弱酸環境下食管內皮細胞活力與分泌因子的變化

林遜汀 歐陽慧 黃明城 林玉妹 謝晨曦

1 廈門大學附屬中山醫院消化內科（福建廈門 361004）

2 中山大學附屬第七醫院消化內科（廣東深圳 518107）

3 中山大學附屬第七醫院腎內科（廣東深圳 518107）

胃食管反流病（gastro-esophageal reflux disease，GERD）指的是由胃內容物反流引起的癥狀和/或并發癥。傳統觀點認為，反流引起的粘膜損傷是從破壞食管表面上皮的完整性開始的，炎癥逐漸向粘膜下層發展。但Dunbar KB發現，食管炎患者中斷質子泵抑制劑治療后，組織學上再次出現基底細胞間隙增寬、毛細血管擴張、乳頭延長等表現，這些改變與粘膜是否存在破損無關［1］。我們既往的研究也發現，反流性食管炎、非糜爛性胃食管反流病（non-erosive reflux disease，NERD）及高敏性食管的患者均存在基底細胞間隙增寬（dilated intercellular spaces，DIS）的現象，DIS與食管酸暴露百分比時間不存在相關性［2］。Souza RF發現，胃反流物可以刺激食管上皮分泌細胞因子，募集炎癥細胞［3］。炎癥細胞自基底層向上皮浸潤，導致炎癥先自基層發生。這些結果提示，各種因素誘導上皮分泌細胞因子應是GERD重要的病理生理學機制。

酸反流（反流發作時食管pH≤4）是引起GERD的主要原因，對其已有深入的研究。而弱酸反流（反流發作時食管pH 4~7）可能在NERD中具有更大的作用，可以引起食管外癥狀，可能是難治性GERD的主要病因［4］。它是夜間反流的主要形式之一，嚴重影響患者的睡眠和生活質量［5］。目前對弱酸反流的研究相對較少，有必要進一步開展相關的工作。

p38 MAPK是絲裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinases，MAPKs）家族的重要成員，它參與了炎癥、應激、細胞生長和凋亡等多種生理和病理過程。既往研究表明，脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）可以促進RAW 264.7巨噬細胞系產生NO與IL-6，這與促進NF-κB的核轉移有關。而抑制ERK1/2及p38的磷酸化，可顯著減低巨噬細胞炎癥因子的分泌［6］。這提示，p38 MAPK信號通路在調控炎癥的過程中發揮重要的作用。但其在GERD發生發展中的作用，有待進一步研究。

本次研究，我們將采用體外試驗的方法，探索弱酸刺激對人食管內皮細胞（human esophageal endothelial cell，HEEC）的影響，試圖加深對GERD病理生理學機制的了解，并為臨床診療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

1.1.1 主要的實驗材料 （1）細胞：HEEC，貨號：BNCC359279，購自北納生物科技有限公司；（2）CCK8試劑盒：貨號：70-CCK810，購自聯科生物技術有限公司；（3）IL-1β ELISA試劑盒：貨號：EK101BHS，購自聯科生物技術有限公司；（4）p38抗體：貨號：cst8690T，購自Cell Signaling Technology（CST）公司；（5）p-p38抗體：貨號：cst4511T ，購自Cell Signaling Technology（CST）公司；（6）二抗：Goat anti-Mouse IgG 與Goat anti-Rabbit IgG，貨號：GAM007與GAR0072，購自聯科生物技術有限公司；（7）ECL Plus發光試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液（5×）、Western及IP細 胞裂解液、PMSF、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天公司；（8）彩色預染蛋白分子量標準：購自Fermentas 公司。

1.1.2 主要儀器 （1）二氧化碳培養箱：3111型（美國 Thermo Fisher Scientific公司）；（2）微光分光光度計：SMA4000型（美國 Merinton公司），配套使用的軟件為 SMA4000 V4.2.3；（3）全波長酶標儀：SpectraMax Plus 384 型（美國Molecular Devices公司）；（4）倒置相差顯微鏡：ECLIPSE Ti-S型（日本 Nikon 公司）；（5）低速自動平衡離心機：TDZ4-WS型，湖南湘儀實驗儀器有限公司；（6）臺式高速冷凍離心機：TGL-16型，湖南湘儀實驗儀器有限公司；（7）臺式低速離心機：TDZ4-WS型，上海盧湘儀離心機儀器公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞活力檢測

1.2.1.1 細胞培養：將細胞置于含10% FBS、1%丙酮酸鈉的MEM培養基中，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度培養箱中培養。

