山桐子性別分子標記的通用性驗證

嚴 莉，仝 鑄，何秀娟，肖 翠，王澤瓊，袁龍義，孫中海，邱文明

（1.湖北省農業科學院果樹茶葉研究所/湖北省農業科技創新中心果樹茶葉研究分中心，武漢 430064；2.長江大學園藝園林學院，湖北荊州 434025）

山桐子（Idesia polycarpaMaxim.）是楊柳科（Salicaceae）山桐子屬高大落葉喬木，在中國主要分布在秦嶺、淮河以南，其果實和種子中富含豐富的油脂，是優質的木本油料樹種［1，2］。隨著中國木本油料行業的發展，山桐子的栽培面積不斷增加，栽培優良新品種具有重要意義［3］。山桐子為雌雄異株植物，雌株果實和種子可用于油料生產，雄株在生產上多作為授粉樹，雌株的經濟價值明顯高于雄株。目前，山桐子的育種工作重點在雌性品種選育方面［4］。生產中，山桐子多用種子繁殖或者無性扦插繁殖［5］。實生繁殖過程中童期漫長，一般要經過4～5 年的營養生長期，才能進入生殖成熟期［4，5］；而無性繁殖成活率低，操作難度也較大，成本也較高［6］。雌雄異株植物在幼苗期的性別很難區分，因此，開發用于山桐子幼苗早期性別鑒定的技術，可以極大程度地節約育種成本、縮短育種周期，在生產和育種方面具有極其重要的意義［7，8］。

宋雨［9］利用表型性狀、分子標記技術對山桐子的地理分布、遺傳多樣性及種質資源鑒定等方面進行研究。在表型性狀方面，歲立云等［10］根據果實性狀自然變異將陜西省的山桐子劃分為6 種果實形態變異類型；張小雪等［11］通過對不同種源的2 年生山桐子生長規律差異的分析，發現不同種源山桐子之間具有一定的遺傳差異性；李大偉［12］通過對8 省16個不同產地山桐子的15 個表型性狀指標的研究，將43 個山桐子單株分為3 類。在DNA 分子標記方面已有一些關于山桐子植物性別鑒定和遺傳資源多樣性分析的標記被報道。簡單重復序列間區擴增多態性（Inter-simple sequence repeat，ISSR）是基于基因組微衛星的分子標記，為通用標記，該標記已在多種植物遺傳圖譜構建、品種鑒定、遺傳多樣性分析等研究中得到應用［13］。王艷梅等［13］以12 個不同分布區的山桐子為材料，利用ISSR 分子標記對山桐子的遺傳差異進行分析；代莉等［14］建立了適用于山桐子ISSR-PCR 的反應體系；董娜等［15］以毛葉山桐子為材料，利用ISSR 分子標記篩選出能夠鑒別毛葉山桐子性別的特異標記UBC841。目前關于UBC841 的準確性鮮見報道，該標記為雌性特異標記，僅在8 份（其中6 份雌株、2 份雄株）毛葉山桐子中表現出特異性，而沒有在更大群體中進行驗證［15］。因此，本研究選用來自其他群體的山桐子對該標記進行通用性驗證，以驗證其準確性。相關序列擴增多態性（Sequence related amplified polymorphism，SRAP）是一種基于PCR（Polymerase chain reaction）的新型分子標記技術，該標記不需預知物種基因序列信息，已在多種植物中得到應用［16］；雷瀚等［17］篩選出2 對SRAP分子標記引物，可以準確對滇楊（Populus yunnanensisDode）早期性別進行鑒定；嚴武平等［18］和魏麗麗等［16］分別優化了適用于鷓鴣茶［Mallotus oblongifolius（Miq.）Muell. Arg.］和草莓（Fragaria ananassaDuch.）的SRAP-PCR 反應體系。在山桐子中，Wang等［19］利用SRAP 分子標記篩選得到1 個與山桐子性別關聯的雌性特異標記，該標記為雌性特異標記，其可靠性在原報道所用52 份（包括30 份雌株、22 份雄株）樣本中均可得到驗證，將該雌性特異標記轉化為穩定的SCAR 標記，STZ 標記在上述樣本中均表現出特異性，表現出良好的準確率。目前STZ 標記僅在所涉及的材料中進行了應用驗證，且所涉及的山桐子樣品均來自同一地區，并沒有在更大的群體中和更廣泛地域中進行檢測，其可靠性和穩定性有待進一步檢測。

