南疆某規(guī)模化豬場豬瘟病原與抗體的檢測分析

郝 斌，李雪嬌，黎 雙，李蓮瑞*

（ 1. 塔里木大學動物科學學院，新疆 阿拉爾 843300 ； 2. 塔里木畜牧科技兵團重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300 ； 3. 新疆生產(chǎn)建設兵團塔里木動物疫病診斷與防控工程實驗室，新疆 阿拉爾 843300 ）

豬瘟是由豬瘟病毒（CSFV）引起的一種具有高度傳染性的熱性豬疾病[1]。早在十九世紀，豬瘟被首次報道[2]，曾在全球各地廣泛傳播。至十九世紀中葉，歐洲一些國家宣布消除了豬瘟，但時隔不久，宣布消滅豬瘟的國家又一次遭到了豬瘟的侵害[3]。我國自1954 年使用兔化弱毒疫苗對豬群進行免疫接種后，及時地遏制了豬瘟的大范圍流行[4]。目前，世界動物衛(wèi)生組織將豬瘟列為A類傳染病，我國將其列為Ⅱ類傳染病[5]。

CSFV 是黃病毒、瘟病毒屬的1 種相對穩(wěn)定的RNA 病毒[6]。2%的苛性鈉能夠殺滅CSFV，也是最常用的消毒劑[7]。然而，CSFV能夠在4 ℃下存活6 w以上，在-80 ℃條件下可存活多年，在68 ℃的血液中存在30 min 內(nèi)仍具有傳染性[8]。臨床中，感染CSFV的病豬常呈急性發(fā)作，出現(xiàn)嗜睡、體溫高于41 ℃，腹部皮膚、耳尖以及股內(nèi)側(cè)均可見大量出血斑等典型癥狀；慢性型豬瘟病豬的主要特點是生長停滯、貧血、消瘦、腹瀉便秘交替發(fā)生，并常發(fā)展為“僵豬”[9]。豬瘟典型的病理變化主要為淋巴結(jié)出血、水腫，呈紅白色大理石樣外觀，腎呈淺褐色，表面有針狀出血。慢性病豬常在回盲部瓣、盲腸及結(jié)腸黏膜上出現(xiàn)“紐扣狀”潰瘍，白細胞計數(shù)明顯減少，嚴重者可低至3 000 /mm3[10]。本試驗對新疆南部地區(qū)某規(guī)模化豬場的豬瘟病原與抗體進行檢測，了解其豬瘟的免疫情況和感染情況，以期為制定適應當?shù)厣a(chǎn)條件的免疫程序提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣本采集

2023年3—4月隨機采集規(guī)模化豬場480份血清樣品，無菌采集豬抗凝血4～5 mL/頭，冰凍保存送回實驗室，離心取上清液，置于4 ℃恒溫培養(yǎng)箱中保存。

2023 年3—5 月采集規(guī)模化豬場24 份疑似淋巴病料，剪碎至成糊狀，將其裝至2 mL收集管中固定，在組織研磨儀上進行研磨。將組織研磨液做好標記并離心，除去未研碎的組織。

1.1.2 試驗試劑

CSFV ELISA 抗體檢測試劑盒（北京金諾百泰生物技術(shù)有限公司）、RNA提取試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）、反轉(zhuǎn)錄cDNA提取試劑盒（北京全式金生物技術(shù)有限公司）、2×EasyTaq PCR SuperMix（北京全式金生物技術(shù)有限公司）。

1.1.3 試驗儀器

恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學儀器有限公司）、凝膠成像儀（Gel Doc TM XR+/Bio-RAD 公司）、振蕩儀（美國Scientific Industries 公司）、自動酶標儀（美國BIO-RAD+iMarK）、采血器（上海生工生物工程股份有限公司）、離心機（艾本德國及貿(mào)易有限公司）、計時器（上海生工生物工程股份有限公司）、水浴鍋（上海博訊實業(yè)有限公司）、微量移液器（上海生工生物工程股份有限公司）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 ELISA檢測

按照CSFV ELISA 抗體檢測試劑盒說明書操作，檢測血清樣本抗體結(jié)果；試驗完成后使用自動酶標儀測量吸光度值，按照說明書結(jié)果判定方法判定有無CSFV抗體存在。

1.2.2 RT-PCR檢測

1.2.2.1 病毒RNA的提取

按照RNA 提取試劑盒說明書中的操作步驟，進行疑似病料病毒RNA的提取。

1.2.2.2 病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄

按照反轉(zhuǎn)錄cDNA 提取試劑盒說明書中的操作步驟，進行病毒RNA的反轉(zhuǎn)錄。

1.2.2.3 PCR擴增

上游引物：CATGCCCACAGTAGGACTAGC，下游引物：GCAGTATATCGCTTGACAATGTGCCATGTACAGCAGAG），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，預計擴增產(chǎn)物長度約為520 bp。

PCR 反應體系（25 μL）：DNA 模板1 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、2×EasyTaq PCR SuperMix 12.5 μL、滅菌雙蒸水10.5 μL。

PCR 反應程序：95 ℃預變性3 min；95 ℃變性30 s；55 ℃退火30 s；72 ℃延伸25 s；35 個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

得到的PCR擴增產(chǎn)物使用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 豬瘟抗體檢測結(jié)果

2.1.1 不同類別豬群的抗體檢測結(jié)果（見表1）

表1 不同類別豬群抗體檢測結(jié)果Tab.1 Antibody detection results of different categories of pigs

由表1可知，母豬的抗體陽性率為97.2%，高于其他豬群；育肥豬次之，抗體陽性率為90.7%；哺乳仔豬的抗體陽性率最低，為84.6%；公豬和保育豬的抗體陽性率分別為88.9%和89.8%。

