MMP-2 響應的多肽修飾的PAMAM 納米顆粒負載DOX 在乳腺癌細胞中的效應

頊嘉琪 劉克海

上海海洋大學食品學院（上海 201306）

納米顆粒（nano particles，NPs）通過高滲透長滯留（enhanced permeability and retention，EPR）效應實現化學治療（化療）藥物的靶向遞送，已經成為癌癥治療診斷的有前途的工具［1］。通常，納米制劑的整個體內遞送過程包括血液循環、腫瘤累積、滯留、滲透、細胞內化和清除［2］。在這些過程中，NPs的轉運受到許多生物屏障的阻礙，例如網狀內皮系統的相互作用和腫瘤的高間質液壓力。理想的藥劑應該能夠積聚到腫瘤中，有效地發揮作用，并且在其功能耗盡后從體內消除，以避免長期毒性［3］。為了實現最佳的治療診斷性能，應合理設計納米顆粒的結構和性質以實現有效遞送。作為NPs的基本性質，粒徑在遞送過程中起重要作用。為了實現延長的血液循環和高腫瘤積聚，直徑在20~200 nm范圍內的NPs是一個很好的選擇，因為它有助于通過EPR效應在腫瘤部位蓄積［4］。然而，該尺寸范圍對于腫瘤保留、滲透和機體消除不是最佳的。為了防止NPs重新進入血流或擴散到周圍組織中，可以將大尺寸的NPs捕獲到腫瘤部位中；而需要較小的尺寸來實現令人滿意的穿透深度或快速清除［5］。因此，理想的遞送系統的初始尺寸應該相對較大，以實現更長的循環和選擇性外滲，但是一旦“對接”在腫瘤部位，它應該可切換為小顆粒以促進腫瘤滲透［6］。這些設想促進了刺激響應性納米顆粒的發展，這些納米顆粒能夠通過響應酶、pH或其他條件來縮小其尺寸［7］。

基于此，為了克服尺寸所引發的遞送障礙，本文設計了一種酶響應型納米遞送系統，該系統由金屬基質蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）敏感多肽交聯負載化療藥物的小粒徑載體PAMAM/DOX構成。聚酰胺-胺樹狀大分子（polyamidoamine dendrimer，PAMAM）是目前被廣泛研究的陽離子聚合物，其尺寸較小，表面富含大量氨基，易于后續修飾，且疏水空腔內可以負載化療藥物［8］。此外，PAMAM表面的氨基質子化，在溶酶體中產生“質子海綿效應”，使得其從溶酶體中逃逸并進入細胞質中。腫瘤細胞及其外基質中高表達MMP，針對此在藥物遞送系統中引入酶敏感多肽片段，可實現藥物尺寸的變化［9］。本研究合成了MMP-2敏感多肽pep（CPLGVRGC），用于交聯超小粒徑納米顆粒形成大尺寸遞送系統［10］。該遞送系統的初始尺寸約為200 nm，有利于其通過EPR效應在腫瘤部位積累，一旦它們到達腫瘤部位，在腫瘤組織中高表達的MMP-2刺激下，其轉化為尺寸約為10 nm的小粒徑顆粒，實現化療藥物阿霉素（Doxorubicin，DOX）靶向遞送。本研究對所合成材料進行表征，并進一步對其藥物釋放率、體外對小鼠乳腺癌細胞的抑制效果、細胞攝取效果、靶向性以及可行性與安全性進行考察。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

第四代聚酰胺胺聚合物（PAMAM G4，威海晨源分子新材料有限公司）；鹽酸阿霉素（DOX·HCl，阿拉丁試劑有限公司）；無水乙醇、無水甲醇、三乙胺（國藥集團化學試劑有限公司）；溴化噻唑藍四氮唑（MTT，道賽爾生物科技有限公司）；胰酶、RMPI 1640培養基（Gibco，美國）；多肽pep（CPLGVRGC）通過標準固相合成法制備。小鼠乳腺癌細胞4T1購買于中科院典型培養物保藏委員會細胞庫（上海）。

1.2 主要儀器

AE-31熒光倒置顯微鏡（Motic，德國）；FA1004N 電子分析天平（Sartoriu，德國）；高速冷凍離心機（Effendorf，德國）；MS-H-PRO 型恒溫磁力攪拌器（上海麥淳光生物公司）；真空冷凍干燥機（Labconco，美國）；Zeta size ZS90型粒度測定儀（Malvern，英國）。

