利用CRISPR/Cas9 技術構建G3BP2 基因缺失型BHK21 細胞系

陳琳暉，屈春惠，王世民

（ 新疆農業大學動物醫學學院，新疆 烏魯木齊 830052 ）

基因編輯是一種針對基因組和轉錄本進行精確修改的技術，通過核酸酶在基因組的特定位置形成特異性雙鏈斷裂，生物體會通過非同源末端連接或同源重組修復斷裂雙鏈[1]。成簇規律的間隔短回文重復序列（CRISPR）及相關蛋白酶9（Cas9）構成的CRISPR-Cas9 系統是目前最常用的基因編輯技術，通過特異性的單向導RNA（sgRNA）序列，引導Cas9 蛋白特異結合到靶序列處行使DNA 切割功能[2-3]，已廣泛應用于各行業并展現出巨大的潛力[4-5]。當細胞受到外界影響，如氧化應激、熱休克、病毒感染、紫外線照射時，胞質中會產生致密的顆粒樣結構，這種物質被稱為應激顆粒（SGs）[6]。SG 主要由RNA 結合蛋白、T 細胞胞質內抗原1（TIA-1）、GTPase 活化蛋白SH3 結構域結合蛋白（G3BP）等成分構成[7]。近年來，一些研究表明，宿主細胞被病毒感染可產生應激反應形成SG，阻止病毒蛋白的翻譯，抑制病毒復制[8]。

目前，圍繞其中G3BPs的功能研究主要集中于腫瘤以及應激顆粒，G3BP 也作為應激顆粒蛋白被人們所熟知[9-11]。G3BP基因在1996年首次通過與Ras-GAP的SH3結構域的共免疫沉淀被鑒定出來[12]，同年從小鼠中分離出第二個與G3BP具有高度同源性的基因[13]，這兩個基因按照被發現的順序排列被稱為G3BP1 和G3BP2[14-15]。G3BPs主要在RNA 加工和信號傳導方面起到作用[16]。作為G3BPs蛋白家族成員，G3BP1 和G3BP2 雖然具有相似的功能，但也各具組織特異性表達。基于此，本研究建立穩定的G3BP2 缺失型BHK21 細胞系，并驗證其對細胞抗應激的影響，以期為細胞天然免疫的進一步研究以及研制相關病毒的疫苗奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細胞株、菌種和質粒本試驗所用BHK-21 細胞、DH5α 感受態細胞、pX459載體新疆農業大學微生物與免疫學實驗室保存。

1.1.2 試劑、引物與儀器

質粒提取試劑盒（TIANGEN 公司）；DNA 提取試劑盒（Omega 公司）；Bbs Ⅰ酶、T4 連接酶（賽默飛公司）；2×taq plus master mix、lipo 8000 轉染試劑、CCK-8、T7 核酸內切酶Ⅰ（上海碧云天生物技術有限公司）；GAPDH 一抗、G3BP2一抗、山羊抗兔IgG二抗（Bioss公司）。PCR引物由擎科生物科技有限公司合成。

SCI1000-G PCR儀（美國SCILOGEX公司）；垂直超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；恒溫培養搖床、C02細胞培養箱（美國Thermo公司）；光學顯微鏡（尼康有限公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 sgRNA的設計和寡核苷酸鏈的合成

根據NCBI 數據庫獲得G3BP2 基因序列，針對G3BP2基因的兩個外顯子設計兩對sg RNA，送南京擎科生物有限公司合成。利用在線設計網站（http://crispor.tefor.net/）分析得出具體sg RNA得分后，選擇得分較高的第1個外顯子中的一個sg RNA（sg RNA1）和第2 個外顯子中的一個sg RNA（sg RNA2）共兩組作為備選序列。所選擇的兩個外顯子均處于所有轉錄本的共有區域并且位置靠前，可確保試驗過程中能夠對G3BP2基因的所有轉錄本進行編輯。在模板的5'端添加CACC，反義鏈模板的3'端添加AAAC，形成與Bbs Ⅰ酶的黏性末端互補的末端，設計相對應的敲除鑒定引物，引物信息見表1。

表1 引物信息Tab.1 Primer information

1.2.2 敲除載體構建

使用Bbs Ⅰ限制性內切酶切割常用于基因編輯的線性化質粒pX459，并按照凝膠回收試劑盒說明書進行切膠回收。之后將設計的兩對sg RNA分別構建到pX459載體上，將退火后的寡核苷酸雙鏈連接上線性化的pX459 載體，轉化后挑取單克隆菌落培養提質粒。

退火體系：將合成的引物稀釋成濃度為100 μmol/L，各取5 μL的正反鏈引物溶液。

退火程序：95 ℃ 5 min，室溫10 min，冰浴5 min。

連接體系：線性化pX459質粒4 μL、雙鏈sg RNA引物2 μL、10×T4 DNA 連接酶緩沖液1 μL、T4 DNA 連接酶1 μL，補水至10 μL；16 °C過夜。

