轉錄因子EB在衰老心肌細胞自噬中的作用機制研究

盛思琪　謝琳　姜怡鄧　熊建團　楊安寧　吳凱　楊勇　楊曉明

摘要：目的 探討轉錄因子EB（TFEB）在衰老心肌細胞自噬中的作用機制。方法 動物實驗：將20只老年Wistar大鼠采取隨機數字表法分為假手術組（Sham組）和缺血再灌注組（I/R組）。細胞實驗：（1）體外培養大鼠心肌細胞，采用8 g/L D-半乳糖孵育8 d后分為常氧（Normoxia）組和缺氧/復氧（H/R）組。（2）在衰老心肌細胞中分別轉染過表達和干擾TFEB腺病毒分為過表達對照（Ad-GFP）組、過表達對照+缺氧/復氧（Ad-GFP+H/R）組、過表達TFEB（Ad-TFEB）組、過表達TFEB+缺氧/復氧（Ad-TFEB+H/R）組、干擾對照（sh-NC）組、干擾對照+缺氧/復氧（sh-NC+H/R）組、干擾TFEB（sh-TFEB）組、干擾TFEB+缺氧/復氧（sh-TFEB+H/R）組。（3）分別用DNMT1、DNMT3a、DNMT3b的特異性抑制劑DC-05、TFD、NA處理缺氧/復氧后的衰老心肌細胞分為H/R組、DC-05組、TFD組、NA組。（4）在衰老心肌細胞中轉染干擾DNMT3b腺病毒分為干擾對照（sh-NC）組、干擾對照缺氧/復氧（sh-NC+H/R）組、干擾DNMT3b（sh-DNMT3b）組、干擾DNMT3b缺氧/復氧（sh-DNMT3b+H/R）組。實時熒光定量PCR（qPCR）檢測TFEB的mRNA表達水平；Western blot檢測衰老心肌細胞中自噬相關蛋白TFEB、LC3B和p62的蛋白表達；巢式甲基化特異性PCR（nMS?PCR）檢測TFEB啟動子區的DNA甲基化水平。結果 與Sham組或Normoxia組比較，I/R組和H/R組中TFEB的mRNA和蛋白表達水平降低（P＜0.01）；過表達TFEB后，與Ad-GFP組比較，Ad-TFEB組LC3B-Ⅱ/Ⅰ的蛋白表達水平降低，p62的蛋白表達水平升高（P＜0.01），而干擾TFEB后得到相反的結果（P＜0.01）。與Sham組或Normoxia組比較，I/R組和H/R組中TFEB啟動子區DNA甲基化水平升高（P＜0.05）。與H/R組比較，NA組TFEB mRNA和蛋白表達水平升高（P＜0.01）；干擾DNMT3b后，與sh-NC組比較，sh-DNMT3b組TFEB mRNA和蛋白表達水平升高（P＜0.01）。結論 DNMT3b通過調控TFEB啟動子區DNA甲基化抑制TFEB的表達，進而促進衰老心肌細胞自噬。

關鍵詞：肌細胞，心臟；細胞衰老；轉錄因子EB；細胞自噬；DNA甲基化；DNMT3b

中圖分類號：R542.2文獻標志碼：ADOI：10.11958/20220920

Study on the mechanism of transcription factor EB in autophagy of aging cardiomyocytes

SHENG Siqi XIE LinJIANG Yideng XIONG Jiantuan YANG Anning WU Kai YANG Yong YANG Xiaoming

1 School of Basic Medical Sciences， Ningxia Medical University， Yinchuan 750004， China; 2 NHC Key Laboratory of Metabolic Cardiovascular Diseases Research， Ningxia Medical University; 3 Ningxia Key Laboratory of Vascular

Injury and Repair Research， Ningxia Medical University; 4 Ningxia Hui Autonomous Region People's Hospital

