下調細胞膜調控蛋白Paralemmin-3表達對肺泡巨噬細胞極化的調控作用▲

陳旭昕 唐 璐 王 凡 劉 夢 李虎明 韓志海

(1 中國人民解放軍總醫院第六醫學中心呼吸與危重癥醫學科, 北京市 100037; 2 北京泰康燕園康復醫院老年內科, 北京市 102200)

肺泡巨噬細胞是“肺微環境”中數量最多的炎癥細胞,其作為機體固有免疫系統的“第一道防線”,在諸多肺部疾病(如慢性阻塞性肺疾病、急性呼吸窘迫綜合征等)中發揮著重要作用[1-2]。極化是決定巨噬細胞功能狀態最重要的亞細胞事件,調控肺泡巨噬細胞的極化方向是治療炎癥失控性疾病的潛在方案[3-4]。細胞膜調控蛋白Paralemmin-3(PALM3)是Paralemmin蛋白家族成員之一,我們在前期研究中發現PALM3表達于巨噬細胞系NR8383細胞的細胞膜,調控PALM3表達可以影響巨噬細胞的炎癥反應[5],但PALM3能否調控巨噬細胞的極化方向目前尚未見文獻報告。因此,本研究擬在體外誘導NR8383細胞極化為M1型肺泡巨噬細胞和M2型肺泡巨噬細胞,比較不同極化狀態下NR8383細胞中PALM3的表達差異,并利用小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)下調PALM3在NR8383細胞中的表達,觀察下調PALM3表達對NR8383細胞極化方向的影響,以期為巨噬細胞極化失衡相關疾病的診療提供更多的實驗室依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑 大鼠肺泡巨噬細胞系NR8383細胞來源于美國典型培養物保藏中心。Control-siRNA、PALM3-siRNA、抗大鼠PALM3多克隆抗體購于Santa Cruz Biotechnology公司(批號分別為sc-37007、sc-97537、sc-248213),TRIzol裂解液(批號:12183555CN)、轉染試劑LipofectamineTM2000和Opti-MEMTM減血清培養基購于Invitrogen 公司(批號分別為11668019、31985062),脂多糖(E.coil 0111:B4)購于Sigma-Aldrich Lab &Production Materials公司(批號:297-473-0),Ham′s F12培養基和胎牛血清購自Gibco公司(批號分別為21127022、10100-147-FBS),大鼠腫瘤壞死因子 α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細胞介素(interleukin,IL)-10 ELISA試劑盒購自R&D Systems公司(批號分別為RTA00、R1000),4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)、細胞總蛋白提取試劑盒、Cy3標記的相應二抗、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的相應二抗、增強型ECL發光試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司(批號分別為C1002、P0013、A0502、A0181、P0018S),反轉錄試劑(TaKaRa PrimeScript RT Reagent Kit)及實時熒光定量PCR試劑(SYBR Green qPCR Master Mix-SYBR Advantage)購自寶生物工程(大連)有限公司(批號分別為RR037A、639676)。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養:在37.0 ℃、5% CO2、95%濕度條件下,將NR8383細胞培養于含10%胎牛血清的Ham′s F12培養基,每隔1 d換液1次,2～3 d傳代1次。取處于對數生長期的細胞用于實驗。

1.2.2 免疫熒光法檢測NR8383細胞中PALM3的表達:將對數生長期NR8383細胞按3×106個/孔的密度接種至鋪有載玻片的6孔板中,按照前述細胞培養方案培養細胞。待細胞融合為70%時吸取培養基終止培養,加入含4%多聚甲醛的PBS室溫固定20 min。用含100 mmol/L甘氨酸的PBS清洗后,加入含0.3% Triton X-100的PBS處理細胞20 min。用PBST潤洗細胞3次,滴加牛血清白蛋白封閉液后于室溫下封閉30 min。加入稀釋后(1 ∶100)的抗大鼠PALM3多克隆抗體,4 ℃孵育過夜。用PBS充分洗脫后再在載玻片上滴加Cy3標記的二抗,避光孵育2 h,DAPI 染核。用PBST潤洗3 次,滴加防熒光猝滅劑后,蓋上蓋玻片并封片,在熒光顯微鏡(Leica公司,型號:DM2500)下觀察并拍照。