連接產物轉化于DH5α 感受態細胞中，涂布于氨芐抗性固體平板上，37 °C 培養過夜。挑取單菌落擴大培養后作為模板進行菌液PCR，核酸膠驗證后，選取陽性克隆送南京擎科生物科技有限公司測序。

1.2.3 敲除載體驗證

將BHK-21細胞接種于6孔板，第2 d待細胞長至80%融合度時，將2 條重組質粒G3BP2-sgRNA 分別轉染BHK2-1 細胞，轉染過程嚴格按照說明書進行。轉染24 h后添加嘌呤霉素，使其終濃度為20 mg/L。在該濃度嘌呤霉素作用下，未轉染的細胞會被殺死，之后每天按照該濃度進行換液培養，進行為期7 d 的細胞篩選。取各自存活的部分細胞用于基因組檢測，檢測引物信息見表1。另一部分細胞使用T7 核酸內切酶Ⅰ酶切驗證，選出效果最好的sgRNA重組質粒用于穩定敲除細胞株篩選。

1.2.4 穩定敲除細胞的篩選

使用胰酶消化細胞并進行無限稀釋，接種至96孔板培養，將sgRNA1與sgRNA2共轉染BHK21細胞，24 h后使用20 mg/L 嘌呤霉素篩選，培養基中嘌呤霉素的濃度可下調至原濃度的一半，細胞不再大量死亡后待細胞長成單克隆細胞群落，取部分細胞用于基因組檢測。將有切割修復效果的單克隆細胞長成細胞團后擴大培養，收集部分單克隆細胞和正常細胞，提取細胞總蛋白進行蛋白質印跡技術（WB）檢測G3BP2蛋白表達量，選擇幾乎不表達G3BP2的細胞株繼續傳代培養。將有切割修復效果及G3BP2 蛋白不表達的單克隆細胞最終轉入培養瓶中穩定傳代培養。

將2 μmol/L 的二硫蘇糖醇（DTT）加入G3BP2-/-細胞株和野生型細胞株中1 h 后鏡檢觀察，以此評估該構建細胞系的抗應激能力。將野生型BHK21 細胞與G3BP2-/-細胞于45 ℃的環境下同樣放置1 h，1 h后在顯微鏡下觀察細胞形態，以此測試G3BP2-/-細胞對熱應激的反應。

2 結果與分析

2.1 G3BP2-sgRNA載體的構建

針對G3BP2 基因的兩個外顯子設計并合成兩對sgRNA，結果見圖1（a）；將兩對sgRNA 分別構建到pX459載體上，轉化后挑取單克隆菌落培養提質粒送至公司測序，測序結果完全正確，結果見圖1（b）。重組載體分別命名為：G3BP2-sgRNA1、G3BP2-sgRNA2。

圖1 G3BP2-sgRNA載體的構建Fig.1 Construction of G3BP2-sgRNA vector

2.2 G3BP2-sg RNA 質粒轉染BHK21 細胞的驗證結果（見圖2）

圖2 G3BP2-sg RNA質粒轉染BHK21細胞驗證結果Fig.2 Results of transfection of G3BP2-sg RNA plasmid into BHK21 cells

由圖2 可知，將重組質粒分別瞬時轉染BHK21 細胞，嘌呤霉素篩選，提取細胞基因組DNA 后使用T7核酸內切酶Ⅰ酶切和測序。序列比對結果顯示，sgRNA靶位點處存在雜峰。上述結果表明，重組質粒具有敲除效果。

2.3 穩定敲除G3BP2基因的BHK21細胞系篩選（見圖3）

圖3 穩定敲除G3BP2基因的BHK21細胞系篩選Fig.3 BHK21 cell line screening with stable knockout of G3BP2 gene

試驗共篩選近60株細胞，最后得到7株細胞，將這7株細胞繼續傳代培養以檢測敲除穩定性，在傳代培養至十代后提取蛋白進行WB檢測，結果見圖3（a）。

由圖3（a）可知，有3 株細胞（D9、F8、G9）恢復了G3BP2蛋白表達，但蛋白表達量仍顯著低于野生型細胞的蛋白表達；有3 株細胞（C8、E10、F9）仍幾乎不表達G3BP2蛋白，表明這3 株細胞敲除穩定性良好；而E8 細胞株雖然未表現出蛋白表達，但其在大于70 kD附近存在背景，不排除是非特異性結合。

之后提取C8、E10、F9細胞株的DNA進行PCR擴增及測序，結果顯示，敲除細胞株與野生型細胞株相比發生了約220 bp 大小的堿基片段缺失，結果見圖3（b）。結果表明，經基因敲除及篩選成功生成了3株G3BP2-/-細胞株。