1.3 方 法

1.3.1 PAMAM/DOX的制備與表征 稱取20 mg DOX·HCl溶解在甲醇溶液中，加入數滴三乙胺中和鹽酸釋放出游離的DOX。隨后，調整DOX和PAMAM的摩爾比，將一定量的 PAMAM水溶液緩慢滴入甲醇中。避光攪拌24 h后，用去離子水（3.5 kDa）透析過夜。最終的納米復合物通過凍干得到一件紅色的產品［11］。通過透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察顆粒的形態與粒徑，同時將顆粒溶解在新鮮的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）溶液中，使用激光粒度散射儀（dynamic light scattering，DLS）進一步檢測其粒徑與Zeta電位。檢測不同比例下納米復合物的載藥率，通過核磁共振氫譜對化合物的結構進行表征。

1.3.2 PAMAM/DOX的載藥率、包封率測定 稱量10 mg DOX溶于10 mL甲醇溶劑中，配置得到1 mg/mL的DOX甲醇標準溶液，稀釋至100 μg/mL。以甲醇為空白對照，對DOX標準液進行全波段掃描（200~800 nm），確定DOX標準品的最大吸收峰。配置不同濃度梯度的標準品溶液，在DOX的特征吸收波長下測定各濃度DOX溶液的吸光度，繪制DOX 標準樣品的紫外光譜（ultraviolet spectrum，UV）標準曲線。采用紫外可見分管光度計對各納米復合物在479 nm的吸光度進行檢測，并計算其載藥率與包封率。

1.3.3 PAMAM/DOX-pep的制備與表征 4-（N-馬來酰亞胺基甲基）環己烷羧酸N-羥基琥珀酰亞胺酯（SMCC）被用來作為交聯劑，通過MMP-2敏感的多肽pep交聯PAMAM/DOX形成大粒徑納米顆粒PAMAM/DOX-pep［12］。首先，將SMCC溶解于二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）中至溶液濃度為10 mg/mL，與 PAMAM/DOX（10 mg/mL）的溶液按1∶5的摩爾比在磁力攪拌的過程中緩慢混合，室溫攪拌30 min。隨后，將多肽pep緩慢滴加到馬來酰胺活化的 PAMAM/DOX中，4 ℃下攪拌過夜得到PAMAM/DOX-pep。最后，通過離心過濾裝置超濾除去多余的小分子原料并凍干。使用1H核磁共振對產品進行分析；使用Nano-ZS90 Malvern儀器在25 ℃下測量平均粒徑和Zeta電位，同時通過TEM觀察納米顆粒的形態和尺寸大小。

1.3.4 各納米復合物的藥物釋放率 將2 mL PAMAM/DOX和PAMAM/DOX-pep的PBS溶液（500 μg/mL）加入透析袋（3.5 kDa），浸沒在pH值為5.0或7.4的PBS 溶液中，37 ℃下緩慢攪動透析。每隔4 h，收集釋放的DOX并通過UV-Vis光譜分析來測量釋放的DOX的濃度。將等體積的新鮮PBS補充到釋放介質中，以保持溶液的體積不變。

1.3.5 PAMAM/DOX-pep的溶血率 取新鮮兔血5 mL，加入5 mL生理鹽水反復洗滌、離心，直至上清略黃且無血色，棄去上清，取0.2 mL底物稀釋至10 mL，得到2%的紅細胞懸液。將PAMAM/DOX-pep溶于PBS溶液至濃度為10 mg/mL，稀釋后得到一系列濃度梯度的納米復合物溶液（10、20、50、100、200、500 μg/mL）。取等體積的納米制劑與紅細胞溶液共孵育，并設置陰性（PBS）和陽性（純水）對照。37 ℃下孵育3 h后，通過離心（3 000 rpm，10 min）除去完整的紅細胞。取上清液檢測各處理組541 nm處的吸光度，通過以下公式進行計算以獲得溶血率（HR%）：HR%=（At-Anc）/（Apc-Anc）×100，其中At、Anc和Apc分別是測試樣品，陰性對照和陽性對照的吸光度值。

1.3.6 PAMAM/DOX-pep的體外穩定性 為了研究納米集簇的穩定性，將PAMAM/DOX-pep置于含有10% 胎牛血清的PBS溶液中，并在4 ℃的黑暗環境下儲存7天，每24 h取適量溶液稀釋至1 mL，通過納米粒度儀檢測其粒徑，以評價納米顆粒的體外穩定性。

1.3.7 各納米復合物的靶向性 當4T1細胞匯合度為80%~90%時，消化離心，收集細胞懸液接種于含有細胞爬片的24孔板內。孵育24 h后，棄培養基，將 Free DOX、PAMAM/DOX-pep、PAMAM/DOX-pep（MMP）分別溶解于無血清RMPI 1640培養基中并加入到24孔板中，孵育4 h。隨后，棄培養基，用PBS溫和洗滌3次，每孔加入預冷的300 μL 4 %多聚甲醛固定30 min。棄多聚甲醛，用PBS溫和搖動潤洗 5 次后，每孔加入200 μL DAPI（4，6-diamino-2-phenyl indole，4，6-二氨基-2-苯基吲哚）孵育5 min對細胞核進行染色。PBS溫和搖動潤洗5次洗去多余的核染液后，取出細胞爬片，滴加5 μL防淬滅封片液后倒扣于載玻片上，在共聚焦顯微鏡下觀察細胞攝取情況。取對數期細胞接種于12孔板中，以同樣的方式處理細胞，收集并通過流式細胞儀定量分析細胞攝取情況。

