在蛋白質(zhì)化學(xué)檢測方法食品安全評估和檢測中的應(yīng)用

黃章程

（福建賽福食品檢測研究所有限公司，福建福州 350100）

民以食為天，當食品發(fā)生安全問題后不僅會使社會的誠信機制受到消極影響，嚴重時還會使廣大人民群眾的生命安全遭遇威脅。進入新時代后，為了有效保障食品安全，提升全民素質(zhì)，完善了原有的食品安全國家標準體系。但是，在實施過程中并不能從根本上杜絕部分商家通過非法手段從事制假、摻假、售假等違法犯罪活動。因而，在當前階段十分有必要加強對食品安全評估和檢測的研討，利用先進的檢測方法提高其評估和檢測效率及質(zhì)量，為食品安全管理提供技術(shù)支撐等。

1 蛋白質(zhì)化學(xué)檢測方法的基本原理

蛋白質(zhì)屬于大分子化合物，由氨基酸脫水而來。化學(xué)組成元素包括了C、O、N、H、S、P 及微量元素等（圖1），理化特性如下：①氨基酸特性；②高分子性質(zhì)；③水合作用；④顯色反應(yīng)等。近幾年蛋白質(zhì)化學(xué)檢測中應(yīng)用的方法主要有兩種，一種是凱氏定氮法，另一種是高效液相色譜法，兩種方法不僅在檢測原理方面存在較大差異，而且適用范圍有所不同。

圖1 蛋白質(zhì)組成元素及含量示意

1.1 以凱氏定氮法為例

該方法已有一百多年的歷史，具有可靠性高、應(yīng)用廣泛的特點。從全球范圍看，多數(shù)國家、專業(yè)檢驗檢測機構(gòu)，都將其作為蛋白質(zhì)檢測方面的標準方法，有效落實到了食品安全評估和檢測之中。目前，我國在食品安全評估和檢測中，將其作為國家標準、行業(yè)標準中的重要方法對其進行了推廣應(yīng)用。從原理方面看，凱氏定氮法包括消化、蒸餾、滴定。具體如下：①消化環(huán)節(jié)主要是在氧化反應(yīng)的條件下把被測樣品中的含氮化合物轉(zhuǎn)化氨氣，同時以硫酸銨的形式分離出其中的氮元素。②蒸餾環(huán)節(jié)主要是把氨從消化產(chǎn)物中分離出來，并通過滴定方式定量分析溶液內(nèi)的氨離子。消化、蒸餾、滴定三大檢測步驟對應(yīng)的化學(xué)反應(yīng)式如下：

1.2 以高效液相色譜法為例

高效液相色譜法（HPLC）屬于色譜法，主要是在經(jīng)典液相色譜法基礎(chǔ)上發(fā)展出來的新型檢測方法，優(yōu)勢集中表現(xiàn)在應(yīng)用范圍大、分離速率高、準確度高、靈敏度高等方面，尤其在揮發(fā)性化合物、高沸點化合物檢測方面具有較好的應(yīng)用效果。目前，在國內(nèi)的食品檢測、環(huán)境監(jiān)測方面，對其進行了推廣應(yīng)用。從原理方面看，該方法主要是從物化性質(zhì)差異出發(fā)，以液體作為流動相，利用高壓輸液系統(tǒng)、物質(zhì)溶解度、物質(zhì)蒸氣壓等，分離物質(zhì)流動相和固定相色譜柱中的物質(zhì)組分。以液相色譜柱分離為例，假定分布系數(shù)、分離因子分別為a和k，可以根據(jù)公式對n個液相色譜柱的分離效率R進行有效計算。具體如下：

