人參皂苷Rg1拮抗亞砷酸鈉誘導(dǎo)C57BL/6小鼠腎毒性研究

楊淵　宋爽　陳容　劉永蓮　劉春燕

摘要：目的 探討人參皂苷Rg1對亞砷酸鈉（SA）誘導(dǎo)小鼠腎臟毒性的干預(yù)效應(yīng)。方法 20只雄性健康C57BL/6小鼠采用隨機數(shù)字表法均分為對照組（給予去離子水灌胃）、SA染毒組（10.0 μg/g SA進行灌胃）、人參皂苷Rg1+SA染毒組（20.0 μg/g人參皂苷Rg1在SA染毒前8 h腹腔注射+10.0 μg/g SA灌胃）、人參皂苷Rg1對照組（20.0 μg/g人參皂苷Rg1腹腔注射）。以上各組均隔天給予相應(yīng)處理1次，持續(xù)14 d。HE染色觀察腎組織病理改變并進行腎小管損傷（TI）評分；酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）檢測血清肌酐（Scr）和腎組織谷胱甘肽（GSH）、血紅素加氧酶-1（HO-1）、丙二醛（MDA）含量；免疫印跡試驗檢測腎組織HO-1、磷酸化哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）、泛素結(jié)合蛋白P62（SQSTM1/p62）、unc-51樣激酶-1（ULK1）和微管相關(guān)蛋白輕鏈3B（LC3-B）表達水平；免疫熒光染色檢測LC3-B水平。結(jié)果 與對照組相比，SA染毒組小鼠TI評分、Scr和腎組織MDA、ULK1和LC3-B表達水平升高，腎組織GSH和HO-1、p-mTOR和SQSTM1/p62表達水平降低（P＜0.05），呈紅色斑點的LC3-B染色強度增強、增多；與SA染毒組相比，人參皂苷Rg1+SA染毒組TI評分、Scr和腎組織MDA、ULK1和LC3-B表達水平降低，而GSH、HO-1、p-mTOR和SQSTM1/p62表達水平升高（P＜0.05），LC3-B免疫熒光染色強度減弱、減少。結(jié)論 人參皂苷Rg1拮抗SA誘導(dǎo)的小鼠腎毒性，可能與HO-1信號激活和細(xì)胞自噬抑制有關(guān)。

關(guān)鍵詞：人參皂苷Rg1；砷中毒；血紅素加氧酶-1；自噬；腎毒性

中圖分類號：R114文獻標(biāo)志碼：ADOI：10.11958/20221834

Study of ginsenoside Rg1 antagonizes sodium arsenite-induced

nephrotoxicity in C57BL/6 mice

YANG Yuan SONG Shuang CHEN Rong LIU Yonglian LIU Chunyan

1 Department of Toxicology， School of Public Health， Guizhou Medical University， Guiyang 550025， China;

2 Ethnic Medicine Research Center， Hunan University of Medicine

Abstract： Objective To investigate the intervention effect of ginsenoside Rg1 （Rg1） against sodium arsenite （SA） induced nephrotoxicity in mice. Methods Twenty healthy male C57BL/6 mice were randomly divided into the control group （given deionized water by gavage）， the SA exposure group （10.0 μg/g SA by gavage）， the Rg1 intervention+SA exposure group （20.0 μg/g Rg1 was injected intraperitoneally 8 hours before SA exposure+10.0 μg/g SA gavage） and the Rg1 control group （20.0 μg/g Rg1 intraperitoneal injection）. All of groups were given corresponding treatment once every other day for 14 days. HE staining was performed to observe pathological changes of renal tissue and renal tubular injury （TI） score. Serum creatinine （Scr） and renal glutathione （GSH）， heme oxygenase-1 （HO-1） and malondialdehyde （MDA） were detected by enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）. The expression levels of HO-1， phosphorylated mammalian target of rapamycin （p-mTOR）， ubiquitin-binding protein P62 （SQSTM1/p62）， unc-51-like kinase-1 （ULK1） and microtubule-associated protein light chain 3B （LC3-B） in renal tissue were detected by Western blot assay. LC3-B levels were detected by immunofluorescence staining. Results Compared with the control group， the TI score， Scr and expression levels of MDA， ULK1 and LC3-B in renal tissue were increased in the SA group， while expression levels of GSH and HO-1， p-mTOR and SQSTM1/p62 in renal tissue were decreased （P＜0.05）. The staining intensity of red spot LC3-B was enhanced and increased. Compared with the SA group， TI score， Scr and expression levels of MDA， ULK1 and LC3-B in renal tissue were decreased in the Rg1 +SA group， while expression levels of GSH， HO-1， p-mTOR and SQSTM1/p62 were increased （P＜0.05）. The immunofluorescence staining intensity of LC3-B was weakened and decreased. Conclusion Rg1 antagonizes SA-induced nephrotoxicity in mice， which may be associated with the activation of HO-1 signal and the inhibition of autophagy.

