強藍光照射誘發大鼠視網膜組織結構及功能變化的實驗研究

王文晶,盛 帥,任建濤,黃旭東

0 引言

研究表明,波段為400～500nm的藍光是導致視網膜光損傷的主要危險因素[1-3],低照度藍光可誘發慢性視網膜光損傷,高照度(>1000lx)藍光亦可致急性視網膜光損傷,最終導致視網膜組織病理學改變[4-6]和血-視網膜屏障功能破壞[7]。目前針對視網膜光損傷[8]的研究主要集中于分子機制[6, 9-11]及組織細胞學改變,但對于較為直觀的影像、功能及活體形態學的檢查研究較少,本研究采用眼底熒光素血管造影(fundus fluorescein angiography,FFA)、光學相干斷層掃描(optical coherence tomography,OCT)和石蠟病理組織切片蘇木素-伊紅(HE)染色法對不同時長強藍光照射導致的大鼠視網膜損傷進行分析。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物選擇8周齡健康無特定病原體(SPF)級SD雄性大鼠48只,購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司(合格證號:37072610100978471),實驗前大鼠進行眼底篩查,排除原有眼部疾病,實驗動物的飼養和使用均遵循國家科學技術委員會《實驗動物管理條例》的相關規定,本研究經濰坊眼科醫院動物實驗倫理委員會審批(批文號:2020-院內倫審-01-01)。

1.1.2主要試劑及儀器主要試劑:蘇木素-伊紅(HE)染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);復方托吡卡胺滴眼液(參天制藥有限公司);歷設得熒光素鈉注射液(Cardinal Health Manufacturing Services B.V.公司);玻璃酸鈉滴眼液(URSAPHARM Arzneimittel GmbH,德國);無水乙醇(江蘇強盛功能化學股份有限公司)。主要儀器:多聚賴氨酸黏附載玻片(江蘇世泰實驗器械有限公司);病理組織包埋盒(江蘇世泰實驗器械有限公司);10%中性福爾馬林組織固定液(江蘇世泰實驗器械有限公司);FFA(海德堡同步共焦激光眼底熒光造影儀,德國);OCT(海德堡SPECTRALIS光學相干斷層掃描儀,德國);465nm LED藍光燈板(徐州愛佳電子科技有限公司);石蠟病理切片機、石蠟病理包埋機、攤片機(德國Leica公司)。

1.2方法

1.2.1實驗設備的制作采用545mm×395mm×200mm的PP塑料飼養籠,飼養籠四周內側壁安裝反光面板,定制波長為465±5nm可調節功率的面陣式LED燈藍光發光板[12],將發光板置于飼養籠上方,調節LED燈亮度與高度,根據預實驗中不同藍光光照度下大鼠眼底改變情況,且考慮到本實驗研究因素為強藍光,將1000±100lx作為本研究的光照度值。

1.2.2實驗分組選取8周齡SPF級健康SD雄性大鼠48只,隨機分為對照組(n=12)和實驗組(n=36),其中對照組大鼠每日接受自然光照;實驗組大鼠根據光照時間不同分為3個組,每組12只,每日分別接受波長465±5nm、光照度1000±100lx的藍光照射3、6、12h,照射過程中每隔3h人為攪動大鼠,使之處于活動狀態,以盡量保證大鼠眼睛接受足夠時長的光照。本研究采取標準飼養方法,連續光照8wk,采用OCT、FFA和石蠟病理組織切片觀察不同方位及不同分層視網膜厚度、視網膜組織結構和功能變化。

1.2.3OCT檢查對照組和實驗組大鼠采用復方托吡卡胺滴眼液充分散瞳,2%戊巴比妥鈉麻醉劑(2mL/kg)腹腔注射麻醉,玻璃酸鈉滴眼液濕潤角膜,OCT掃描測量大鼠視盤上方、下方、鼻側、顳側距視盤邊緣約2mm處的視網膜總厚度,使用系統自帶軟件手動測量各方位視網膜總厚度,即視網膜內界膜(internal limiting membrane,ILM)至視網膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)層的厚度,取各方位視網膜總厚度的平均值作為平均視網膜總厚度(mean total retinal thickness,mTRT)。為進一步分析大鼠視網膜不同分層厚度的變化,分別于上述相同位置測量視網膜ILM-內核層(inner nuclear layer,INL)、外叢狀層(outer plexiform layer,OPL)-光感受器外節段(outer segment,OS)和RPE層厚度,取4個方位視網膜各層厚度的平均值作為該層視網膜最終厚度值。

