洋蔥花青素提取工藝優化及其抗氧化活性研究

葉宏宇,劉藝,李芳媛,唐鄰凱,韓甜甜,曹宇

(綿陽師范學院 生命科學與技術學院,四川 綿陽 621000)

花青素(Anthocyanidin)是一種具有較強抗氧化潛力的酚類化合物[1],具有清除體內氧自由基、增強新陳代謝能力、抗衰老、預防骨質疏松、增強血管彈性等多種作用[2-3]。近年來,花青素還被證明可應用于食用膜、生物標記、太陽能電池以及可降解材料等領域[4-6]。因為花青素巨大的潛在價值以及廣闊的應用前景,其相關問題獲得了廣泛的關注和研究。研究表明,花青素廣泛存在于植物中,尤其是深色的蔬菜和水果中,如葡萄、藍莓、黑醋栗等[7]。對不同來源花青素的應用價值、成分以及提取方法等進行研究具有實際意義。近年來,已有文獻對洋蔥中的花青素進行了一定的研究。研究洋蔥花青素含量的測定、洋蔥中花青素抗氧化活性的測定等[8]。而專門針對花青素的提取工藝優化的研究還有待進一步深入,尤其是有關于紫色洋蔥皮中黃酮類花青素的提取方法優化以及抗氧化活性的研究還較為缺乏。基于此,本研究擬選擇洋蔥中的花青素作為研究對象,利用傳統的溶劑提取法對洋蔥中花青素進行提取,并且利用單因素和Box-Behnken響應面法對提取方法進行優化。通過方法優化后得到關于洋蔥皮中花青素提取的最佳工藝條件,并利用洋蔥中花青素對·OH自由基、DPPH自由基和ABTS自由基的清除率的大小比較進行成果驗證,為洋蔥中花青素的進一步研究、開發與利用提供理論依據和試驗數據。

1 實驗材料和方法

1.1 材料與試劑

紫皮洋蔥(AlliumcepaL.):產地四川。

花青素標準品,純度≥ 98%,合肥博美生物科技有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH),分析純,合肥博美生物科技有限公司;正丁醇,分析純,天津市津東天正精細化學試劑廠公司;十二水合硫酸鐵銨,化學純,成都市科隆化學品有限公司;Vc抗壞血酸,分析純,天津市北聯精細化學品開發有限公司;2,2-聯氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(2,2′-azino-bis (3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate),ABTS),分析純,福州飛凈生物科技有限公司;其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-5500紫外-可見分光光度計(上海佑科儀器儀表有限公司);FA1004B電子天平(蘇州江東精密儀器有限公司);HH-6單列恒溫水浴鍋(常州梅香儀器有限公司)。

1.3 花青素的提取

取洋蔥外表皮3.0 g,剪成約1 cm×1 cm碎片,置于50 mL錐形瓶中,加入適量具有一定pH值的乙醇溶液后置于水浴鍋中恒溫提取,充分提取后以3 000 r/min離心5 min,使提取液與雜質分離,取適量提取液置于試管中,供后續試驗。

1.4 含量測定

1.4.1 標準品溶液的制備

精密稱定標樣25 mg于10 mL容量瓶中,再加入50%乙醇至刻度線,搖勻使標準品充分溶解,得到質量濃度為2.5 mg/mL的花青素標準品溶液。

1.4.2 標準曲線的繪制

花青素的標準曲線見圖1。

圖1 花青素的標準曲線

使用移液槍精密吸取2.5 mg/mL的標準品溶液0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mL分別于5支帶刻度試管中,再加入50%乙醇至1 mL。采用鐵鹽催化比色法顯色,實驗步驟參考文獻[9-10]。隨行試劑在相同條件下反應作為空白組,依次測定吸光度值,繪制標準曲線,得到標準曲線為y=1.85x+0.063 8(x為花青素質量濃度,mg/mL;y為吸光度值),R2=0.999 2。

1.4.3 紫洋蔥皮提取液中花青素提取率計算

稱取洋蔥外表皮3.0 g,提取方法見1.3,顯色方法同上,用等體積的50%乙醇代替花青素提取液作為空白對照,將測定所得的OD547(Optical Density 547 nm)代入標準曲線,求得質量濃度,代入公式(1)[11]求得相應提取率。