Corresponding Author E-mail： xmyang327@126.com

Abstract： Objective To explore the mechanism of transcription factor EB （TFEB） in autophagy of aging cardiomyocytes. Methods Animal experiment： Twenty aged Wistar rats were randomly divided into the sham operation group （Sham group） and the ischemia-reperfusion injury group （I/R group）. Cell experiments： （1） Aging cardiomyocytes were cultured in vitro， incubated with 8 g/L D-galactose for 8 days， and then divided into the normoxia group and the hypoxia/reoxygenation group （H/R group）. （2） Aging cardiomyocytes transfected by adenovirus overexpressing and interfering with TFEB were divided into the Ad-GFP group， the Ad-GFP+H/R group， the Ad-TFEB group， the Ad-TFEB+H/R group， the sh-NC group， the sh-NC+H/R group， the sh-TFEB group and the sh-TFEB+H/R group. （3） Aging cardiomyocytes treated with specific inhibitors of DNMT1， DNMT3a and DNMT3b after hypoxia/reoxygenation were divided into the H/R group， the DNMT1 specific inhibitor （DC-05） group， the DNMT3a specific inhibitor （TFD） group and the DNMT3b specific inhibitor （NA） group. （4） Aging cardiomyocytes transfected by adenovirus interfering with DNMT3b were divided into the sh-NC group， the sh-NC+H/R group， the sh-DNMT3b group and the sh-DNMT3b+H/R group. Quantitative real-time PCR （qPCR） was used to detect the mRNA level of TFEB， and Western blot assay was used to detect the autophagy related proteins TFEB， LC3B and p62 in aging cardiomyocytes. The DNA methylation levels of TFEB promoter in aging myocardium and cardiomyocytes were detected by nested methylation specific PCR （nMS-PCR）. Results Compared with the Sham group or the normoxia group， the mRNA and protein expression of TFEB were decreased in the I/R group and the H/R group （P＜0.01）. The protein expression of LC3B-Ⅱ/Ⅰ was decreased in aging cardiomyocytes after overexpression of TFEB in the Ad-TFEB group compared with the Ad-GFP group， while the protein expression of p62 was increased （P＜0.01）. The opposite results were obtained after interfering with TFEB （P＜0.01）. Compared with the Sham group or the normoxia group， the DNA methylation level of the TFEB promoter was increased in the I/R group and the H/R group （P＜0.05）. Compared with the H/R group， it was found that the mRNA and protein expression level of TFEB were increased in the NA group （P＜0.01）. And the TFEB mRNA and protein expression were increased in aging cardiomyocytes after overexpressed interference with DNMT3b （P＜0.01）. Conclusion DNMT3b inhibits the TFEB expression by regulating DNA methylation of TFEB promoter， thus to promote autophagy of aging cardiomyocytes.

Key words： myocytes， cardiac; cell aging; transcription factor EB; autophagy; DNA methylation; DNMT3b

