]。近十年來,CRISPR/Cas系統介導的基因編輯已成為最強大的分子生物學工具之一,應用擴展到生命科學的各個角落,廣泛用于臨床診斷、生物傳感和生物成像等領域。

CRISPR/Cas系統由Cas效應器、非編碼CRISPR RNA(crRNA)和在某些情況下的反式激活CRISPR RNA(tracrRNA)組成。crRNA由兩部分結構組成,一部分是與Cas效應器結合的發夾結構,另一部分是與目標物特異性識別的“原間隔”基序[2](一般為20個堿基,20 nt)。由于crRNA能特異性識別目標DNA或RNA,所以CRISPR/Cas系統具有極高的特異性,而且不需要傳統基因編輯工具中涉及的復雜的蛋白質工程。此外,Cas效應器的特異性核酸酶活性僅在目標識別時觸發,可以實現從目標識別到信號轉導的無縫過渡。接下來簡要概述第2類CRISPR/Cas系統的結構和生物學特性,這類系統包括Cas9、Cas12、Cas13和Cas14。

1 CRISPR/Cas9

1.1 CRISPR/Cas9系統概述

CRISPR/Cas9是第一個用于真核細胞基因編輯的CRISPR/Cas系統,開啟了生物化學的一個嶄新時代。CRISPR/Cas9系統由三部分組成:化膿性鏈球菌Cas9(spCas9)、crRNA和tracrRNA。crRNA和tracrRNA可以結合在一起,形成單一的引導RNA(gRNA)[3]。spCas9可通過gRNA靶向下游具有“原間隔鄰近基序”(PAM)的20 nt的目標雙鏈DNA(dsDNA)。此時spCas9作為核酸內切酶的活性被激活,可以在PAM的上游對目標dsDNA進行位點特異性裂解。其中,Cas9識別的PAM序列是一段富含G堿基的序列(5’-NGG-3’)。Cas9的特異性由與目標DNA互補的20 nt序列的gRNA決定,而且位于目標序列下游的PAM序列對于Cas9與目標鏈的識別也至關重要[4]。CRISPR/Cas9的這種特點有助于提高生物分析工具開發的檢測特異性。CRISPR/Cas9系統示意圖如圖1所示。

圖1 CRISPR/Cas9系統示意圖

1.2 CRISPR/Cas9系統在生物傳感中的應用研究

CRISPR/Cas9系統可以作為生物識別的工具。生物識別是生物分析工具的基本組成部分,通過生物識別可以實現核酸、蛋白質和小分子等目標物的特異性檢測和成像。CRISPR/Cas9憑借獨特的crRNA引導的序列結合特性,目前已成為最常用的生物識別機制之一,可用于體外或生命系統中核酸的高度特異性識別。Pardee等人[5]介紹了這樣一項工作,通過將Cas9與基于核酸序列的擴增(NASBA)相結合,設計了一種CRISPR/Cas9生物傳感器用以區分寨卡病毒株。寨卡病毒是一種通過蚊蟲傳播的病毒,最初在非洲發現,后來廣泛傳播到美洲等地。但美洲寨卡病毒株的亞基因組序列含有一個與Cas9特異性識別的PAM序列,而非洲寨卡病毒株則沒有。所以利用CRISPR/Cas9生物傳感器可以特異性地切割美洲寨卡病毒基因序列,而不切割非洲寨卡病毒序列,以此來實現這兩種病毒的區分。

CRISPR/Cas9系統可以用于基因編輯。Actinomycetal(放線菌)是革蘭氏陽性細菌,能夠產生各種各樣的醫學和工業相關的次級代謝產物,例如抗生素、除草劑、化療藥物和免疫抑制劑等,開發具有藥物先導特性的放線菌次級代謝產物對醫學研究具有重要意義。2015年,Tong等人[6]報道了一種CRISPR/Cas9系統來編輯放線菌基因組。該系統可以對某個基因或基因簇進行特異性地敲除,從而有效和可逆地控制放線菌的基因表達。此外,他們還開發了一種基于催化失活的Cas9變體(dCas9)系統(CRISPR/dCas9),該系統也可以有效和可逆地控制靶基因的表達。Shi等人[7]最近開發了一種高效的CRISPR/Cas9基因組編輯技術,用來改變Starmerellabombicola(球擬假絲酵母菌)的基因組序列,從而生產具有廣泛用途的酸型槐糖脂。該CRISPR/Cas9系統通過同源定向修復提高了基因整合和靶基因破壞的效率,實現了多基因同時破壞。還通過在體內組裝多個DNA片段進一步構建了一個工程菌株,該菌株可以產生單一的酸型槐糖脂。CRISPR/Cas9提供了一種方便且高效的基因編輯技術,在生物學以及生物醫學中具有良好的應用前景。