1.2.1.2 鋪板與換液：取正常培養的處于對數期的細胞，用0.25% Typsin+0.02% EDTA消化，1 000 rpm離心5 min，鋪96孔，每孔均加入1×104個細胞，培養箱中過夜。

1.2.1.3 弱酸性培養基由H2SO4調節pH至6.0~6.5。實驗分組為弱酸性組（pH 6.0~6.5）和中性組（pH 7.0~7.4）。分別加入對應培養基，培養箱中培養1 h，3 h和6 h。（共2個大組，6個亞組。每個亞組設置6個復孔，各測量6次數據）。

1.2.1.4 對應培養時間結束后，每孔加入10%的CCK8檢測液，37 ℃避光反應1 h。于波長450 nm、650 nm處讀取各孔OD值。

1.2.1.5 實驗結果按以下公式計算：細胞活力（%）=實驗組（OD450值-OD650值）/對照組（OD450值-OD650值）×100%。

1.2.2 Western Blot實驗

1.2.2.1 分組：將實驗組1（pH 6.0~6.5）和實驗組2（pH 7.0~7.4）各分為3組。基線組設為0 h，之后分別培養2 h和6 h。（共2個大組，6個亞組，每個亞組的蛋白均測量3次）。

1.2.2.2 收集樣品與電泳：將各組細胞樣品收集到1.5 mL EP管中，每管中加入 200 μL Western及IP裂解液（使用前加入PMSF，終濃度1 mM），混勻后4 ℃充分裂解2 h，采用4 ℃離心機，12 000 r/min離心處理樣品，分別取上清液儲存。上樣前加入5×上樣緩沖液混勻，100 ℃放置10 min，迅速冰浴中冷卻，上樣量為每泳道約30 μg。在電泳槽內加入電泳緩沖液，接通電源，80 V恒壓電泳至溴酚藍跑完濃縮膠層，分離膠120 V恒壓電泳，當溴酚藍遷移至分離膠下緣時，關掉電源，停止電泳。

1.2.2.3 抗體孵育與顯影：將PVDF膜浸入含5%脫脂奶粉的封閉液中，置搖床上緩慢搖動，室溫封閉1 h。取出已封閉的PVDF膜，加入一抗，4 ℃孵育過夜（p-p38、p38稀釋比為1∶1 000，GAPDH稀釋比為1∶5 000）。洗膜3次，每次10 min，之后孵育二抗（稀釋比為1∶5 000），于室溫搖床上孵育1 h。再次洗膜3次，每次10 min。將PVDF膜置于保鮮膜上，取適量ECL試劑盒中等體積的A液和B液混合，混勻后加在膜的表面，移入凝膠成像分析儀中，化學光敏模式曝光顯影。

1.2.3 ELISA檢測

1.2.3.1 將實驗組1（pH 6.0~6.5）和實驗組2（pH 7.0~7.4）各分為3組。基線組均設為0 h，之后分別培養2 h、6 h。（共2個大組，6個亞組。每個亞組的IL-8和IL-1β，均測量9次樣本數據）。

1.2.3.2 采用5 000 r/min 離心后取細胞培養液上清待用。將要用的ELISA 板用1×Wash solution 浸泡30 s，去盡洗液，盡量不要使孔板干燥。

1.2.3.3 標準品孔加入100 μL 2倍稀釋的標準品，空白孔加入100 μL 標準品稀釋液，其余孔加入待測樣本100 μL，加上覆膜，300 r/min振蕩，室溫下孵育1.5 h。棄去液體，每孔加入350 μL 1×Washing buffer清洗，浸泡1 min，吸水紙上輕拍移除孔內液體，重復6次。

1.2.3.4 每孔加入100 μL稀釋的檢測抗體，加上覆膜，300 r/min振蕩，室溫下孵育0.5 h。棄去液體，每孔加入350 μL 1×Washing buffer 清洗，浸泡 1 min，吸水紙上輕拍移除孔內液體，重復6次。

1.2.3.5 每孔加100 μL稀釋的辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素，加上覆膜，300 r/min振蕩，室溫下孵育0.5 h。棄去液體，如上述1.2.3.3中步驟進行清洗。

