異種脫細胞膀胱黏膜下層支架的制備

肖 峰

(貴州省貴陽市第六醫院泌尿外科,貴州 貴陽 550006)

各種先天性和獲得性疾病如癌癥、創傷、結核等往往導致膀胱組織發生嚴重的病理性缺損[1]。臨床上,膀胱缺損患者常采用手術切除聯合胃腸道替換的方法重建膀胱,以維持患者儲水排尿的生理需求[2]。雖然從短期來看,能夠修復膀胱缺損,但是這些方法受到機械、結構、功能或生物兼容性問題的限制,并不能滿足臨床需求。近些年來,隨著組織工程技術的發展,為完全修復膀胱缺損提供了可能的新方法。一般來說,組織工程通常包括三個基本要素:種子細胞、生物支架和生長因子。膀胱支架的理想材料應具備良好的生物相容性、機械性以及生物安全性等特點[3-4]。目前,通過一系列物理化學手段去除異體組織中的細胞成分得到的脫細胞基質材料,因其具備完整的細胞外支架結構,免疫原性低,并且含有的膠原和彈性纖維等利于細胞的黏附生長與增殖等特點使其成為一種理想的生物支架材料[5-6]。因此,異種脫細胞基質已經成為組織工程技術修復膀胱損傷的重點研究對象。本研究通過不同濃度的疊氮鈉溶液對豬膀胱進行預處理,利用低滲-液氮反復凍融-NaOH溶解法等一系列程序對疊氮鈉溶液處理過的豬膀胱進一步脫細胞處理,獲得豬膀胱脫細胞基質(bladder acellular matrix graft,BAMG),即異種脫細胞膀胱黏膜下層支架。隨后通過組織學檢測、DNA殘留實驗、細胞毒性實驗、細胞黏附實驗、以及皮下植入實驗等方法進一步驗證制備的BAMG的生物安全性,為其臨床應用奠定一定的理論基礎。報告如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物與細胞 健康豬膀胱由黔康肉食品經營有限公司提供,取材3 h內進行脫細胞處理。SPF級7～8周的SD大鼠(雌)購自北京華阜康生物科技有限公司,體重210～230 g。動物飼養于屏障環境中的獨立通氣籠盒內,適應性飼養1周后用于實驗。飼養密度不超過6只/籠,環境溫度控制在22～26 ℃,相對濕度40%～60%,籠具、墊料、飲用水和標準飼料均經滅菌處理,小鼠自由活動及進食。人源膀胱平滑肌細胞培養于DMEM完全培養基(含體積分數20%胎牛血清),由本院病理研究室提供。

所有動物實驗均通過貴陽市第六醫院倫理委員會批準通過(許可證號:202109122)。

1.2主要試劑 疊氮鈉由翌圣生物科技(上海)股份有限公司提供。無菌磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffer saline,PBS),蘇木素伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑盒以及Hoechst 33258染色液均由Solarbio公司提供,貨號P1020,G1120和C0021。四唑鹽(methyl thiazolyltetrazolium,MTT)比色法試劑盒由Sigma公司提供,貨號:CT01-5。胎牛血清由Hyclone公司提供,貨號:SH30070.031。DMEM高糖培養基由博士德生物工程有限公司提供,貨號:PYG0070。人源膀胱平滑肌細胞購自武漢普諾賽生命科技有限公司,貨號:CP-H069。青霉素-鏈霉素溶液(含100 U/mL青霉素、100 g/L鏈霉素),兩性霉素B溶液(250 mg/L)均購自武漢普諾賽生命科技有限公司,貨號:PB180120,PB180127。DNase和RNase均購自上海碧云天生物科技有限公司,貨號:R0127。MagMAX-96 DNA多樣品試劑盒購自賽默飛公司,貨號:4413021。

1.3構建豬BAMG ①將得到的豬膀胱,用含抗生素(100 U/mL青霉素、100 g/L鏈霉素)和抗真菌藥物(2.5 mg/L兩性霉素B)的PBS緩沖液沖洗。②將洗凈的豬膀胱分別置于濃度為0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.5 g/L、0.7 g/L、1g/L疊氮鈉溶液中浸泡共2 h。③用薄玻片刮去膀胱黏膜層浸入蒸餾水中6 h,每2 h換液1次。④-80 ℃條件下反復凍融3次,60 min/次。⑤加入40 U/mL DNase和RNase混合液,37 ℃,靜置2 h。⑥浸入4% NaOH溶液,4 ℃,靜置24 h,每6 h換液1次。⑦PBS緩沖液震蕩漂洗5次,30 min/次。⑧置于冷凍干燥機中凍干,60CO消毒,4 ℃保存備用。