1.2.4FFA檢查對照組和實驗組大鼠快速腹腔注射10%熒光素鈉注射液(0.8mL/kg)后,立即拍攝眼底視盤及其余各方位視網膜血管造影圖像,保存圖片進行影像學分析。

1.2.5視網膜石蠟病理組織切片制備對照組和實驗組大鼠腹腔注射過量戊巴比妥鈉麻醉劑麻醉致死,快速摘取眼球,剪除多余組織,生理鹽水沖洗眼球后置于10%中性福爾馬林組織固定液中24～48h。取出眼球于1×PBS中性緩沖液中浸泡約1h,沿角膜緣剪除角膜,摘除晶狀體,將眼球剩余組織依次浸入由低濃度到高濃度的梯度乙醇溶液及二甲苯溶液中脫水,60℃浸蠟2h,將眼球矢狀面平行于包埋盒進行石蠟包埋。將石蠟標本垂直固定于切片機,調整切片厚度4μm,平行于視神經進行切片,于45℃溫水中將切片展平,鋪于多聚賴氨酸黏附性載玻片后標記,置于60℃溫箱中烘干1.5h。取出載玻片,再依次置于二甲苯溶液、由高濃度到低濃度的梯度乙醇溶液內脫蠟、復水,HE染色,脫水、透明,中性樹膠封片,電子顯微鏡下觀察視網膜各層組織形態學改變。

2 結果

2.1各組大鼠OCT檢查結果采用OCT掃描檢查各組大鼠視網膜,對照組和3h實驗組大鼠視網膜各層結構信號清晰,神經纖維層和RPE層為高反射信號,內叢狀層、外叢狀層為中等反射信號,內核層、外核層和感光細胞層為低反射信號(圖1A、B);6h和12h實驗組大鼠外核層厚度明顯變薄,光感受器內外段(inner segment/outer segment,IS/OS)表現為不規則高反射信號,局部RPE層信號減弱(圖1C、D)。

圖1 各組大鼠視網膜OCT檢查結果 A:對照組大鼠視網膜各層結構清晰,RPE層呈均勻高反射信號(綠箭頭),可清晰分辨脈絡膜層;B:3h實驗組大鼠視網膜各層結構清晰,外核層(紅箭頭)厚度明顯大于內核層(黃箭頭),RPE層信號連續;C:6h實驗組大鼠視網膜外核層厚度明顯變薄,IS/OS界限模糊(藍箭頭),RPE層信號模糊;D:12h實驗組大鼠視網膜內核層見多個點團狀高反射信號(紫箭頭),外核層(紅箭頭)厚度明顯小于內核層,IS/OS和RPE層明顯萎縮,視網膜與脈絡膜界限模糊。

各組大鼠組內4個方位視網膜厚度差異均無統計學意義(P>0.05),但各組大鼠組間4個方位視網膜厚度差異均有統計學意義(P<0.05),且對照組和3h實驗組大鼠上方視網膜厚度差異無統計學意義(P=0.071),其余各方位視網膜厚度組間兩兩比較,差異均有統計學意義(P<0.05),見表1。各組大鼠平均視網膜總厚度差異有統計學意義(P<0.05),且各組間兩兩比較差異均有統計學意義(P<0.05);各組大鼠ILM-INL厚度差異有統計學意義(P<0.05),且對照組與3h和12h實驗組大鼠ILM-INL厚度差異均有統計學意義(P<0.05),其余各組間兩兩比較,差異均無統計學意義(P>0.05);各組大鼠OPL-OS厚度差異有統計學意義(P<0.05),且各組間兩兩比較,差異均有統計學意義(P<0.05);各組大鼠RPE層厚度差異有統計學意義(P<0.05),且對照組與3h和6h實驗組、3h與6h實驗組大鼠RPE層厚度差異均無統計學意義(P>0.05),12h實驗組與其余各組比較差異均有統計學意義(P<0.05),見表2。