2.4 敲除G3BP2對細胞應激的影響（見圖4）

圖4 敲除G3BP2對細胞應激的影響Fig.4 Effect of G3BP2 knockdown on cellular stress

由圖4 可知，與野生型BHK21 相比，缺失G3BP2 基因的BHK21細胞對外界環境的變化更敏感。在正常情況下BHK21 的細胞形態為梭形，使用DTT 溶液處理細胞1 h后，缺失G3BP2 基因的BHK21 細胞會縮成近圓形并且細胞膜結構不明顯；而野生型的BHK21 細胞仍能夠較好地保持梭形的細胞形態，并與正常細胞形態差別不大。即使在PBS 孵育的條件下，缺失G3BP2 基因的BHK21 細胞形態更易受到影響而變成圓形，而野生型BHK21 的細胞形態幾乎不發生改變。

之后測試G3BP2-/-細胞對熱應激的反應，結果顯示，顯微鏡下觀察發現，與野生型細胞相比，G3BP2-/-細胞抵御熱應激的能力更弱，表現為細胞發生了聚集、團塊化并且大量細胞脫落不再貼壁；而野生型細胞大部分仍可維持貼壁。雖然有研究稱，敲低G3BP2不會影響熱應激形成的應激顆粒的數量[17]，但從眼觀細胞表征來看，不論是DTT 造成的應激還是熱應激，G3BP2-/-均表現出低抵抗性。

3 討論

帶有熒光標簽的EHV-IgD囊膜蛋白表達質粒會使細胞產生熒光斑點。對與gD囊膜蛋白互作的宿主蛋白進一步研究后，本研究猜測產生的熒光斑點為應激顆粒。G3BP1與G3BP2均是參與應激顆粒形成的蛋白，且均可與gD 囊膜蛋白發生相互作用。但有研究表明，敲除G3BP1的小鼠表現出胚胎致死性[18]，因而本試驗選擇對G3BP2進行研究。G3BP2 具有兩種亞型，分別是G3BP2a 和G3BP2b[15,19]，在WB 檢測中有時會出現兩個條帶，分析原因可能與裂解液的強弱以及裂解液的時間長短有關。本研究使用CRISPR-Cas9 系統對編輯該蛋白的基因進行敲除，針對G3BP2 的兩個外顯子分別設計了一對sgRNA，使用sgRNA設計網站（http://crispor.tefor.net/），選擇評分高且脫靶率較低的sgRNA構建到PX459載體上；該載體可表達Cas9 蛋白，并帶有嘌呤霉素抗性，轉染后可使用嘌呤霉素篩選陽性細胞。

本研究先使用單gRNA進行敲除，單克隆篩選后進行WB 檢測，發現篩選出的細胞株仍能夠表達G3BP2 蛋白，測序結果也顯示堿基雖然發生了缺失但并未造成移碼突變。為提高敲除效果，本研究采取雙gRNA共轉染產生片段基因敲除的方式，即將兩個帶有sgRNA的質粒共轉染入BHK21 細胞，再重復之前的篩選步驟。DNA 進行核酸膠電泳成像后，結果發現，部分細胞株不止一個條帶，其原因可能與二倍體有關。此前，本課題組也曾針對DNA 電泳出現兩條帶的細胞進行二次單克隆篩選，發現篩選出的細胞仍為兩條帶。結果表明，sgRNA可能在兩條染色體上發生了不同的切割，或與DNA 自身隨機修復有關。本試驗將幾乎不表達G3BP2蛋白的細胞株繼續培養數代后，檢測這種敲除的穩定性。結果顯示，有3株細胞恢復了蛋白表達，但G3BP2 的表達量仍低于野生型BHK21 細胞。有一株細胞在非目的大小附近出現了條帶，可能屬于抗體非特異性結合，結果成功篩選出幾乎不表達G3BP2蛋白的三株細胞，并且敲除穩定性良好。

隨后本研究使用DTT對G3BP-/-細胞的抗應激能力進行檢測[20]，結果顯示，在相同濃度、處理時間及細胞密度的條件下，經藥物處理后，部分G3BP2-/-細胞形態變圓，部分細胞發生了凋亡，大部分細胞膜結構不再清晰；而野生型細胞的形態表型幾乎不發生變化。之后使用熱應激測試了細胞，發現熱應激同樣會對G3BP2-/-細胞造成損傷，使其發生明顯的表征變化。上述研究結果表明，G3BP2-/-細胞的抗應激能力明顯弱于野生型細胞，這可能與G3BP2蛋白參與細胞抗應激反應有關，缺失G3BP2會導致細胞對無法抵抗多種應激。雖然G3BP2 可能不參與熱休克途徑的應激顆粒的形成[21-22]，但缺失G3BP2的細胞抗應激能力顯著減弱，表明G3BP2本身可能并不單純僅依靠形成應激顆粒保護細胞。

4 結論

本研究利用CRISPR/Cas9 技術成功構建了PX459-G3BP2-sgRNA 重組質粒，并最終得到了穩定的G3BP2-/-細胞系，并通過WB試驗在蛋白水平上驗證其敲除效率并且驗證了其生物學功能。