1.2.3.6 每孔加入100 μL稀釋的信號增強劑，加上覆膜，300 r/min振蕩，室溫下孵育0.25 h。棄去液體，如上述1.2.3.3中步驟進行清洗。

1.2.3.7 每孔加100 μL稀釋的辣根過氧化物酶標記的鏈霉親和素，加上覆膜，300 r/min振蕩，室溫下孵育0.25 h，棄去液體，如上述1.2.3.3中步驟進行清洗。

1.2.3.8 每孔中分別加100 μL TMB底物溶液，室溫避光孵育5~30 min。在每孔中加入 100 μL Stop Solution，輕輕混勻，于波長450 nm和570 nm處讀取OD值，進行數據分析。

1.2.3.9 將實驗組1（pH 6.0~6.5）和實驗組2（pH 7.0~7.4）各分為4個亞組。一組設為對照，另外3組中加入不同濃度的p38抑制劑SBS 203580（低濃度抑制劑為1 μM，中濃度抑制劑2 μM，高濃度抑制劑3 μM）。培養時間為6 h。其余ELISA檢測步驟如上述。（共2個大組，8個亞組。每個亞組均測量9次數據）。

1.3 統計學分析

數據表示為平均值±標準差。使用單因素方差分析來比較差異。P值小于0.05被認為具有統計學意義。使用SPSS 23.0（SPSS Inc.，Chicago，IL，USA）完成統計分析。

2 結 果

2.1 不同培養條件下細胞活力的改變

HEEC細胞分別在中性（pH 7.0~7.4）和弱酸性（pH 6.0~6.5）環境下培養1 h，3 h和6 h。隨著時間的延長，弱酸性組中的細胞活力下降。結果如表1所示。

表1 細胞活力（%）的對比 （）

表1 細胞活力（%）的對比 （）

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2.2 不同培養條件下p38和p-p38蛋白表達的變化

以0 h的蛋白水平設為基線。2個實驗組基線的p38蛋白水平相似（P＞0.05）。與基線相比，隨著培養時間的延長，2組的p38表達均沒有明顯變化（P＞0.05）。基線時，2個實驗組中p-p38的含量沒有顯著差異（P＞0.05）。中性組中的p-p38含量隨培養時間的延長，沒有顯著改變（P＞0.05）。在弱酸組中，p-p38的含量在培養2 h和6 h后，較基線水平均明顯增加（P＜0.01），且高于同時段的中性組（P＜0.05）。其結果如表2與圖1所示。

圖1 弱酸培養促進食管內皮細胞內p-p38 的含量增加

表2 蛋白灰度值比值變化 （）

表2 蛋白灰度值比值變化 （）

注：灰度值比值指蛋白條帶灰度值和內參灰度值的比值。

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2.3 不同培養條件下IL-8和IL-1β的表達情況

HEEC細胞分別在中性（pH7.0~7.4）和弱酸性（pH6.0~6.5）環境下培養。采用ELISA法檢測基線時（0 h），以及培養2 h和6 h后上清中IL-8和IL-1β的濃度。我們發現，隨著培養時間的延長，IL-8和IL-1β的濃度在中性組中無顯著變化（P＞0.05）。弱酸組中，與基線時相比，IL-8和IL-1β的濃度在培養2 h和6 h后明顯升高，且高于同時段的中性組（P＜0.01）。結果如表3和圖2所示。

圖2 弱酸培養促進IL-8 和IL-1β 的表達

表3 上清中IL-8和IL-1β濃度的變化 （，pg/mL）

表3 上清中IL-8和IL-1β濃度的變化 （，pg/mL）

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2.4 抑制p38激酶活性對IL-8和LI-1β的影響

和中性對照組相比，弱酸對照組I L-8 和IL-1β濃度升高（P＜0.01）。采用中性培養基的條件下，加入p38抑制劑后，和對照組相比，其余各組IL-8和IL-1β無顯著變化（P＞0.05）。采用弱酸培養基的條件下，加入p38抑制劑后，和對照組相比，其余各組IL-8和IL-1β的濃度明顯降低（P＜0.05）。結果如表4和圖3所示。

圖3 抑制p38 催化活性可以減少IL-8 和IL-1β 表達（培養6 h）

表4 加入p38抑制劑后IL-8和IL-1β濃度的變化 （，pg/mL）

表4 加入p38抑制劑后IL-8和IL-1β濃度的變化 （，pg/mL）

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3 討 論

胃食管反流病是一種臨床常見的疾病，在亞太國家，GERD的發病率有逐漸上升的趨勢［7］。GERD最常見的癥狀是燒心和反流［8］。通常情況下，反流和燒心的主要病因是酸反流，它是決定食管炎嚴重程度的主要因素［4］。但在采用質子泵抑制劑治療，癥狀仍然持續的患者中，非酸反流被認為是引起癥狀的主要原因［4，9］。在這部分患者中，大部分的反流事件是弱酸反流（pH4~7），堿反流（pH＞7）僅占很小的一部分［9-10］。因此，深入研究弱酸反流有利于加深對難治性GERD的了解，提高臨床療效。本次研究，我們采用體外實驗，探索弱酸刺激對食管內皮細胞的影響。