(1)

式中:δ為提取液中花青素的質量濃度,mg/mL;V為提取紫洋蔥皮所用50%乙醇體積,mL;N為稀釋倍數;m為紫洋蔥皮的質量,g。

1.5 單因素試驗設計

參考郗艷麗等[11]的研究中對花青素提取時的單因素考查條件,以乙醇為提取溶劑,分別考查乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間和提取pH值五個因素。單因素試驗設計因素水平表見表1,基礎條件料液比為1∶3,常溫提取,提取時間為40 min,pH值未調為乙醇自身pH值。每個條件下重復三次試驗,分別考察上述五個因素對洋蔥中花青素提取率的影響。

表1 單因素試驗設計因素水平及對應提取率結果表

1.6 響應面試驗優化

基于上述單因素試驗所得到的結果,參照Li等[12]的研究,最終確定以提取率為響應值,選取乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間以及提取液的pH值為因變量,每個因素選取三個水平,進行響應面分析試驗。響應面試驗設計因素水平表如表2所示。

表2 響應面試驗設計因素水平表

1.7 花青素抗氧化試驗

1.7.1 提取液對·OH自由基的清除作用

參照張鏡等[13]的方法并稍作修改,取優化后得到的花青素粗提取液測吸光度,按照標準曲線計算出質量濃度,稀釋得0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mg/L的花青素粗提取液,于5支試管中分別加入1.0 mL,再向試管中加入9 mmol/L硫酸亞鐵1.0 mL、9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液1.0 mL和8.8 mmol/L H2O2溶液1.0 mL,最后加蒸餾水至10 mL。充分混勻后37.0 ℃水浴30 min,以同等體積50%乙醇做空白對照,Vc替代花青素提取液做陽性對照,在510 nm處測定樣品吸光度。將OD510代入公式(2)計算花青素對·OH自由基的清除率:

(2)

式中:A0為加入隨行試劑做空白對照溶液的吸光度;A1為加入提取液反應后的吸光度;Ax1為不加入過氧化氫時本底溶液吸光度。

1.7.2 提取液對DPPH自由基的清除作用

參照邱金東等[14]的方法并結合實際情況,實驗對文獻方法中的DPPH用量進行了確定。精密稱定2.3 mg DPPH試劑,加入無水乙醇溶解后,再用無水乙醇在50 mL棕色容量瓶中定容。同1.7.1法取5個梯度的花青素粗提取液1.0 mL于5支試管中,再向每支試管加入0.08 mol/L的DPPH-乙醇溶液2.0 mL,于30 ℃下避光反應40 min,在517 nm處測定吸光度,Vc替代花青素提取液做陽性試驗。代入公式(3)計算DPPH自由基的清除率:

(3)

式中:A1為加入提取液和DPPH溶液反應后的吸光度值;A2為蒸餾水替代DPPH的吸光度值;A3為加入蒸餾水替代提取液的吸光度值。

1.7.3 提取液對ABTS自由基的清除作用

參照豐永紅等[15]的方法并稍作修改。精密稱定ABTS 38.4 mg和過硫酸鉀6.7 mg,分別用蒸餾水定容至10 mL容量瓶后,將ABTS溶液和過硫酸鉀溶液1∶1混勻至棕色瓶中放置過夜,得ABTS工作液,于734 nm下測定吸光度,加適量無水乙醇稀釋至吸光度為0.7±0.02。另用移液槍按1.7.1法分別取質量濃度為0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 mg/L的花青素粗提取液150 μL于5支試管中,加入3.6 mL稀釋的ABTS工作液,避光反應6 min后,于547 nm處測定吸光度,以Vc做陽性對照。代入公式(4)計算ABTS自由基的清除率:

(4)