1.3.8 各納米復合物的體外抗腫瘤效果 離心收集4T1細胞細胞懸液接種于96孔板中（每孔1 000~2 000個細胞），37 ℃恒溫培養24 h。將DOX、PAMAM/DOX、PAMAM/DOX-pep溶于完全培養基中，使DOX 的濃度分別達到0.05 μg/mL、0.5 μg/mL、2.5 μg/mL和5 μg/mL，配置成不同濃度的納米制劑。設置陽性對照組（僅添加細胞）和陰性對照組（僅添加培養基），每一組設置5個平行孔。在37 ℃和5% CO2培養24 h后，避光加入20 μg MTT（溶解于PBS，5 mg/mL）和80 μg無血清RMPI 1640培養基，避光孵育4 h。吸出上清，每孔加入150 μL DMSO，低速震搖20 min后，用酶標儀在490 nm處檢測吸光度并計算細胞存活率。細胞存活率（%）=（AX-A0）/（AC-A0）×100，其中AX為加藥組的吸光度、AC為陽性對照組、A0為陰性對照組），采用Graphpad prism軟件計算DOX的IC50（半抑制濃度）。

1.4 統計學分析

數據采用SPSS 21. 0軟件進行統計學分析，計量資料用表示，2組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 PAMAM/DOX的表征、載藥率與包封率

將DOX物理包埋于PAMAM的疏水空腔內部，形成PAMAM/DOX。通過紫外分光光度計進行檢測，當DOX與PAMAM的摩爾比為30∶1時，納米顆粒的載藥率為23.53%，最適宜用做載藥，選取這一比例下形成的PAMAM/DOX進行后續實驗（表1）。TEM與粒度儀檢測顯示，納米顆粒的尺寸約為10 nm（圖1a）。TEM 結果顯示（圖1b），納米顆粒呈圓形，其內部疏水空間清晰可見，分散性良好。

圖1 PAMAM/DOX 的DLS 粒徑（A）與TEM 圖（B）

表1 不同比例PAMAM/DOX的粒徑、電位與載藥率

2.2 PAMAM/DOX-pep的表征

PAMAM表面包含大量氨基結構，易于化學修飾。本研究使用SMCC作為交聯劑，將多肽pep中的半胱氨酸上的巰基與PAMAM上的氨基綴合，以獲得大尺寸的納米顆粒PAMAM/DOX-pep，1H NMR譜圖見圖2，PAMAM/DOX的特征峰δ分別為2.45、2.61、2.81、3.28 ppm，而δ = 8.5 ppm處形成的新峰代表多肽的成功連接。通過TEM觀察納米顆粒PAMAM/DOX-pep，其外觀呈球狀，表面小顆粒立體可見，粒徑約為200 nm（圖3A），與DLS檢測一致（圖3B），電位為-0.3 mV（圖4）。粒徑與Zeta電位的變化也印證了大粒徑納米顆粒的成功合成。

圖2 PAMAM/DOX 和PAMAM/DOX-pep 的核磁共振氫譜

圖3 PAMAM/DOX-pep 的TEM 圖（A）與DLS 粒徑（B）

圖4 PAMAM/DOX-pep 的電位

2.3 DOX的釋放率

將PAMAM@DOX和PAMAM/DOX-pep分別置于pH為7.4和5.0下的 PBS透析液中，以考察化療藥物DOX釋放效率。兩種納米顆粒在不同pH下均表現出一定的緩釋能力，大粒徑的PAMAM/DOX-pep最佳，小尺寸的PAMAM/DOX次之（圖5）。當pH為7.4時，PAMAM/DOX、和PAMAM/DOX-pep的藥物釋放率分別為41%和33%；這說明由于多肽具有豐富的側鏈功能化位點、多樣的親疏水性以及能夠形成穩定的二級結構的能力，其修飾后有效延緩了藥物的釋放。當pH為5.0時，PAMAM/DOX和PAMAM/DOX-pep的藥物釋放率分別為79%和68%。