2 CRISPR/Cas12

2.1 CRISPR/Cas12系統概述

Cas12是Cas家族中一個獨特的核酸酶,與Cas9不同的是,它們識別并切割單鏈DNA(ssDNA)和目標dsDNA,并且在切割dsDNA時產生黏性末端。第一個發現的Cas12酶是Cas12a(也叫Cpf1),是在普雷沃氏菌和弗朗西斯菌的基因組中發現的。Cas12家族的另一個亞型Cas12b(稱為C2c1)則是從不同的細菌物種中發現的。Cas12a和Cas12b具有相似的結構,但激活機制上有所不同,Cas12b需要crRNA和tracrRNA來結合靶標,而Cas12a只需要crRNA。LbCas12a(來自拉克諾螺旋菌)和AsCas12a(來自同源酸氨基球菌)的PAM序列為5’-TTTV,而BhCas12b(來自希薩希芽孢桿菌)的PAM序列為5’-ATTN。Cas12與PAM識別之后,dsDNA開始解離,隨后解離的目標鏈與crRNA進行堿基配對。目標鏈與crRNA雜交后使得Cas12的催化位點轉化為活性構型,從而切割目標DNA和附近的非靶ssDNA。這種獨特的反式切割(也稱為側邊切割)特性使Cas12成為集目標識別和信號放大于一體的強大信號放大器[8]。CRISPR/Cas12系統示意圖如圖2所示。

圖2 CRISPR/Cas12系統示意圖

2.2 CRISPR/Cas12系統在生物傳感中的應用研究

CRISPR/Cas12a系統可以實現信號擴增檢測。Petri等人[9]提出了一種基于重組酶聚合酶擴增反應(RPA)的DETECTR(DNA核酸內切酶靶向CRISPR反轉錄報告器)檢測平臺,該平臺是一項超靈敏的等溫核酸檢測技術。在這項工作中,作者發現CRISPR/Cas12a復合物可以識別dsDNA和ssDNA,并誘導靶向特異性側邊切割。而且dsDNA目標物的識別更加嚴格,需要PAM進行特異性識別以及目標物與crRNA互補,而ssDNA目標物只需要與crRNA互補即可。與PCR相比,DETECTR檢測平臺通過將Cas12a的側邊裂解特性與RPA結合,可以在37～42 ℃實現等溫擴增,而且擴增速度快得多(短至20 min)。

2021年,Zhang等人[10]通過將CRISPR/Cas12a系統和雙等溫擴增技術結合,建立了一種超靈敏檢測橘霉素(Citrinin,CIT)的方法。在該策略中,抗原修飾的金納米顆粒(AuNPs)通過金硫鍵將ssDNA連接在AuNPs上,以此形成探針。抗原修飾的AuNPs通過與CIT競爭,結合到涂有抗CIT抗體的磁珠上。經過簡單的磁分離后,收集AuNPs,用二硫蘇糖醇溶液洗滌后釋放ssDNA。ssDNA首先通過指數擴增反應擴增,然后在隨后的雜交鏈式反應中用作引物,產生dsDNA,該dsDNA包含一個PAM序列,CRISPR/Cas12a能對其進行特異性識別,從而激活CRISPR/Cas12a的活性,裂解ssDNA報告基因產生熒光信號。該方法具有較低的檢出限(0.127 ng/mL)和較寬的線性范圍(0.005～500 μg/mL)。燕麥和面粉中CIT的檢測回收率分別為97%～104%和105%～111%,實現了食品毒素的高靈敏度和高選擇性檢測。