2 食品安全評估和檢測中對蛋白質(zhì)化學(xué)檢測方法的應(yīng)用

自《食品安全標準與監(jiān)測評估“十四五”規(guī)劃》實施至今，國家食品安全管理部門、監(jiān)督部門、專業(yè)檢驗檢測機構(gòu)，在食品安全評估和檢測中普遍加強了對凱氏定氮法和高效液相色譜法的應(yīng)用，雖然蛋白質(zhì)檢測中的兩種方法原理、優(yōu)勢、劣勢均存在差異（表1），但是在實際應(yīng)用中可以滿足大部分食品安全精準檢測需求。為了論述的清晰性，下面僅對凱氏定氮法的應(yīng)用展開具體說明。

表1 蛋白質(zhì)檢測方法原理及優(yōu)勢和劣勢

2.1 應(yīng)用現(xiàn)狀

目前，應(yīng)用凱氏定氮法時主要是對食品中的蛋白質(zhì)進行質(zhì)量檢測。但是，當參考值存在較大不確定性時，不能將該方法作為替代方法實現(xiàn)對測定對象的準確評估。例如，應(yīng)用該方法建立參考值的過程中，要求檢測人員對凱氏定氮法的性能做進一步驗證，并對其期望范圍進行確認。事實上，應(yīng)用該方法時牽涉三大檢測步驟，每個步驟中的化學(xué)反應(yīng)比較復(fù)雜，通常的測量時間不低于10 h，并不能滿足當前階段食品安全評估和檢測中對快速測定的要求。為了解決該問題，在離子色譜、凱氏消化方面，可以使用抑制電導(dǎo)檢測方法，進而使消解時間降至1 h 以內(nèi)，同時省去該方法中的其他兩個步驟，進而使分析時間大幅度降低，達到食品安全評估和檢測中對其準確度和精密度的要求。再如，部分不良商家為了牟取暴利，會選擇在食品中摻假牛奶生乳蛋白，此時檢測人員可以利用非蛋白質(zhì)氮（NPN）指數(shù)概念，將該方法與三氯乙酸沉淀法（TCA）進行聯(lián)合應(yīng)用，完成對一系列牛奶樣品非蛋白質(zhì)氮和蛋白質(zhì)氮的檢測。以三聚氰胺為例，當摻假牛奶中的含量小于0.2 mg/kg 時NPN 指數(shù)可達到可辨識范圍（最小值為0.8084，最大值為1.4987）。檢測人員可以根據(jù)該條件，應(yīng)用上述兩種方法的聯(lián)合檢測方式，更為精準地完成對富含氮的摻假牛奶質(zhì)量檢測工作。

2.2 實驗分析

2.2.1 實驗材料

儀器主要包括UV-1800紫外可見分光光度計，石墨消解儀。試劑如下：實驗試劑為聚乙烯醇，基準物為氯化銨、碳酸鈉，分析純包括過氧化氫（30%），溴甲酚綠，甲基紅，鹽酸，氫氧化鈉，硼酸，硫酸銅、硫酸鉀，硫酸，碘化汞（CP），碘化鉀。實驗食品共計7種，分別為清蒸豬肉、原法鯖魚、蠶豆、午餐肉、紅燒肉、咖啡雞、菜籽粕。

2.2.2 實驗方法

首先，實驗人員按0 mL、0.2 mL、0.4 mL、0.8 mL、1.6 mL、2.8 mL、4.0 mL，吸取含N 量為40 mg/mL 的標準氯化銨溶液，通過聚乙烯醇液（0.1 mg/mL）對其進行稀釋處理后，量取奈氏試劑1 mL，加入稀釋液，加入量以25 mL 為準，然后采用比色法在460 nm 位置進行比色，獲取蛋白質(zhì)過氧化凱氏定氮法標準曲線y=0.034 2x+0.121 6，R2=0.9989。

其次，采用電子天平秤取0.25 g 樣品，將其置于凱氏定氮管中，然后添加硫酸4 mL，置于石墨消解儀上300℃加熱3 min 后，以2 mL/min 的速度添加消化劑15 mL（過氧化氫和硫酸比例為4：1）繼續(xù)在石墨消解儀上350℃溫度加熱2 min，完成對過氧化劑的處理后，取出消解管，冷卻后轉(zhuǎn)移并定容至100 mL。按照比色法吸取0.4 mL 樣品進行比色。