目前，心血管疾病的發病率在全球呈上升趨勢，而心肌缺血再灌注（I/R）損傷是一個復雜且多因素的病理過程，與急性心肌梗死（AMI）等缺血性心臟病的發生關系密切［1-2］。研究發現，在老年人和患病心臟中存在大量衰老細胞，最終促使心臟結構和功能變化，引起左心室肥厚和舒張功能下降，細胞外基質重構、心肌纖維化增加，傳導阻滯等病理改變［3-4］。缺血性心臟疾病主要以衰老心肌細胞損傷為主，進而引起收縮功能和內源性抗不可逆損傷能力的喪失［5-6］。自噬（autophagy）是真核生物細胞內溶酶體降解的途徑，通過溶酶體或胞液進行“饑餓”狀態下的營養動員，從而清除受損蛋白質，受到自噬相關蛋白（ATG）和轉錄因子的嚴格調控［7］。研究顯示，自噬參與I/R損傷病理過程，且與老年個體的心臟功能紊亂、抗損傷能力降低密切相關［8-9］。轉錄因子EB（transcription factor EB，TFEB）可維持細胞自噬穩定，與自噬基因的啟動子區結合，誘導自噬體的生物合成，并調控關鍵因子自噬體-溶酶體的轉錄［10-11］。然而，TFEB影響衰老心肌細胞自噬的機制尚不明確，亦鮮見相關研究。本研究旨在探討TFEB對衰老心肌自噬的影響及可能調控機制，以期為老年心肌損傷的防治提供新的理論支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料 大鼠心肌H9c2細胞購自中國科學院細胞庫（上海，中國）。20只SPF級雄性Wistar大鼠購自寧夏醫科大學實驗動物中心［動物生產許可證號：SCXK（寧）2020-0001］，22～24個月，體質量600～700 g。胎牛血清、DMEM高糖培養基購自美國Gibco公司；D-（+）半乳糖購自北京金克隆公司；DNMT1特異性抑制劑DC-05、DNMT3a特異性抑制劑（theaflavin 3，3-digallate，TFD）、DNMT3b特異性抑制劑（nanaomycin A，NA）購自美國MCE公司；DNA甲基化修飾試劑盒購自美國ZYMO公司；胰蛋白酶消化液購自上海碧云天公司；BCA蛋白定量試劑盒、蛋白提取試劑盒購自南京凱基公司；實時熒光定量PCR（qPCR）試劑盒、反轉錄試劑盒購自日本Takara公司；總RNA提取試劑盒購自北京天根公司；兔源一抗p62、兔源一抗LC3B均購自英國Abcam公司；兔源一抗TFEB購自上海Abmart公司；鼠源一抗內參蛋白β-actin、羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗購自北京中杉金橋公司；TFEB和GAPDH引物由上海生工公司合成；過表達TFEB腺病毒（Ad-TFEB）、干擾TFEB腺病毒（sh-TFEB）及干擾DNMT3b腺病毒（sh-DNMT3b）購自上海吉瑪制藥技術有限公司。

1.2 動物實驗 20只大鼠按隨機數字表法分為假手術（Sham）組和I/R組，每組10只。I/R組大鼠麻醉后行氣管插管，連接小動物呼吸機，監測大鼠心電圖。沿胸骨左緣平左腋線處切開皮膚約2 cm，于左心耳根部下方2 mm處用5-0無創縫合針穿過心肌表層，在肺動脈圓錐旁出針。觀察心電圖，心率穩定15 min后，用縫合針的兩頭穿過壓迫管，止血鉗在壓迫管另一頭夾閉，以終止左冠狀動脈前降支血流，30 min后松結扎線，然后松開止血鉗恢復血流灌注2 h。心肌缺血成功的標志：心電圖Ⅱ導聯ST段弓背向上抬高0.4 mV以上。心電監護截取缺血波，再灌注波證實模型成功。Sham組只穿線不結扎，再灌注2 h，2組大鼠均存活。造模結束后，麻醉處死并取大鼠心尖部，迅速切除并冷凍在液氮中用于后續實驗。

1.3 細胞實驗

1.3.1 細胞培養 H9c2細胞在10%胎牛血清和1%雙抗的DMEM高糖培養基中培養。當細胞密度占培養瓶底面積80%時用胰蛋白酶消化進行傳代，傳至第3代時取對數生長期細胞進行后續實驗。采用8 g/L D-半乳糖誘導其衰老8 d后，分為常氧（Normoxia）組和缺氧/復氧（H/R）組，其中H/R組的衰老心肌細胞置于缺氧（1%O2，5%CO2）培養箱中180 min，再復氧（5%CO2和37 ℃）120 min［12］。

1.3.2 腺病毒轉染 （1）TFEB腺病毒轉染：將攜帶綠色熒光蛋白（GFP）的Ad-TFEB和sh-TFEB分別轉染衰老心肌細胞后，分為過表達對照（Ad-GFP）組、過表達對照+缺氧/復氧（Ad-GFP+H/R）組、過表達TFEB（Ad-TFEB）組、過表達TFEB+缺氧/復氧（Ad-TFEB+H/R）組、干擾對照（sh-NC）組、干擾TFEB+缺氧/復氧（sh-TFEB+H/R）組，用于TFEB表達自身驗證及自噬相關指標檢測。（2）DNMT3b腺病毒轉染：將干擾DNMT3b腺病毒（sh-DNMT3b）轉染衰老心肌細胞后，分為干擾對照（sh-NC）組、干擾對照缺氧/復氧（sh-NC+H/R）組、干擾DNMT3b（sh-DNMT3b）組、干擾DNMT3b缺氧/復氧（sh-DNMT3b+H/R）組，用于TFEB啟動子區甲基化水平檢測。