CRISPR/Cas12a系統還可以與電化學傳感器相結合,用來開發具有高靈敏度、高特異性、高可編程性和普遍適用性的生物傳感器。Qing等人[11]首次將CRISPR/Cas系統引入一個無固定化的電化學生物傳感平臺,用于靈敏和特異性地檢測疾病相關的核酸和小分子。在該策略中,通過模塊化滾環擴增(Rolling Circle Amplification,RCA)反應將目標鏈擴增為一長串通用的DNA觸發鏈,用以激活CRISPR/Cas12a的脫氧核糖核酸酶活性,從而進一步實現信號擴增的目的。靶激活阻滯劑探針的裂解使亞甲基藍標記的報告探針被還原的氧化石墨烯修飾電極捕獲,從而產生顯著增加的電化學信號。該電化學生物傳感器展示了一種“信號開啟”模型,實現了對microRNAs(miRNAs)、細小病毒B19(PB-19)基因序列和腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)的高靈敏度和特異性檢測。

Cas12b屬于V-B型CRISPR/Cas系統,是一種嗜熱RNA引導的內切酶。與Cas12a相比,其研究應用比較少。Li等人[12]報道了一種基于CRISPR/Cas12b的可用于四種不同應用的HOLMESv2系統。該系統可以特異性識別單核苷酸多態性(SNP);通過恒溫一步法與LAMP擴增相結合,可以精確定量目標核酸,而且可以有效避免交叉污染的出現;該方法可以對環狀RNA、病毒RNA、人類細胞的mRNA進行簡單檢測;同時也可以準確定量目標DNA的甲基化程度。實驗證明,HOLMESv2系統在分子診斷和表觀遺傳學應用中具有極大的潛力。

3 CRISPR/Cas13

3.1 CRISPR/Cas13系統概述

Cas13是一類RNA引導的核糖核酸酶,包括4個主要亞型:Cas13a(也叫C2c2)、Cas13b、Cas13c和Cas13d。有研究發現,Cas13家族不需要特定的PAM來進行目標識別。與Cas12相似,Cas13與crRNA以及目標鏈特異性結合之后,催化位點會轉化為活性構型,進而催化近端RNA鏈的非特異性裂解[13]。Cas13家族的無差別裂解活性也使它們成為生物分析應用的理想信號放大器,而且目前的大多數研究主要是基于Cas13a進行的。CRISPR/Cas13系統示意圖如圖3所示。

圖3 CRISPR/Cas13系統示意圖

3.2 CRISPR/Cas13系統在生物傳感中的應用研究

CRISPR/Cas13a于2016年被首次報道,是一項有潛力的基因編輯技術。與CRISPR/Cas9系統類似,CRISPR/Cas13a也可用于抑制真核細胞中的基因表達,是一種高效的、特異性的基因治療工具。Fan等人[14]介紹了一項CRISPR/Cas13a介導的基因治療技術,靶向治療膀胱癌中高表達的人血管內皮生長因子受體(VEGFR2)。通過開發一種多功能脂質體系統,將CRISPR/Cas13a系統輸送到膀胱癌細胞中。在該策略中,CRISPR/Cas13a僅作為一種用于基因編輯的工具,而不影響細胞內遺傳物質的穩定性;該系統可以特異性靶向VEGFR2,具有精確識別目標的能力;而且可以通過近紅外光來介導藥物系統的釋放。這種基于CRISPR/Cas13a的近紅外光介導的靶向腫瘤細胞的脂質傳遞系統為膀胱癌基因治療開辟了一種新策略,具有極大的應用潛力。

CRISPR/Cas系統還可用于核酸檢測。近年來,有研究者報道了一種CRISPR/Cas12a和CRISPR/Cas13a/d系統,用以檢測煙草花葉病毒、煙草蝕刻病毒和馬鈴薯X病毒三種RNA病毒。該策略可以通過CRISPR/Cas12a系統對PCR擴增產生的病毒DNA擴增序列進行檢測,并可以實現對混合感染的植物的多重檢測。之后通過調整檢測系統,可以繞過昂貴的RNA純化步驟,利用 CRISPR/Cas13a/d系統可以直接檢測病毒RNA,避免了復雜的預擴增步驟。該系統可以在葉片收獲后30 min內進行病毒診斷,為開發簡單、快速、經濟有效的植物病毒檢測方法提供了一種新的思路,極大地拓寬了CRISPR/Cas系統在現代農業中的應用。