表1 各組大鼠不同方位視網膜厚度比較

表2 各組大鼠各層視網膜厚度比較 μm

2.2各組大鼠FFA檢查結果FFA檢查結果顯示,所有大鼠視盤均位于視網膜后極部正中央,視網膜血管走行呈放射狀,對照組(圖2A～C)和3h實驗組(圖2D～F)大鼠視網膜動靜脈血管粗細均勻且連續,動靜脈管徑比值為1∶2～2∶3,視盤及視網膜未見明顯熒光滲漏;6h實驗組大鼠視網膜血管充盈,動靜脈粗細均勻,走行正常,視盤無熒光滲漏,中周部視網膜可見點片狀熒光滲漏(圖2G～I);12h實驗組大鼠視網膜動靜脈血管變細,毛細血管走行紊亂,全視網膜散在熒光滲漏、彌漫點團狀低熒光及透見熒光,脈絡膜背景熒光增強(圖2J～L)。

圖2 各組大鼠FFA檢查結果 A～F:對照組(圖A～C)和3h實驗組(圖D～F)大鼠視網膜血管充盈、走行正常,無明顯熒光滲漏;G～I:6h實驗組大鼠視網膜視盤處無熒光滲漏,中周部視網膜可見點片狀熒光滲漏(紅箭頭)及少量點團狀低熒光區(黃箭頭);J～L:12h實驗組大鼠全視網膜散在點團狀低熒光(黃箭頭)、斑片狀透見熒光及大面積熒光滲漏(紅箭頭),脈絡膜背景熒光增強。

2.3各組大鼠視網膜組織形態變化HE染色觀察各組大鼠視網膜及脈絡膜組織形態學變化情況,對照組大鼠視網膜組織結構正常,層次分明(圖3A);3h實驗組大鼠視網膜視細胞排列約8～9層,細胞數目較對照組稍減少,間隙增大,排列紊亂,未見其他明顯病理組織學改變(圖3B);6h實驗組大鼠視網膜與3h實驗組相比,視細胞層細胞排列明顯紊亂,細胞間隙增大,層數減少至5～6層,部分細胞核染色欠均勻,出現核固縮、核碎裂病理學表現,RPE層局部萎縮變薄,細胞排列稀疏,脈絡膜纖維結締組織疏松水腫(圖3C);12h實驗組大鼠視網膜結構紊亂,神經節細胞層可見少量細胞核淡染,視細胞層細胞數目明顯減少,局部視細胞消失,RPE層細胞排列稀疏紊亂,可見脈絡膜結締組織疏松、水腫,節細胞及雙極細胞層未見明顯病理改變(圖3D)。

圖3 HE染色觀察各組大鼠視網膜組織形態變化 A:對照組大鼠視細胞層排列緊密,細胞排列整齊,視網膜RPE層連續,脈絡膜為富含血管的疏松結締組織;B:3h實驗組大鼠視網膜視細胞層細胞排列稍紊亂,核間隙增大(綠箭頭);C:6h實驗組大鼠視網膜視細胞排列明顯紊亂,細胞間隙增大,可見細胞核固縮、核碎裂,感光細胞層內外段排列稀疏(黃箭頭),部分RPE層萎縮變薄(紅箭頭),脈絡膜結締組織疏松水腫(藍箭頭);D:12h實驗組大鼠視網膜結構明顯紊亂,神經節細胞層部分細胞核淡染(黑箭頭),視細胞數量明顯減少,局部視細胞消失(綠箭頭),局部RPE層萎縮變薄,脈絡膜纖維結締組織疏松水腫(藍箭頭)。

每組隨機選取10張帶有視盤組織的視網膜組織切片,利用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件測量距離視盤邊緣約2mm處視網膜視細胞數目,以50μm為1個單位長度,計算單位長度內視細胞數目,結果顯示對照組、3h實驗組、6h實驗組、12h實驗組視網膜單位長度內視細胞數目分別為189.30±17.67、107.20±13.83、84.90±8.48、50.40±11.91個,差異有統計學意義(F=194.49,P<0.05),且各組間兩兩比較,差異均有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

藍光導致的視網膜光損傷是目前研究的熱點。既往研究發現,長期低強度藍光(<100lx)照射可引起慢性視網膜組織結構損傷,損傷程度隨累積的光照時間延長而加重[13];急性光損傷可導致不可逆的視功能急劇下降伴視網膜局灶性損傷,這種損傷在光照停止后隨著時間推移繼續發展,可持續數周之久,但與損傷相關的致病因子則逐漸減少[14-15]。以往研究多主要集中于分子機制及組織細胞學改變[16-19],但對于較為直觀的影像、功能及活體形態學的檢查研究少有報道。