1.2.3 細胞分組與處理:(1)按照1.2.2的方法將NR8383細胞接種至24孔板中,待細胞融合為70%時,分別給予100 ng/mL脂多糖、20 ng/mL IL-4刺激12 h[6],然后更換含10%胎牛血清的Ham′s F12培養基繼續培養24 h,經脂多糖、IL-4刺激的NR8383細胞分別被認定為M1型、M2型肺泡巨噬細胞。將未經干預的正常NR8383細胞作為M0型肺泡巨噬細胞。提取M0型、M1型和M2型肺泡巨噬細胞的總RNA和總蛋白,用實時熒光定量PCR、Western blot分別檢測PALM3的mRNA、蛋白相對表達水平,每組設置3個復孔,實驗重復3次。(2)按照1.2.2的方法將NR8383細胞接種至24孔板中,待融合度達70%時用于質粒轉染。將NR8383細胞分為Control-siRNA組、PALM3-siRNA組和正常對照組進行實驗。按照說明書中的操作步驟,用50 μL Opti-MEMTM減血清培養基分別稀釋20 pmoL Control-siRNA、20 pmoL PALM3-siRNA及1μL LipofectamineTM2000,再將siRNA和LipofectamineTM2000均勻混合,共同孵育20 min。然后將含Control-siRNA、PALM3-siRNA的混合液分別加入Control-siRNA組、PALM3-siRNA組的NR8383細胞,在37 ℃、5% CO2、95%濕度條件下孵育6 h后,更換為含10%胎牛血清的Ham′s F12培養基繼續培養48 h。正常對照組NR8383細胞除常規換液外,不給予其他額外操作。取3組部分NR8383細胞,用實時熒光定量PCR、Western blot分別檢測PALM3的mRNA、蛋白相對表達水平;取3組剩余細胞,分別給予100 ng/mL脂多糖或20 ng/mL IL-4刺激12 h后,收集上清液和NR8383細胞,采用ELISA檢測上清液中TNF-α及IL-10含量,采用實時熒光定量PCR檢測NR8383細胞中CD80、誘導型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)、CD206、精氨酸酶1(arginase 1,ARG1)的mRNA相對表達水平。每組設置3個復孔,實驗重復3次。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測PALM3、CD86/iNOS、CD206/ARG1 mRNA相對表達水平:收集經過上述分組處理的NR8383細胞,使用PBS充分沖洗細胞后,加入TRIzol裂解液提取總RNA,然后根據反轉錄試劑說明書制備cDNA。參照實時熒光定量PCR 試劑說明書進行檢測,所使用的儀器為QIAGEN公司Rotor Gene 3000型實時熒光定量PCR儀。PCR反應體系為cDNA 2 μL、330 ng/μL的上下游引物各0.5 μL、2×SYBR Green 反應液10 μL,加ddH2O至20 μL。反應條件:94 ℃ 3 min;94 ℃ 10 s,55 ℃ 20 s,72 ℃ 20 s,共40個循環;溶解曲線溫度為65 ℃～95 ℃,每5 s增加0.5 ℃,讀板。以GAPDH為內參。引物由寶生物工程(大連)有限公司設計及合成,引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2.5 Western blot檢測PALM3蛋白相對表達水平:收集經過上述分組處理的NR8383細胞,利用細胞總蛋白提取試劑盒提取各組NR8383細胞總蛋白,采用Bradford法測定總蛋白濃度,取等量總蛋白行SDS-PAGE,經半干電轉至PVDF膜上,將PVDF膜放入封閉袋中,然后在封閉袋中加入由TBST配制的5%脫脂奶粉封閉液,37 ℃放置2 h后,加入稀釋后(1 ∶500)的抗大鼠PALM3多克隆抗體10 μL,4 ℃放置過夜。次日將膜取出,用TBST洗膜3次(10 min/次)后,再放入另一個潔凈的封閉袋中,加入相對應的5%脫脂奶粉稀釋的HRP標記二抗(1 ∶2 500)10 μL,37 ℃放置2 h。用增強型ECL發光試劑盒顯影、曝光后,使用AlphaImager 2200型成像系統(Alpha Innotech公司)掃描,用ImageJ圖像分析軟件進行灰度值分析。

1.2.6 ELISA檢測上清液TNF-α及IL-10含量:收集經過上述分組處理的細胞培養上清液,采用ELISA檢測TNF-α及IL-10含量,參照說明書進行操作。每個樣本設置3個復孔,實驗重復3次。

1.3 統計學分析 應用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,多重比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 NR8383細胞中PALM3的表達情況 免疫熒光檢測結果提示,PALM3在NR8383細胞中有表達,且主要分布于NR8383細胞的細胞膜上,見圖1。

圖1 NR8383細胞中PALM3的免疫熒光檢測結果(×200)

2.2 3種肺泡巨噬細胞中的PALM3 mRNA和蛋白相對表達水平的比較 M1型肺泡巨噬細胞、M0型肺泡巨噬細胞、M2型肺泡巨噬細胞中PALM3的mRNA和蛋白相對表達水平依次降低(P<0.05),見表2和圖2。

圖2 PALM3 蛋白在M0型、M1型及M2型肺泡巨噬細胞中的表達情況

表2 3種NR8383肺泡巨噬細胞中PALM3 mRNA和蛋白相對表達水平的比較(x±s)

2.3 下調PALM3表達對NR8383細胞中PALM3 mRNA和蛋白表達水平的影響 PALM3-siRNA組NR8383細胞中PALM3 mRNA和蛋白相對表達水平低于正常對照組及Control-siRNA組(P<0.05),而正常對照組及Control-siRNA組上述指標的差異無統計學意義(P>0.05),提示轉染成功,見表3和圖3。

圖3 3組NR8383細胞中的PALM3 蛋白表達情況

表3 3組NR8383細胞中PALM3的mRNA和蛋白相對表達水平比較(x±s)