第三，根據(jù)GB 5009.5—2016標準要求，應(yīng)用過氧化凱氏定氮法對樣品中的蛋白質(zhì)含量進行測定。為了說明該方法的測定優(yōu)勢，實驗人員同時應(yīng)用常規(guī)凱氏定氮法對樣品中的蛋白質(zhì)進行了測定，記錄了相關(guān)測定數(shù)據(jù)，比較了常規(guī)法、過氧化法的精密度等。

2.2.3 實驗結(jié)果和討論

實驗結(jié)果顯示，在7 個樣品中，應(yīng)用過氧化法測定的蛋白質(zhì)含量在37.62%～38.71%，CV 為0.44%。常規(guī)法測定下的對應(yīng)數(shù)據(jù)為28.0%～38.5%、0.53%。應(yīng)用F 檢驗比較后發(fā)現(xiàn)，兩種方法的精密度不具有顯著差異，基本相同。但是，通過對清蒸豬肉、原法鯖魚、蠶豆、午餐肉、紅燒肉、咖啡雞、菜籽粕七種食品的蛋白質(zhì)含量測定后，發(fā)現(xiàn)二者的對應(yīng)差值，分別為+0.19、+0.73、+0.16、+0.38、-0.45、+0.70、-22。根據(jù)數(shù)理統(tǒng)計理論，對兩種方法進行比較分析：①當測定次數(shù)增多后，兩種方法測定值減差值應(yīng)等于0；②在有限測定次數(shù)內(nèi)，二者的減值不一定等于0，而且與0之間不存在顯著差異。對應(yīng)到統(tǒng)計檢驗方面，檢驗假定條件是H0：u=u0，備樣假設(shè)條件為H1：u≠u0。假定顯著性水平α=0.05，那么，本例中的拒絕域|t|＞t0.05，6=2.45，由此說明檢驗假定條件成立，兩種方法的測定結(jié)果趨于一致。

但是，在測定結(jié)果影響方面，應(yīng)用過氧化劑（ 按0 mL、5 mL、10 mL、15 mL、20 mL、25 mL、30 mL）后，消化時間在2.5～15.0 min，蛋白質(zhì)含量范圍在27.98%～29.98%。經(jīng)過比較發(fā)現(xiàn)，當過氧化劑使用量為5 mL，滴速為2 mL/min 時，菜籽粕蛋白質(zhì)量含量測定結(jié)果方面，基本趨于恒定。對其他樣品進行測定后，發(fā)現(xiàn)15 mL 的過氧試劑應(yīng)用效果相對較好，在滴速不變的情況下消化時間約在7.5 min。從樣品氮回收率方面看，硫酸與過氧化氫發(fā)生反應(yīng)后，主要生成的水和HS03OOH 的，根據(jù)文獻報道和本次實驗經(jīng)驗看，按4：1的比例應(yīng)用30%過氧化氫和氧化劑硫酸，能夠起到較好的氧化效果，加速消化速度。

2.2.4 實驗結(jié)論

通過實驗結(jié)果與討論說明，在食品蛋白質(zhì)含量測定中，應(yīng)用過氧化法，有利于提高凱氏定氮法的應(yīng)用效率，實用性相對較高。

3 結(jié)束語

食品安全評估和檢測在當前階段已變得十分重要，成為食品安全國家標準體系的核心內(nèi)容。建議在實踐中選擇蛋白質(zhì)化學(xué)檢測方法時，先對不同方法下的基本原則全面分析，再根據(jù)不同方法的適用范圍對其進行應(yīng)用。建議在食品評估和檢測實踐中，一方面選擇凱氏定氮法對食品蛋白質(zhì)質(zhì)量進行檢測，另一方根據(jù)面高效液相色譜法的適用范圍，將其應(yīng)用到對食品蛋白質(zhì)含量檢測方面，進而提高該方法的應(yīng)用效果。