外泌體miRNAs作為一種癌癥診斷的潛在生物標志物,在癌癥生物學中起著關鍵的作用。最近,Zhang等人[15]開發了一種基于CRISPR/Cas13a的脂質體介導的膜融合策略(MFS-CRISPR),該策略可以將CRISPR/Cas13a轉染到外泌體中,用以直接測量血漿中的外泌體miRNA-21(miR-21)。脂質體介導的MFS可將熒光信號限制在融合囊泡內,用于外泌體異質性分析。通過臨床樣本的檢測,發現乳腺癌患者與健康人體miR-21表達差異顯著,這進一步證明了MFS-CRISPR平臺檢測的準確性。MFS-CRISPR檢測平臺具有寬的線性檢測范圍和低的檢測限,而且靈敏度高,操作簡單,在癌癥診斷和治療監測方面具有廣闊的臨床應用前景。

4 CRISPR/Cas14

Cas14于2018年由Doudna等人首次發現,它由400～700個氨基酸組成,Cas14蛋白比較小,其大小是其他Cas蛋白的一半[16]。Cas14家族有3個亞型:Cas14a、Cas14b和Cas14c。Cas14的結構尚未被揭示,但研究表明,所有Cas14亞型都有一個RuvC結構域,負責目標鏈的切割。而且Cas14也具有反式裂解活性,只切割ssDNA,而不切割dsDNA或單鏈RNA。Cas14不需要PAM序列,但是Cas14對crRNA與目標序列堿基對錯配的耐受性較低,因此與其他Cas蛋白相比具有更高的特異性,可用于核酸序列的檢測[17]。有研究表明,Cas14能夠很好地區分單核苷酸多態性,比如能夠很好地區分決定人類眼鏡顏色的HERC2變體。這為拓展Cas14在生物分析領域的應用具有重要意義。

5 結論

CRISPR/Cas系統是最強大的分子剪刀之一,它可以簡單、靈活、特異性地識別和切割目標核酸,這是其他分子剪刀(如核酸內切酶和鋅指核酸酶)所實現不了的。當用于分析和診斷分析時,CRISPR/Cas系統憑借其獨特的特性具有明顯的優勢[18]。首先,CRISPR/Cas系統通過crRNA間隔區的20個堿基特異性地識別目標核酸,這確保了核酸的序列特異性檢測和位點特異性成像,并使脫靶結合或切割最小化。而且crRNA可以通過化學合成大量生產和修飾,這極大地加速了具有可調特異性(即對單核苷酸突變敏感或耐受)的crRNA的篩選和應用。其次,CRISPR/Cas系統不需要變性就可以識別dsDNA。這種獨特的結合特性使得CRISPR/Cas系統在不同的光學和電化學檢測平臺上直接捕獲和檢測目標基因,以及在活細胞中對基因組位點進行原位成像成為可能。第三,由于dsDNA擴增子易于識別,CRISPR/Cas系統可與其他常用的核酸擴增技術(如PCR、LAMP、RPA)相結合,從而開發超靈敏的核酸檢測方法。第四,CRISPR/Cas系統是高度靈活和模塊化的,具有不同的核酸酶活性模式。可以通過選擇合適的Cas機制來檢測不同類別的核酸靶標,包括dsDNA、ssDNA和RNA[19]。

盡管有許多優點,但基于CRISPR的分析和診斷分析的開發和應用也面臨著一些挑戰。比如,CRISPR/Cas機制存在被生物樣品或周圍環境中的RNA酶和蛋白酶降解的風險;RNA和蛋白質組分的不穩定性會導致試劑成本增加,所以需要對CRISPR試劑的使用、儲存和運輸進行規范;還可能因試劑失效而導致檢測結果假陰性等。所以對于CRISPR/Cas系統在生物傳感中的應用還需要進一步研究,以拓寬其在生物學和現代醫學等領域的應用。