2.4 下調PALM3表達對NR8383細胞極化為M1型肺泡巨噬細胞及分泌促炎因子的影響 經轉染siRNA及脂多糖刺激后,與正常對照組及Control-siRNA組相比,PALM3-siRNA組NR8383細胞M1型表面標志物CD86和iNOS的mRNA相對表達水平下調,上清液TNF-α含量降低 (P<0.05),見表4。

表4 3組NR8383細胞中CD86和iNOS mRNA相對表達水平及上清液TNF-α含量的比較(x±s)

2.5 下調PALM3表達對NR8383細胞極化為M2型肺泡巨噬細胞及抗炎因子的影響 經轉染siRNA及IL-4刺激后,與正常對照組及Control-siRNA組相比,PALM3-siRNA組NR8383細胞M2型表面標志物CD206和ARG1 mRNA相對表達水平上調,上清液IL-10含量升高(P<0.05),見表5。

表5 3組NR8383細胞中CD206和ARG1 mRNA相對表達水平及上清液IL-10含量的比較(x±s)

3 討 論

成熟的巨噬細胞在各種因素下出現表型及形態變化,即巨噬細胞的極化現象,不同極化狀態的巨噬細胞在維持免疫穩態及宿主防御中起著不同的作用[7]。肺泡巨噬細胞具有較強的可塑性和功能異質性,容易受到表觀遺傳學和免疫代謝微環境等因素的影響而分化為具有不同功能表型的巨噬細胞[8-9]。M1/M2二分法是巨噬細胞極化經典的分型方式,M1型巨噬細胞具有強大的促炎及抗原提呈能力,對病原體及腫瘤發揮宿主免疫清除功能[10];M2型巨噬細胞具有抗炎、促進傷口愈合和纖維化、修復組織、促進腫瘤生長和浸潤的作用[11-12]。M1型巨噬細胞過度浸潤時可分泌大量一氧化氮、活性氧簇、IL及TNF-α等因子從而引起強烈的炎癥反應,同時其可分泌基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)2、MMP9等因子從而降解細胞外基質,引發更多炎癥細胞浸潤到損傷組織周圍而加重炎癥反應[13]。促進M1型巨噬細胞向M2型巨噬細胞轉變,增加損傷組織中M2型巨噬細胞的數量可緩解炎癥反應從而改善疾病的預后[14]。因此,調控巨噬細胞的極化方向是治療炎癥失控性疾病的潛在方案。

巨噬細胞極化是多種因子相互作用的過程,受胞內多種信號分子及其通路的調控[15]。PALM3屬于Paralemmin蛋白家族,于1992年首次在非洲爪蛙中發現,也被稱為Xlgv7/Xlcaax-1[16]。本研究結果顯示,PALM3在肺泡巨噬細胞系NR8383細胞中有表達,主要定位于細胞膜上,且其在不同極化狀態的肺泡巨噬細胞中的表達存在差異,在M1型肺泡巨噬細胞中呈現高表達,而在M2型肺泡巨噬細胞中呈現低表達,提示PALM3的表達豐度與肺泡巨噬細胞極化狀態有關,PALM3可能成為M1型肺泡巨噬細胞的新型特征性標志物,有助于巨噬細胞亞群的分析和鑒定。但鑒于巨噬細胞的高度異質性,PALM3分子是否能影響M1/M2型以外的其他巨噬細胞亞群,仍有待進一步研究。

本研究進一步下調PALM3表達,觀察其對肺泡巨噬細胞極化方向及分泌炎癥因子的影響,結果顯示,經轉染siRNA及脂多糖刺激后,與正常對照組及Control-siRNA組相比,PALM3-siRNA組NR8383細胞M1型表面標志物表達水平下調,上清液TNF-α含量降低,這提示PALM3是促進肺泡巨噬細胞發生M1型極化的重要分子。此外,經轉染siRNA及IL-4刺激后,與正常對照組及Control-siRNA組相比,PALM3-siRNA組NR8383細胞的M2型表面標志物表達水平上調,上清液IL-10含量升高(P<0.05)。上述結果提示下調PALM3表達可促進肺泡巨噬細胞向M2型極化,有助于抑制促炎因子、促進抗炎因子的釋放。此外,研究表明,PALM3可能與膜蛋白的靶向運輸有關,可能作為“接頭分子”參與信號轉導[17]。而我們在前期的研究中發現,PALM3可作為“接頭分子”參與Toll樣受體信號通路的轉導[16],但PALM3是否能通過Toll樣受體信號通路調控肺泡巨噬細胞的極化方向,尚需深入探究。

綜上所述,PALM3定位表達于肺泡巨噬細胞的細胞膜,其表達豐度與NR8383的極化狀態有關,在M1型肺泡巨噬細胞中呈高表達;下調PALM3表達可抑制脂多糖誘導的M1型肺泡巨噬細胞極化,同時可促進IL-4誘導的M2型肺泡巨噬細胞極化,有助于抑制促炎因子、促進抗炎因子的釋放。調控PALM3的表達有望成為治療巨噬細胞相關炎性疾病的新型靶點。