圖5 PAMAM/DOX 和PAMAM/DOX-pep 的藥物釋放率

2.4 PAMAM/DOX-pep的溶血率

通過溶血實驗研究PAMAM/DOX和PAMAM/DOX-pep納米顆粒的血液生物相容性。結果表明，納米顆粒的溶血率存在一定劑量依賴性。隨著納米集簇濃度的增加，其溶血率也略有增加，其中，PAMAM/DOX-pep的溶血率略低于PAMAM/DOX，見圖6。多肽修飾后PAMAM/DOX-pep溶血率在500 μg/mL下。溶血率仍小于5%，可能的原因是多肽修飾后的納米顆粒正電位降低，從而降低了溶血率。

圖6 PAMAM/DOX 和PAMAM/DOX-pep 的溶血率（n=3）

2.5 PAMAM/DOX-pep的體外穩定性

通過馬爾文粒度儀檢測粒徑來確定納米顆粒的體外穩定性。總體來說，PAMAM/DOX-pep的粒徑在7天內均無顯著變化，較為穩定，見圖7。而從第5天開始，PAMAM/DOX的粒徑增加，發生團聚，而PAMAM/DOX-pep依舊保持穩定。

圖7 PAMAM/DOX 和PAMAM/DOX-pep 體外7 天內的粒徑變化（n=3）

2.6 腫瘤細胞對納米顆粒的攝取行為

使用流式細胞術檢測各納米制劑的細胞攝取，結果見圖8。相比于游離DOX，多肽交聯后形成的大粒徑納米顆粒PAMAM/DOX-pep的細胞攝取量有所增加，但主要集中在細胞質中，與細胞核重疊度不高（圖8B）。而PAMAM/DOX與MMP-2共孵育的PAMAM/DOX-pep細胞攝取量顯著提高，可見小粒徑納米顆粒的細胞攝取優于大尺寸納米顆粒。同時，酶分解后的納米顆粒小攝取量高于小顆粒PAMAM/DOX，這可能是多肽的修飾改變了其表面電位基團，促進其入胞。通過共聚焦顯微鏡（CLSM）對各納米制劑的細胞攝取情況進行直觀的觀察，結果與流式細胞術一致（圖8a，c）。PAMAM/DOX-pep處理過的細胞藥物熒光強度更高，攝取量更多。且Merge圖中，DOX紅色熒光與細胞核藍色熒光相重疊，這說明尺寸可變納米集簇有助于藥物富集在腫瘤細胞核位置。

圖8 各納米制劑處理后4T1 細胞的藥物攝取情況

圖9 DOX、PAMAM/DOX 和PAMAM/DOX-pep 對細胞的毒性（n=5）

2.7 PAMAM/DOX-pep的體外抗腫瘤效果

采用MTT法檢測各納米復合物的體外抗腫瘤效果，作用24 h后，各制劑對細胞均有一定程度的損傷，且呈劑量依賴性。DOX對4T1細胞的IC 50為0.62 μg/mL，相比于游離DOX，PAMAM包載后增加了DOX的細胞攝取量，從而增加了細胞毒性。

3 討 論

本研究構建了腫瘤微環境響應型納米遞送系統PAMAM/DOX-pep，并對其理化性質，以及通過尺寸縮小克服體內生物學障礙實現靶向遞送的可行性在小鼠乳腺癌細胞模型中進行研究。該納米遞送系統的初始尺寸為200 nm，適宜通過EPR效應在腫瘤部位蓄積；到達腫瘤部位后，多肽pep被腫瘤部位高表達的MMP-2裂解，PAMAM/DOX-pep分解為尺寸約為10 nm的PAMAM/DOX，實現靶向藥物遞送。由于腫瘤部位的 pH 低于正常組織，納米顆粒酸性條件下的高藥物釋放率有助于腫瘤部位靶向藥物釋放，從而提高抗腫瘤作用。結果表明，大粒徑納米顆粒PAMAM/DOX-pep更有助于化療藥物DOX的緩釋與低pH下的靶向釋放。此外，多肽pep的修飾可以在一定程度改善納米顆粒的體內穩定性，有助于維持納米顆粒在體內的長循環，納米顆粒在體外7天內較為穩定；在實驗所需的特定濃度下可以忽略PAMAM/DOX-pep的溶血性能，該材料血液相容性良好，可以認為其安全低毒，適合用于靜脈給藥。體外模擬PAMAM/DOXpep被分解并探究其在4T1細胞攝取量的實驗中，PAMAM/DOX-pep與MMP共孵育后細胞攝取量提高，靶向性增加。在對乳腺癌細胞的細胞毒性與抗腫瘤效果中，多肽pep修飾過的大粒徑納米顆粒細胞毒性略低于PAMAM/DOX，側面印證了小粒徑納米顆粒的細胞攝取量較高，從而引發了更高的細胞毒性。這些結果為下一步的體內外抗腫瘤研究奠定基礎，并為設計與構建新型藥物遞送系統實現高效低毒的精準靶向給藥策略提供了方向和依據。