式中:A0為734 nm處ABTS工作液的吸光度;A1為547 nm處3.6 mL ABTS工作液+150 μL花青素提取液的吸光度。

1.8 數據處理與分析

試驗數據均采用Origin 2022軟件作圖對單因素試驗數據及抗氧化試驗數據進行分析處理,Design-Expert 10.0.1軟件進行響應面設計及分析。

2 實驗結果與討論

2.1 單因素試驗

單因素試驗結果見表1,故確定乙醇濃度50%、料液比1∶6 (g∶mL)、60 ℃、70 min、pH值=2為最佳提取條件。

2.2 響應面試驗

根據表2中選取的因素和水平,利用Box-Behnken軟件設計了響應面法的實驗條件。

通過Design-Expert 10.0.1軟件對上述試驗設計進行多元回歸分析,得到回歸方程為:Y=17.75+1.55A+0.70×B+1.29×C+0.72×D-0.86×E-0.82×AB-0.47×AC+0.80×AD+0.097×AE-0.47×BC-0.072×BD-0.28×BE+2.62×CD-0.50×CE+0.042×DE-2.73×A2-3.99×B2-4.60×C2-2.45×D2-2.77×E2。

通過Design-Expert 10.0.1軟件分析推出影響本次試驗提取率大小的因素為B(料液比)>C(提取溫度)>A(乙醇濃度)>E(pH值)>D(提取時間)。二次項CD對響應值極顯著(p<0.01),二次項A2、B2、C2、D2和E2對響應值極顯著(p<0.01)。

通過Design-Expert 10.0.1軟件分析得知:在理想條件下,紫洋蔥皮中花青素的提取率最大值為18.26%,此時最佳提取條件為:乙醇濃度52.97%,料液比1∶6.05(g∶mL),提取溫度61.35 ℃,提取時間72.70 min,pH值為1.83。考慮到實際操作條件,將提取條件修正成:乙醇濃度為53%,料液比為1∶6(g∶mL),提取溫度為61 ℃,提取時間為73 min,pH值為2。

2.3 驗證試驗

根據上述試驗優化修正后得到的最佳條件,進行驗證試驗,結果為花青素的提取率為18.26%,18.21%,18.30%,花青素的提取率平均值為18.26%±0.04%,相對標準偏差為0.25%。且相較于微波法提取紫色洋蔥花青素的1∶10(g∶mL)料液比、女貞子花青素的1∶27(g∶mL)料液比、藍色金銀花漿果的1∶49.42(g∶mL)料液比[8,11,14]等,本實驗提取所用提取溶劑含量更少,證明優化可行,具有一定實用價值。

2.4 花青素提取液抗氧化試驗

抗氧化結果如表3所示,由表3可知,紫洋蔥皮中花青素提取液對·OH自由基的清除效果均高于陽性對照Vc組。與文獻中利用葡萄枝蔓提取的花青素的抗氧化測定數據對比[9],此實驗在使用比文獻中更小的花青素質量濃度下·OH自由基清除率仍高于文獻值。對DPPH自由基的清除效果均高于陽性對照Vc組和文獻值[9]。對ABTS自由基的清除效果均高于陽性對照Vc組和文獻值[8]。

表3 抗氧化結果

3 結論

通過響應面分析法對乙醇提取紫洋蔥皮中花青素的工藝進行了優化。試驗通過單因素對試驗條件進行了初步探索,考察了乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間和pH值這5個因素對紫洋蔥皮中花青素提取率的影響。在此基礎上,采用了五因素三水平的響應面分析法進行試驗條件優化設計,通過優化后得出的紫洋蔥皮中花青素提取的最佳提取工藝條件是乙醇濃度53%,料液比1∶6(g∶mL),提取溫度為61 ℃,提取時間為73 min,pH值為2。結果的方差分析顯示該模型的擬合程度較高。試驗條件下,當花青素質量濃度為2.5 mg/L時,對ABTS自由基的清除率達79.66%;當質量濃度1.0 mg/L時,對·OH自由基清除率達70.65%,對DPPH自由基清除率達77.97%。表明紫洋蔥花青素提取液具有良好的體外抗氧化活性。實驗結果表明紫洋蔥中的花青素提取率高,具有較大的抗氧化活性,應用前景廣闊。高效提取工藝的研究可以為花青素的工業化生產提供一定的理論依據。今后,洋蔥中花青素的大規模工業生產和綠色生產將有望成為研究的熱點問題。