本實驗除了通過石蠟病理組織切片HE染色觀察大鼠視網膜組織形態學改變,還比較了單位長度視網膜視細胞數,發現實驗組大鼠視網膜RPE層萎縮變薄,視細胞數目減少、排列紊亂,出現細胞核固縮、核碎裂,12h實驗組內核層也出現局部細胞核淡染和較少數細胞核固縮、核碎裂,神經節細胞層部分細胞核淡染。既往研究多集中于對視網膜感光細胞層及RPE層的損傷和分子機制的研究[20-25],近年來針對藍光照射導致神經節細胞損傷的研究越來越受關注,多項研究發現藍光可誘發視網膜神經節細胞不可逆的損傷[26-27]。Ziókowska等[26]研究發現強藍光誘導有色素大鼠內在光敏性視網膜神經節細胞(intrinsically photoreceptive retinal ganglion cells,ipRGCs)中視黑素的免疫反應性降低,ipRGCs數量顯著減少,神經纖維層軸突和內叢狀層樹突損傷,正常神經節細胞亦出現輕微損傷。Guo等[27]研究也發現藍光照射后視網膜神經節細胞軸突結構破壞,細胞活力下降,出現了明顯的細胞凋亡和壞死。本研究發現,強藍光可誘導RPE層、光感受器細胞層、外核層、內核層和神經節細胞層出現細胞凋亡、壞死的病理學表現,但病變輕重程度不同,與上述研究結果一致。此外,本研究通過比較各組視網膜視細胞數目更直觀地體現了藍光照射對視網膜感光細胞造成的損傷,且視細胞數目呈時間依賴性減少。Nakamura等[24]研究證實在高照度藍光致視網膜損傷中,RPE層病理變化早于外核層,本研究中12h實驗組與3、6h實驗組相比,RPE層萎縮明顯,相對應的視細胞層也出現明顯的病理學改變,視細胞數目減少甚至消失,也體現了RPE層損傷對視細胞凋亡的影響。

既往關于光損傷致視網膜厚度變化的研究多集中于對視網膜病理切片的測量,本研究采用OCT測量大鼠視網膜厚度及分層測量視網膜厚度,相對于離體的病理組織切片,對不同方位視網膜厚度的變化進行了活體實時觀察,其準確性更高,觀察更細致。本研究發現,藍光照射至第8wk,對照組與3h實驗組大鼠上方視網膜厚度比較無差異,但各組大鼠下方、鼻側、顳側視網膜厚度比較均具有顯著差異,故推測光照對不同方位視網膜厚度的影響不一致,但需要更多的數據支持。本研究還發現,各實驗組大鼠ILM-INL層厚度變化不明顯,即ILM-INL層厚度受光照時間影響較小,而各實驗組大鼠OPL-OS層厚度組間兩兩比較均有顯著差異,表明光照對視網膜損傷主要集中于OPL-OS層,此結果與視網膜病理組織切片觀察的視細胞數目減少結果一致。此外,本研究發現,與3、6h實驗組相比,12h實驗組大鼠RPE層厚度明顯變薄,相對應的外核層和光感受器內外段也出現更明顯的病理學改變,提示視網膜損傷程度呈時間依賴性加重。

本研究中,FFA檢查結果示,6、12h實驗組大鼠視網膜出現熒光滲漏和透見熒光,結合OCT和HE染色結果,3h實驗組大鼠在強藍光照射第8wk時視網膜組織已出現病理學改變,且厚度變薄,但FFA檢查結果無明顯異常,提示3h實驗組視網膜發生了組織形態學改變,而血管通透性未改變,隨著藍光照射時間的延長,6、12h實驗組大鼠視網膜及小血管功能逐漸受損。

綜上所述,強藍光照射可導致視網膜視細胞萎縮、凋亡及RPE層萎縮,視網膜厚度變薄,血管屏障功能破壞,其變化程度受光照時間影響。本研究不足之處在于未對光照導致的視網膜變薄進行動態的測量研究,下一步研究將會擴大樣本量,研究早期視網膜變薄的具體過程,并對光照后損傷的視網膜修復過程進行研究。