1.3.3 藥物處理 分別使用DNMT1特異性抑制劑DC-05、DNMT3a特異性抑制劑TFD、DNMT3b特異性抑制劑NA處理衰老心肌細胞，缺氧/復氧后分為H/R組、DC-05組、TFD組、NA組，用于TFEB啟動子區甲基化水平檢測。

1.4 qPCR檢測TFEB表達 提取1.2、1.3.1、1.3.2和1.3.3中各組的總RNA并反轉錄為cDNA。使用qPCR試劑盒在FTC3000反應系統進行擴增。總反應體系：PCR Mix 10 μL、H2O 6 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 2 μL，共20 μL。TFEB引物序列：上游5'-GTTCACTTCCAGTCGCCACCAC-3'，下游5'-GTTCACTTCCAGTCGCCACCAC-3'；GAPDH引物序列：上游5'-GACCTGACCTGCCGTCTA-3'，下游5'-AGGAGTGGGTGTCGCTGT-3'。TFEB和GAPDH引物由生工生物工程股份有限公司（中國上海）合成，反應條件：95 ℃ 2 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 10 s，共40個循環。以GAPDH為內參，2-ΔΔCt法計算TFEB相對表達量。

1.5 Western blot檢測TFEB、LC3B和p62的蛋白表達 提取1.2和1.3中各組蛋白。根據BCA法進行蛋白定量調整上樣體積。每組30 ?g總蛋白進行SDS-PAGE凝膠電泳、轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，4 ℃一抗孵育過夜：TFEB（1∶500）、p62（1∶10 000）、LC3B（1∶2 000）及β-actin（1∶1 000）。加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗兔和羊抗鼠二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，使用ECL化學發光試劑顯影曝光。應用Image Lab軟件對檢測結果的灰度值進行分析，以β-actin為內參，計算目的蛋白相對表達水平。

1.6 巢式甲基化特異性PCR（nMS-PCR）檢測TFEB啟動子區DNA甲基化水平 按DNA提取試劑盒說明書分別提取1.2和1.3.1各組中的全基因組DNA，亞硫酸鹽修飾法對全基因組DNA進行甲基化修飾。nMS-PCR法檢測TFEB啟動子區DNA甲基化水平的改變，反應體系：PCR Mix 12.5 μL、H2O 7 μL、上下游引物各1 μL、已修飾的DNA 3.5 μL，共25 μL。外引物擴增的反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，20個循環，72 ℃ 7 min，4 ℃ 保溫。以外引物的PCR產物為模板，進行內外引物的擴增，反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，59.5 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，20個循環；72 ℃ 7 min，4 ℃ 保溫。取5 μL PCR產物于2%瓊脂糖凝膠上電泳，用凝膠成像分析儀成像分析，按如下公式進行計算：甲基化=（甲基化OD值）/（甲基化OD值+非甲基化OD值）×100%。針對TFEB啟動子區，由在線（http：//www.urogene.org/cgi?bin/methprimer/methprimer.cgi）設計一對外引物及兩對內引物，引物序列見表1。

1.7 統計學方法 采用GraphPad Prism 8.0進行數據分析。符合正態分布的計量資料以x±s表示，2組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TFEB在衰老心肌組織和心肌細胞中的表達情況 動物實驗中，與Sham組（1.785±0.938）比較，I/R組心肌組織TFEB的mRNA（0.509±0.300）表達水平均降低（n=10，t=4.098，P＜0.01）；與Sham組（0.690±0.178）比較，I/R組心肌組織TFEB蛋白（0.266±0.047）表達水平亦降低（n=10，t=7.276，P＜0.01）。細胞實驗中，與Normoxia組（1.375±0.161）比較，H/R組TFEB mRNA（0.790±0.074）表達水平降低（n=3，t=5.713，P＜0.01）；與Normoxia組（0.674±0.012）比較，H/R組TFEB蛋白（0.231±0.084）表達水平亦降低（n=3，t=9.077，P＜0.01），見圖1。