本研究利用已知性別的山桐子種質資源作為材料，旨在探討UBC841 和STZ 2 個分子標記在山桐子性別鑒定中的通用性，以期為山桐子的早期性別分子鑒定提供參考。

1 材料與方法

1.1 試材及取樣

試驗于2020—2022 年進行，試料取自湖北省利川市、襄陽市等地，采集已知性別的山桐子資源120份（其中雌株60 份，雄株60 份），選擇樹齡相近、無病蟲害、生長結果正常的成齡植株，隨機采集樹體不同部位枝條上的幼嫩葉片，經清水洗凈后晾干，并用液氮速凍后于-80 ℃保存備用。

1.2 基因組DNA 的獲取及檢測

采用杭州新景生物試劑開發有限公司生產的植物基因組DNA 快速提取試劑盒提取上述120 份山桐子樣品的DNA，具體提取步驟按照試劑盒說明進行，所得DNA 用紫外分光光度法和1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測其質量及完整性。將總DNA 稀釋至30 ng/μL，保存于-20 ℃備用。其中離心機為Eppendorf Centrifuge 5810 R 型，微量紫外分光光度計為Nano drop 1000 型，所用凝膠成像系統生產商為Bio-Rad Laboratories Inc.，型號為Gel Doc XR+。

1.3 標記來源

UBC841 標記來源于董娜等［15］；STZ 標記來源于Wang 等［19］，所用引物均為武漢天一輝遠生物科技有限公司合成，引物信息具體見表1。

表1 山桐子性別標記引物信息

1.4 UBC841、STZ 性別分子標記反應體系的建立

為分析標記UBC841 的有效性，本研究參照董娜等［15］采用的PCR 條件，以24 份山桐子樣品（12 份雌株，12 份雄株）的DNA 為模板，對引物UBC841 進行PCR 擴增反應，結果所得產物中有多態性條帶，均未發現性別特異條帶。因此，為了更好地驗證其通用性，進行了體系優化試驗。選擇2 個雌株和1 個雄株樣品作為模板進行體系優化試驗，反應體系如下：使用25 μL 反應體系，2×PCR Mix（預混TaqDNA Polymerase、Mg2+、dNTPs，指示染料和反應Buffer）（武漢吉泰克基因技術有限公司）12.5 μL，10 μmol/L正、反向引物各0.5 μL，DNA 模板1.0 μL，ddH2O 10.5 μL；PCR 擴增程序：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，49.5～56.0 ℃（分別是49.5、51.8、53.5、54.8、55.6、56.0 ℃）退火40 s，72 ℃延伸30 s，32 個循環，最后72 ℃延伸8 min。PCR 采用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，以擴增條帶多態性和清晰程度為選擇最佳退火溫度的依據。

采用120 份（雌株60 株，雄株60 株）山桐子進行STZ 標記的通用性驗證。引物STZ 的PCR 擴增程序如下：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32 個循環；最后72 ℃延伸5 min。PCR 產物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.5 ISSR 引物PCR 擴增

采用“1.4”中反應體系，利用26 對ISSR 引物（表2）進行擴增，退火溫度根據引物而不同，擴增后的PCR 產物采用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，所用引物均為武漢天一輝遠生物科技有限公司合成。

表2 26 對ISSR 引物信息

1.6 SRAP 引物PCR 擴增

選取2 份山桐子模板對隨機合成的870 對SRAP 引物進行PCR 擴增，PCR 擴增反應體系同“1.4”，退火溫度根據引物而不同，擴增后的PCR 產物采用2.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，所用引物均為武漢天一輝遠生物科技有限公司合成。