2.1.2 不同胎次母豬的抗體檢測結(jié)果（見表2）

表2 不同胎次母豬抗體檢測結(jié)果Tab.2 Antibody detection results of different parity sows

由表2 可知，后備母豬和頭胎母豬的抗體陽性率均為96.6%，2～4胎母豬與5～6胎母豬的抗體陽性率為97.8%。

2.1.3 不同日齡仔豬的抗體檢測結(jié)果（見表3）

表3 不同日齡仔豬抗體檢測結(jié)果Tab. 3 Antibody detection results at different ages of piglet

由表3 可知，7～14 d、15～21 d 的仔豬抗體水平分別為85.7%、83.3%；22～28 d的陽性率最低，為76.9%；29～35 d的仔豬抗體水平又上升至81.8%；36～50 d的仔豬抗體水平繼續(xù)回升，抗體陽性率達到92.3%；而51～70 d 仔豬抗體水平又有所下降，為88.8%。

2.2 CSFV PCR擴增結(jié)果（見圖1）

圖1 CSFV PCR擴增結(jié)果Fig.1 Electrophoretic results of PCR amplification of CSFV

由圖1可知，CSFV PCR擴增后均未檢出目的條帶。

3 討論

全球豬瘟流行區(qū)分為東南亞、中南美洲和加勒比地區(qū)以及歐洲等3個區(qū)域。中亞和南亞豬瘟疫情仍較嚴重；在相對穩(wěn)定的加勒比地區(qū)和中南美洲，豬瘟疫情逐步呈下降趨勢；歐洲的豬瘟疫情仍較為凸顯，是近年來豬瘟的流行中心。加勒比地區(qū)的古巴在1996—2004 年期間發(fā)生了694 起豬瘟疫情，在2005—2011 年期間發(fā)生了1 164 起。在歐洲地區(qū)，德國是最常見出現(xiàn)豬瘟的國家之一。野豬帶毒時間長，是最重要的傳播者之一[11]。近年來，國內(nèi)豬瘟的流行特點越發(fā)復雜，目前流行呈不間斷、范圍廣、散發(fā)性的特點，疾病也經(jīng)歷了從急性到慢性病程的重大變化。我國的豬瘟發(fā)病特點為發(fā)病率低、發(fā)病動物年齡小、無典型的臨床特征[12]。目前，豬瘟是中國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定的強制性免疫的疾病之一，控制豬瘟的主要方法是接種疫苗[13]。但由于飼養(yǎng)水平不均衡、疫苗接種程序不規(guī)范、疫苗質(zhì)量不達標和保存方式不正確等原因，豬瘟在部分地區(qū)仍呈零星發(fā)生[6]。

本研究中，對不同豬群的分析表明，整個豬群中母豬的陽性率為97.2%，處于各豬群中相對最高的水平，這可能與相對穩(wěn)定的免疫接種有關(guān)；對不同胎次母豬的分析表明，后備母豬和頭胎母豬的抗體陽性率最低（96.6%）。結(jié)合采樣情況來看，后備母豬的日齡差異較大，一般豬場自留的后備母豬在進行豬瘟二免后，要等到配種前2個月才進行豬瘟的加強免疫，而這之間有將近3個月的時間，一些母豬可能由于早期的免疫抗體水平不夠高而出現(xiàn)抗體空白期。頭胎母豬抗體水平稍高于后備母豬，但還是不如2 胎以上的母豬，可能由于2 胎以上的母豬已經(jīng)建立了穩(wěn)定的免疫應答機制，在豬瘟免疫或者外源病毒刺激的情況下能夠迅速、有效地產(chǎn)生豬瘟抗體[6]。本研究中，對不同日齡仔豬的分析表明，在7～14 日齡豬瘟抗體陽性率較15～21日齡的仔豬抗體水平有所下降；22～28日齡的豬瘟抗體陽性率繼續(xù)下降，低至76.9%；29～35 日齡開始回升，達到了81.8%；36～50 日齡期間，抗體陽性率有所上升，之后又呈現(xiàn)下降的趨勢。仔豬體內(nèi)的抗體在哺乳期時開始增加，這歸功于母乳中有足量的母源抗體，但仔豬的抗體由于日齡的增加而逐漸減少，并在斷奶后抗體大幅減少[7]，導致這種變化的原因是母源抗體的攝入不足。首免后，仔豬的豬瘟抗體陽性率在35～50日齡開始升高。因此，在母源抗體攝入量不足的情況下，有必要及時進行免疫接種。

本研究中，RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，豬瘟疑似病料均為陰性，表明該規(guī)模化豬場出現(xiàn)的豬瘟疑似豬群未發(fā)生豬瘟感染。

綜合檢測結(jié)果，母豬的抗體水平直接影響哺乳仔豬體內(nèi)的母源抗體水平，關(guān)系到乳豬成活率的大小。因此，在今后的防控工作中應堅持做好母豬的免疫[14]。此外，公豬是養(yǎng)豬場的核心，抗體水平相對較低或感染了CSFV 的公豬會通過精液傳播等方式，給抗體水平較低的母豬帶來危險[15]。因此，對后備公豬的接種應盡可能達到100%的陽性率。同時還需加強豬場飼養(yǎng)管理的工作。

4 結(jié)論

本試驗通過ELISA 對480 份血清樣品進行豬瘟抗體檢測，檢出陽性樣本449 份，陽性率為93.5%。通過PTPCR對24份疑似病料進行檢測，均為陰性，表明該規(guī)模化豬場的豬瘟免疫效果較好，豬瘟疑似豬群未見感染情況。綜上所述，綜合分析豬瘟病毒抗原和抗體水平有利于全面了解豬群的免疫情況，從根源上消除豬瘟帶來的威脅。