2.2 干擾和過表達TFEB對衰老心肌細胞自噬的影響

2.2.1 過表達和干擾TFEB后自身驗證 細胞實驗中，與Ad-GFP組（0.265±0.012）比較，Ad-TFEB組的TFEB蛋白（0.724±0.167）表達水平增加（n=3，t=4.733，P＜0.01）；與sh-NC組（1.201±0.044）比較，sh-TFEB組的TFEB蛋白（0.804±0.083）表達水平降低（n=3，t=7.312，P＜0.01），見圖2。

2.2.2 TFEB對衰老心肌細胞自噬的影響 過表達TFEB后，與Ad-GFP組比較，Ad-TFEB組中LC3B-Ⅱ/Ⅰ的蛋白表達水平降低，p62的蛋白表達水平升高（P＜0.01）；與Ad-GFP+H/R組比較，Ad-TFEB+H/R組中LC3B-Ⅱ/Ⅰ表達水平降低，p62的蛋白表達水平升高（P＜0.01）。干擾TFEB后，與sh-NC組比較，sh-TFEB組中LC3B-Ⅱ/Ⅰ的蛋白表達水平升高，而p62的蛋白表達水平降低（P＜0.01）；與sh-NC+H/R組相比，sh-TFEB+H/R組中LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表達水平升高，而p62的蛋白表達水平降低（P＜0.01），見圖3、表2。

2.3 TFEB啟動子區的DNA甲基化對TFEB表達的影響

2.3.1 衰老心肌組織和心肌細胞中TFEB啟動子區的DNA甲基化水平 Methprimer在線預測發現，TFEB啟動子區具有3個CPG島，nMS-PCR法檢測結果顯示：在動物實驗中，與Sham組（0.495±0.040）比較，I/R組TFEB啟動子區的DNA甲基化水平（0.683±0.078）升高（n=10，t=6.797，P＜0.01）；在細胞實驗中，與Normoxia組（0.483±0.015）比較，H/R組TFEB啟動子區的DNA甲基化水平（0.690±0.108）亦升高（n=3，t=3.277，P＜0.05），見圖4。

2.3.2 DNA甲基化轉移酶抑制劑對衰老心肌細胞中TFEB表達的影響 與H/R組比較，NA組TFEB mRNA和蛋白表達均升高（P＜0.05），而DC-05組和TFD組TFEB的mRNA和蛋白水平差異無統計學意義，見圖5、表3。

2.4 DNMT3b對衰老心肌細胞中TFEB表達的影響 與sh-NC組比較，sh-DNMT3b組的TFEB mRNA和蛋白表達水平均升高（P＜0.05）；與sh-NC+H/R組比較，sh-DNMT3b+H/R組的TFEB mRNA和蛋白表達水平亦升高（P＜0.05），見圖6、表4。

3 討論

隨著我國老齡化進程的加速，老年人心血管事件發生率增加，探尋防治老年人心血管疾病的潛在靶點是亟待解決的臨床問題［13］。心肌細胞衰老導致的心肌損傷是影響心血管病發生的主要因素，深入探討衰老心肌損傷的機制具有重要的臨床意義［14］。心肌I/R損傷是心肌長時間缺血后恢復供血心肌損傷更加嚴重的一種病理現象［15］。然而，目前尚無有效防治心肌I/R損傷的方法。在心肌I/R損傷過程中，自噬發揮著重要作用。Li等［16］通過體內和體外研究發現，Caspase招募域含蛋白9（CARD9）可激活自噬和恢復自噬通量，對心肌I/R損傷起保護作用。本課題組前期通過體外培養衰老心肌細胞，缺氧/復氧后模擬I/R的病理環境，發現衰老心肌細胞自噬水平升高，提示抑制其自噬可能是減輕心肌I/R損傷的潛在作用機制［17］。