我們發現，在1h以后，弱酸環境下的食管內皮細胞活力明顯下降，而IL-8和IL-1β的表達明顯升高。且隨著培養時間的延長，該現象越明顯。這提示，弱酸刺激可能通過炎癥級聯放大效應促進食管細胞死亡和組織損傷。IL-8和IL-1β由巨噬細胞和多種組織細胞釋放。既往研究表明，非酸反流可以促進食管鱗狀上皮細胞分泌IL-8和IL-1β，趨化炎癥細胞，使黏膜固有層或更深層的感覺神經元暴露于炎癥介質，引發癥狀［1，11-12］。這和我們的結果相符。胃食管反流病的組織病理學特征，如基底細胞增生，乳頭狀延長，中性粒細胞和嗜酸性粒細胞浸潤均與黏膜中較高水平的IL-8相關［13-14］。在高脂飲食的小鼠模型中，IL-8是促進食管上皮不典型增生的關鍵因子［15］。反流性食管炎患者采用蘭索拉唑治療，可以促使黏膜的IL-8水平顯著下降［13］。半胱天冬酶1可以被炎癥小體激活，導致包括Il-1β在內的諸多炎癥因子的產生，觸發食管細胞焦亡。這與食管炎和食管癌的發生有關［16］。在存在嚴重癥狀或癥狀反復發作的GERD患者中，對IL-1β單核苷酸多態性的評估有利于識別具有巴雷特食管和食管癌風險的患者［17］。我們認為，進一步研究弱酸對食管內皮細胞所處的免疫微環境的影響，將有利于加深對NERD發病機制的了解。

本次研究，我們發現，p38的總量并沒有隨著培養時間的延長而增加，也不受培養基pH值的影響。但其活性形式p-p38在弱酸刺激下明顯增加。酪蛋白激酶2（CK2）是p38重要的下游底物，可以引起IκBa的泛素化降解，促進NF-κB的核易位，也可以通過磷酸化P65/RelA，增強NF-κB與DNA位點的結合力［18］。如果食管上皮長期暴露于胃反流物中，會觸發細胞發生基因突變。如果突變發生于腫瘤蛋白p53基因，突變的p53可以與NFκB一起促進腫瘤的發展［19］。在GERD患者的食道黏膜中發現了NF-κB的激活，并且NF-κB亞基主要定位于表達IL-8的細胞的細胞核中［20］。因此，我們推測，對于GERD患者，p38 MAPK信號通路可能具有調節相關炎癥反應的作用。SB 203580被廣泛用于分析p38 MAPK在各種生理過程中的作用。SB 203580對p38的激活沒有影響，主要起到阻斷p38 MAPK的催化活性的作用［21］。激活的p38能夠自我活化，增加細胞內p-p38的含量，而SB203580能夠抑制這種正反饋調節。我們發現，加入p38抑制劑后，IL-8和IL-1β的表達明顯下降，且隨著抑制劑濃度的增強，下降趨勢越明顯。這表明，在弱酸反流的過程中，p38相關信號通路的激活具有促進炎癥的作用，抑制p38 MAPK可能是一種潛在的治療GERD的方案，但還需體內實驗進一步驗證。

本次研究存在以下不足之處：第一，僅采用CCK8實驗檢測細胞活力，未進一步檢測凋亡相關蛋白、細胞緊密連接蛋白等的表達，也未進行細胞周期檢測，故未能完整、系統的揭示弱酸刺激對食管細胞功能的影響，這在未來的實驗中將進一步驗證；第二，我們未進行動物模型的構建，體外實驗的結論能否在體內實驗中重現，需要進一步的研究。

綜上所述，弱酸培養導致食管內皮細胞活力下降，炎癥因子的表達增加。抑制p38的激酶活性可以減少IL-8和IL-1β的產生，從而抑制炎癥。進一步開展關于p38 MAPK信號通路的研究，可以加深對難治性GERD發病機制的理解，開拓臨床治療思路。