2 結果與分析

2.1 UBC841 標記在已知性別山桐子樣品中的體系優化及驗證結果

選取山桐子2 份雌性樣品和1 份雄性樣品對引物UBC841 的擴增體系進行優化，最終得出引物UBC841 在山桐子中的擴增最適退火溫度為53.5 ℃。由圖1 可以看出，UBC841 標記在所有溫度下均能擴增出多態性條帶，但均未表現出性別差異；UBC841 標記在53.5 ℃退火溫度時，擴增產物的多態性較高，擴增條帶比較清晰，非特異性擴增較少，因此確定引物UBC841 的最適退火溫度為53.5 ℃；為驗證引物的有效性，繼續擴大樣本檢測，采用優化后的最適退火溫度在24 份（12 份雌株，12 份雄株）山桐子樣品中進行檢驗，結果如圖2 所示。UBC841 引物標記在24 份山桐子樣品的擴增產物中，均在250～300 bp 有多態性片段出現，但都沒有表現出性別特異性。因為該標記在所用材料中未表現出良好的性別特異性，所以沒有繼續擴大樣本檢測。

圖1 引物UBC841 退火溫度梯度

圖2 引物UBC841 在24 份山桐子樣品中的驗證結果

2.2 STZ標記在已知性別山桐子樣品中的驗證結果

利用“1.4”中反應體系對120 份（雌株60 份，雄株60 份）山桐子樣品進行檢測，結果如圖3 所示。在60 份雌株樣品中共有26 份樣品擴增出明亮的特異條帶，占比為43.3%，有9 份樣品擴增條帶較弱，占比為15%；而在60 份雄性樣品中也擴增出特異片段，且與標記條帶大小一致，有27 份樣品擴增出明亮的條帶，占比為45%，有7 份樣品擴增出較暗的條帶，占比為11.7%；在雌雄株中均能擴增出特異片段，雌雄株擴增出特異片段的比例相近，并沒有在雌株中表現出性別差異，因此沒有性別特異性，而在Wang等［19］報道中STZ 是雌性特異標記，僅出現在雌性樣品中。

2.3 ISSR 引物擴增多態性

選取6 份山桐子樣品對26 對ISSR 引物進行擴增，部分引物擴增結果如圖4 所示。26 對引物共有20 對引物能夠擴增出條帶，引物有效率為76.9%，共擴增出176 條條帶，其中引物UBC829 擴增條帶數最多，為13 條；其次是引物UBC812 和UBC864，均擴增出12 條條帶；但是該20 對引物在6 份山桐子樣品中均未表現出性別特異性，因此沒有繼續擴大樣本進行檢測。

圖4 部分ISSR 引物在6 份山桐子樣品中的擴增圖譜

2.4 SRAP 引物擴增多態性

經過SRAP-PCR 擴增篩選，846 對引物中有792對引物可擴增出清晰的條帶，引物的有效擴增率達91.03%；有231 對引物能夠擴增出多態性條帶，部分引物擴增電泳結果如圖5 所示。初步統計結果顯示，265 對引物共擴增得到1 338 條條帶，其中引物組合me04/em04 條帶數最多，為15 條，選取6 份模板（雌株3 份，雄株3 份）對該265 對引物進行擴大樣本篩選，在雌雄株中均未表現出特異性。

圖5 部分SRAP 引物在2 份山桐子樣品中的擴增圖譜

3 討論

山桐子早期性別鑒定對育種和栽培實踐有重要意義。山桐子作為雌雄異株植物，其雌株的經濟價值遠高于雄株，但由于山桐子的童期較長，且結實較晚，幼年期的山桐子雌、雄株在形態上很難將其區分，通常需要經過3～5 年，在開花期通過雌雄花才能準確區分，這給生產帶來極大不便，因此，研究山桐子早期性別分化，在生產上合理配置雌雄個體，對提高山桐子產量具有重要意義［8，15］。