1.4組織學檢測細胞殘留 豬膀胱經脫細胞處理后,用10%多聚甲醛固定,石蠟包埋,切片(5 μm),HE染色,封片,光鏡觀察。

1.5紫外分光光度法檢測BAMG中的DNA含量 取合適大小BAMG(10 mg),隨后利用MagMAX-96 DNA多樣品試劑盒提取BAMG中總DNA含量,并用紫外分光光度計進行檢測。

1.6MTT比色法檢測BAMG的體外生物相容性 將4 cm2的BAMG浸泡在1 mL含10%胎牛血清的DMEM中,37 ℃,靜置24 h,即可得到獲得BAMG的浸提液。隨后,將人源膀胱平滑肌細胞懸液接種于96孔板內,待細胞貼壁后加入上述浸提液培養細胞,空白對照加入DMEM培養基,于37 ℃、5% CO2孵箱中分別培養細胞12 h、24 h和48 h。然后棄掉培養基,每孔加入等的量MTT試劑。避光培養2 h后,去除MTT試劑并加入200 μL二甲基亞砜。上機測定490 nm處的吸光度。

1.7細胞黏附實驗確定BAMG的黏附性 將人平滑肌細胞制備成單細胞懸液,并稀釋為1×107個/mL。取200 μL單細胞懸液接種到BAMG表面并在,在含10%胎生牛血清的DMEM培養基中培養。培養1周后,BAMG經培養基沖洗后通過Hoechst 33258染色檢測BAMG表面的DNA濃度確定細胞黏附情況。

1.8皮下植入試驗觀察BAMG與周圍組織的相容性 在成年SD大鼠脊柱中線兩側約2 cm處平行各取2點作為皮下注入點。水合氯醛麻醉動物,無菌條件植入BAMG作為實驗組,假手術組作為對照組。每天觀察皮膚手術切口及動物反應變化。在術后第2周和第4周處死大鼠,切開皮膚仔細觀察樣品與周圍組織的粘連情況并進一步切片作組織學評價。

1.9統計學方法 應用SPSS 20.0統計軟件分析數據。計量資料比較采用t檢驗、單因素方差分析和SNK-q檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1組織學觀察檢測脫細胞效率 通過組織學觀察檢測脫細胞效率,初步發現,經脫細胞處理后,豬膀胱組織中僅可見基質結構和膠原纖維,其中膠原纖維排列整齊,結構完整;并且可見視野內的細胞核數量顯著減少,未見明顯的細胞殘留。表明該方法處理得到的BAMG符合無細胞的要求(圖1)。

圖1 組織學觀察脫細胞效率

2.2脫細胞處理對BAMG中DNA含量的影響 利用紫外分光光度法檢測經脫細胞處理后BAMG中殘留的DNA含量。結果顯示,脫細胞處理組的DNA含量顯著低于對照組,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。表明,經脫細胞處理能夠顯著降低BAMG中的DNA含量,即本實驗中所采用的制備方法比較成功地實現的脫細胞的目的。

表1 紫外分光光度法檢測DNA殘留含量

2.3BAMG的體外生物相容性檢測 利用MTT法檢測經脫細胞處理后BAMG浸提液在不同時間點對人膀胱平滑肌細胞細胞活性的影響。結果顯示,2組細胞生長狀態良好,隨培養時間的延長,細胞數量穩定增長,細胞增殖能力差異無統計學意義(t=0.989,0.636,1.608,1.403,P>0.05)。結果表明,經脫細胞處理的BAMG浸提液對培養的人平滑肌細胞沒有顯著的細胞毒性,見表2。

表2 BAMG浸提液對人膀胱平滑肌細胞細胞活性的影響

2.4BAMG的細胞黏附能力檢測 通過Hoechst 33258染色液確定BAMG表面的DNA含量,間接檢測BAMG 的細胞黏附能力。結果顯示,與對照組相比,接種細胞后BAMG表面的DNA含量顯著增加。這提示人膀胱平滑肌細胞能夠黏附在BAMG表面生長,BAMG具有一定的細胞黏附力。上述結果間接闡明了BAMG能夠與人平滑肌細胞的緊密黏附(圖2)。

圖2 組織觀察法確定BAMG的細胞黏附情況

2.5BAMG的組織相容性檢測 利用透射電子顯微鏡確定BAMG植入后組織中由中性粒細胞和巨噬細胞組成的炎性細胞。結果顯示,BAMG植入后,傷口處未見明顯的炎癥反應,如水腫、化膿以及發炎等。植入部位未見異常。術后1周取出BAMG,發現其與周圍組織輕微粘連,出現輕微的炎性細胞浸潤(白色箭頭);術后4周取出BAMG,發現其與周圍組織黏附,未見炎性細胞浸潤(圖3)。