TFEB是MITF-TFE家族成員之一，屬于堿性螺旋-環-螺旋亮氨酸拉鏈類轉錄因子［18］。研究顯示，TFEB是溶酶體-自噬途徑最重要的轉錄調節因子，負責控制溶酶體生物發生和功能、自噬和囊泡通量，可直接調控自噬相關基因表達［19］。在哺乳動物體內，TFEB去磷酸化后，核易位激活自噬信號通路，自噬體與溶酶體融合發揮降解作用，大分子釋放到細胞質中被重新利用，維持了細胞內環境的穩定［20］。本研究發現，I/R處理的衰老心肌組織和H/R處理的衰老心肌細胞與正常衰老心肌組織和細胞相比TFEB表達水平均降低，提示TFEB可能與衰老心肌細胞自噬有關。細胞自噬是Atg、Rubicon等多種自噬相關基因和關鍵蛋白參與的動態過程，可通過這些分子的表達水平來評估自噬活性［21］。LC3分為Ⅰ型、Ⅱ型，自噬未發生時，可溶性的LC3-Ⅰ型蛋白分布于細胞表面；當自噬發生時，位于細胞表面的LC3-Ⅰ與磷脂酰乙醇胺耦聯形成LC3-Ⅱ并附著在自噬體膜上，由于LC3-Ⅱ始終穩定地定位在自噬體膜上，直到與溶酶體融合，理論上可以通過計算LC3-Ⅱ或LC3-Ⅱ/Ⅰ的比值來評價自噬水平的高低［22］。p62也是自噬反應發生過程中的重要銜接分子，其水平變化與自噬強弱呈負相關，常與LC3共同用于判斷自噬反應活性［23］。本研究結果顯示，在缺氧/復氧條件下，過表達TFEB后衰老心肌細胞中LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表達水平較Ad-GFP+H/R組降低，而p62的蛋白表達水平升高，表明TFEB可以通過調控自噬標志物LC3B和p62的表達抑制衰老心肌細胞自噬，進而保護I/R損傷的心肌，但其具體機制還有待進一步研究。

DNA甲基化是一種在原核和真核生物基因組中常見的復制后表觀遺傳修飾［24］。DNA甲基化常發生在富含CPG島序列的胞嘧啶5'端，可使被修飾的DNA空間結構或染色體結構發生改變而導致基因表達改變［25］。本研究通過Methprimer在線預測TFEB的CPG島發現，TFEB啟動子區具有3個CPG島，這為TFEB啟動子區發生DNA甲基化提供結構基礎。目前，DNA甲基化作為一種調控TFEB表達的機制日益成為研究的熱點，但是關于TFEB啟動子區DNA異常甲基化與衰老心肌細胞自噬的相關性研究尚屬于全新的領域。本研究發現，I/R處理的衰老心肌組織和H/R處理的衰老心肌細胞中TFEB啟動子區的DNA甲基化水平與正常衰老心肌組織和細胞相比均提高，提示TFEB的表達水平受到DNA甲基化調控。DNA甲基化主要是在甲基化轉移酶的催化下，DNA序列中的腺嘌呤或胞嘧啶與甲基發生共價結合，而哺乳動物細胞中DNA甲基轉移酶主要分為DNMT1、DNMT3a和DNMT3b［26］。其中，DNMT1為持續性甲基轉移酶，主要參與DNA復制新合成鏈的完全甲基化，DNMT3a和DNMT3b主要參與從頭甲基化［27］。本研究中分別用甲基轉移酶特異性抑制劑DC-5、TFD、NA處理衰老心肌細胞，發現用NA處理后，衰老心肌細胞中TFEB的表達上升，提示DNMT3b可參與衰老心肌細胞中TFEB啟動子區的DNA甲基化，進一步干擾DNMT3b后發現TFEB的表達亦上升，證實了DNMT3b參與衰老心肌細胞自噬過程中TFEB表達的調控。

綜上所述，TFEB在衰老心肌細胞自噬過程中表達降低，DNMT3b通過調節TFEB啟動子區的DNA甲基化水平，從而抑制衰老心肌細胞自噬過程中TFEB的表達，TFEB可作為治療心肌I/R損傷的潛在分子靶點，有望為臨床上老年心肌I/R損傷的防治提供更多參考。

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（2022-06-21收稿 2022-08-16修回）

（本文編輯 陸榮展）