已報道的有關植物性別鑒定的方法有很多，包括形態學［20］、生理生化［21］、同工酶［22］等，這些方法大都是對已成熟個體性別差異的研究。植物個體性別分化會受到多種因素的影響，因此上述方法用于早期性別鑒定時，結果可靠性往往較差［23］。DNA 分子標記受發育階段及外界環境的影響小，鑒定結果準確、重復性高，因此被廣泛應用于雌雄異株植物的早期性別鑒定中［8，23］。目前被報道的分子標記中，應用到山桐子中的主要有SSR、ISSR、SRAP 和SCAR等［5，15，19］；李娜等［5］基于轉錄組序列開發的SSR 分子標記可將4 個不同地區的山桐子進行區分；王艷梅等［13］、代莉等［14］和董娜等［15］分別利用ISSR 分子標記對山桐子的遺傳差異進行分析，優化了適用于山桐子的體系，篩選出了能夠鑒別山桐子性別的特異標記；Wang 等［19］利用SRAP 分子標記開發了可以鑒別山桐子雌雄株的特異標記，并將此標記轉化為穩定的SCAR 分子標記，該標記為雌性特異標記。ISSR分子標記為通用性分子標記，無需預先知道物種基因組的序列［15］；目前ISSR 已廣泛應用于美洲黑楊（Populus deltoidsMarshall）的新無性系材料鑒定、紅橘（Citrus reticulataBlanco）種質資源的遺傳多樣性分析、番茄（Lycopersicon esculentumMiller）種質資源遺傳多樣性分析等方面［24-26］。董娜等［15］在ISSR 分子標記開發過程中，所選用材料是毛葉山桐子，采用優化后的體系對100 條引物進行檢測，最終在100 對引物中發現引物UBC841 能夠在雌株中擴增出特異性條帶并且可以穩定存在，該條帶大小為250～300 bp；本研究在對UBC841 標記引物進行重復驗證時，先對其反應體系進行優化，后為驗證引物有效性在24 份山桐子樣品中進行擴大樣本驗證，結果顯示，該引物在250～300 bp 有多態性片段出現，但是在雌雄株中并沒有表現出性別特異性，因此沒有繼續擴大樣本進行檢測。此外，對該擴增片段進行回收測序，共獲得10 條不同的序列，因此該引物不宜用于山桐子雌雄株的早期鑒定。

SRAP 分子標記根據基因外顯子和啟動子中堿基特征，設計獨特的雙引物來擴增開放閱讀框架（ORFs）的特定區域，與ISSR 分子標記相同，SRAP標記不需要事先獲取被檢測物種的基因組序列，具有簡單、高效的特點［16，18，27］。目前SRAP 分子標記技術已經在滇楊（Populus yunnanensisDode）［17］、獼猴桃屬（ActinidiaLindl.）［28］、蘋果（Malus domesticaMill.）［29］、草莓［16］等植物中均有應用。山桐子STZ 標記就是利用SRAP擴增到的210 bp雌株特異片段轉化而來［19］。但是本研究在驗證該標記的通用性時，雌株中有35份樣品有該特異條帶，雄株中有34 份樣品有該條帶，并未表現性別特異性。推測可能是使用的山桐子樣本太少，獲得的差異片段并不與性別連鎖［19］。

本研究除檢驗UBC841 和STZ 分子標記的通用性外，還分析了大量的ISSR 和SRAP 分子標記引物，但未篩選出山桐子性別特異標記。隨著中國木本油料行業的快速發展，急需開發可靠的分子標記進行山桐子早期性別鑒定。下一步，除了嘗試其他新的分子標記技術外，更需加強山桐子性別分化分子機制的研究，探明其性別分化、形成的機理，開發簡單、高效、可靠的性別鑒定方法，節約育種成本，加快育種進度，更好地支撐產業高質量發展。