圖3 透射電子顯微鏡檢測不同時期的炎性細胞( ×100)

3 討 論

在組織工程學中,支架為種子細胞的生長分化提供了穩定的三維結構。事實上,細胞的生長發育受到支架提供的微環境影響[7]。由于膀胱在充盈和排空過程中會受到不同的機械力,因此需要一個動態支架來提供機械支撐。細胞外基質(extracellular matrices,ECM)是一種天然理想的生物支架材料,其細胞成分和抗原均已去除,尤其是以脫細胞基質為代表的ECM材料已廣泛用于各種組織重建應用。脫細胞基質主要由結構蛋白和各種功能分子組成,如膠原蛋白、糖胺聚糖、生長因子、黏附分子和細胞因子[8]。功能上,能夠為細胞提供物理支架并調節細胞反應,包括細胞增殖、存活、分化、遷移、穩態和形態發生[9]。其特點是能夠保持組織的機械性能和結構蛋白,不需要進行二次工程設計。在眾多組織來源的脫細胞基質生物材料中,BAMG無需體外細胞種植即可促進膀胱再生,并可被宿主組織重塑和取代;同時,保留了組織再生所需的生物活性蛋白,包括血管內皮生長因子和胰島素樣生長因子[10-11]。

與任鵬程等[12]報告的脫細胞方法相比,本研究主要采用一系列濃度梯度的疊氮鈉溶液對豬膀胱進行脫細胞處理,建立了一種高效快速的制備豬膀胱脫細胞基質的方法。首先將滅菌處理的健康豬膀胱分別浸泡于不同濃度的(濃度為0.1 g/L、0.2 g/L、0.3 g/L、0.5 g/L、0.7 g/L、1 g/L)疊氮鈉溶液,充分裂解基質細胞并釋放胞內內容物。隨后浸入蒸餾水6 h,以達到水解細胞的目的。而液氮凍融法使膀胱組織內的細胞發生腫脹破碎,進一步增強脫細胞效果。此外,DNA酶及RNA酶可以消化處理膀胱基質內的核酸成分。最后,采用NaOH溶解法使細胞脫水壞死、脂肪皂化,徹底去除膀胱組織中的殘留細胞膜結構和胞內脂質?？傊?將整個制備過程分為6個質量控制環節:疊氮鈉裂解細胞、滲透溶液法水解細胞、液氮凍融法破碎細胞、酶消化法去除核酸、NaOH溶解法清除細胞脂質和PBS溶液清洗等步驟。經過上述操作過程實現豬膀胱組織高效的脫細胞處理,獲得較理想的BAMG。隨后對該方法的脫細胞效率和BAMG的生物安全性評價進行了廣泛的研究。

為了鑒定所制備的BAMG是否能作為生物支架材料應用于組織工程膀胱的構建,主要從形態學、細胞相容性及移植后反應等3個方面對制備的BAMG進行了綜合評價。首先,通過HE染色確定制備的BAMG的脫細胞效率[13]。HE染色結果顯示,脫細胞處理后,膠原纖維排列整齊,結構完整;與對照組相比,可見視野內無細胞核出現,未見明顯的細胞殘留。另外,供體DNA殘留量也是評價脫細胞效率的主要指標之一[14]。初步研究發現,與正常對照組相比,脫細胞處理組能顯著降低膀胱組織的DNA含量(P<0.01)。因此,本次建立的脫細胞方法效率高,且經脫細胞處理得到的BAMG符合無細胞的要求。隨后,依照醫療器械生物學評價的標準,選擇MTT法對細胞增殖率進行測定,了解BAMG的體外生物相容性[15-17]。目前,MTT法在大多數研究中已經成為檢測生物材料體外生物相容性的必要手段。本研究結果顯示,BAMG的浸提液對人原代膀胱平滑肌細胞的細胞增殖能力無顯著影響。最后,通過體內移植實驗觀察材料與周圍組織的相容性[16]。研究發現,該材料具有較低的免疫原性,移植后周圍組織炎性癥狀輕微,并未發生組織壞死及排斥現象,上述結果證明該材料在體內具有較好的生物相容性。

綜上所述,利用不同濃度疊氮鈉快速制備BAMG的方法,制作過程快速簡單,且成本低廉。同時,利用該方法制備的BAMG具有良好的組織相容性,可以作為組織工程膀胱缺損的理想支架,實現重建膀胱的目的。因此,該方法的提出為膀胱缺損修復提供了一種新的思路。