Key words： Ginsenoside Rg1; arsenic poisoning; heme oxygenase-1; autophagy; nephrotoxicity

砷在環(huán)境中通常以三價化合物形式存在，可污染土壤、飲用水和農(nóng)作物，在一定條件下暴露于機體，可導(dǎo)致腎小球或腎小管組織病理學(xué)損傷、腎功能障礙［1-2］。既往研究發(fā)現(xiàn)，砷暴露可誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞或雞睪丸組織細(xì)胞凋亡和自噬，與細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶B（protein kinase B，Akt/PKB）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路抑制有關(guān)，而活性氧（ROS）清除劑可明顯拮抗砷的毒性效應(yīng)［3-4］。中藥人參（Panax ginseng C.A.Mey.）屬于五加科的多年生草本植物，其主要生物活性成分是人參多糖和人參皂苷。研究發(fā)現(xiàn)，人參多糖提取物具有抗氧化作用，能有效減輕順鉑誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷［5］。人參皂苷Rg1是人參主要藥物活性成分提取物，目前市售最為常見。其除增強機體的抗氧化活性外［6］，還具有激活mTOR信號通路［7］、抗炎、抑制細(xì)胞凋亡和自噬的作用［8-9］。目前，人參皂苷Rg1對砷誘導(dǎo)腎毒性的干預(yù)效應(yīng)尚不清楚。本研究旨在探討人參皂苷Rg1對亞砷酸鈉（sodium arsenite，SA）誘導(dǎo)小鼠腎毒性的拮抗效應(yīng)及機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

20只雄性SPF級C57BL/6小鼠購自湖南長沙斯萊克實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004，使用許可證號：SYXK（湘）2019-0017。小鼠體質(zhì)量24.1～26.8 g，平均（25.2±1.1）g，9～10周齡。在標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)條件（12 h光照/黑暗、溫度20～22 ℃和相對濕度60%～70%）適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑及儀器

亞砷酸鈉（NaAsO2）購自美國Sigma-Aldrich公司；人參皂苷Rg1購自上海篤瑪生物科技有限公司；血清肌酐（Scr）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自上海篤瑪生物技術(shù)有限公司；丙二醛（malondialdehyde，MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HO-1）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；RIPA裂解緩沖液購自美國BioVision公司；Bradford試劑購自美國Sigma-Aldrich公司；兔單克隆HO-1抗體、兔單克隆mTOR抗體與磷酸化mTOR抗體（p-mTOR）、兔多克隆酵母自噬基因Atg1同源物unc-51樣激酶-1（unc-51-like kinase-1，ULK1）抗體、泛素結(jié)合蛋白p62（sequestosome 1，SQSTM1/p62）抗體、微管相關(guān)蛋白輕鏈3B（microtubule associated protein light chain 3B，LC3-B）抗體均購自英國Abcam公司；兔抗辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記IgG二抗購自美國LSBio公司；化學(xué)發(fā)光試劑盒購自上海碧云天生物公司；酶標(biāo)儀購自美國BioTek公司；Motic光學(xué)顯微鏡購自麥克奧迪公司。

1.3 分組

采用隨機數(shù)字表法將小鼠分為4組，每組5只。對照組：給予去離子水灌胃，隔天1次，持續(xù)14 d；SA染毒組：NaAsO2溶于去離子水，參考文獻［10-11］及大小鼠等效劑量換算比值，以10.0 μg/g劑量進行灌胃，隔天1次，持續(xù)14 d；人參皂苷Rg1+SA染毒組：參考文獻［12-13］，以人參皂苷Rg1 20.0 μg/g，在SA染毒前8 h進行腹腔注射干預(yù)，然后給予SA10.0 μg/g灌胃處理；人參皂苷Rg1對照組：人參皂苷Rg1用去離子水稀釋，以20.0 μg/g劑量腹腔注射，隔天1次，持續(xù)14 d。實驗結(jié)束時，腹腔注射0.9%戊巴比妥鈉麻醉小鼠并實施安樂死，立即收集血液和腎組織進行分析。本動物研究方案經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號：1900222），根據(jù)動物實驗：報告體內(nèi)實驗（Animal Research：Reporting of in vivo Experiments，ARRIVE）指南的原則執(zhí)行本實驗方案。

1.4 腎功能和組織病理學(xué)評價

取0.5 mL血后以4 ℃、400 r/min離心5 min，根據(jù)ELISA試劑盒操作說明檢測上清液Scr含量。腎組織經(jīng)4%多聚甲醛固定72 h后，用石蠟包埋以制備5 μm病理切片，然后在顯微鏡下行蘇木精-伊紅（HE）染色，并進行腎小管損傷（TI）評分［14］。TI定義為：腎小管擴張，管狀上皮腫脹，細(xì)胞呈空泡樣或顆粒樣變性、壞死，刷狀緣缺失或呈管型結(jié)構(gòu)。通過顯微鏡觀察腎組織切片中腎小管病變區(qū)域，評估每個高倍視野下病變區(qū)域的損傷面積百分率（%），每張切片計算10個高倍視野下TI評分平均值。

1.5 ELISA檢測腎組織HO-1、GSH和MDA含量

腎組織分離并稱質(zhì)量，按1∶9質(zhì)量體積比比例加入磷酸鹽緩沖液（PBS）配制成0.1 g/mL，使用勻漿器進行勻漿，然后加入RPMI培養(yǎng)基（含有0.05%Ⅱ型膠原酶，0.002%DNase Ⅰ和0.6%胎牛血清），37 ℃下孵育30 min后，進行3次凍融循環(huán)以裂解腎組織細(xì)胞。最后，組織勻漿液4 ℃冷凍離心10 min（1 500 r/min），收集上清液，參照ELISA試劑盒操作說明書，使用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測量光密度（OD）值，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將OD值轉(zhuǎn)換為腎組織MDA、GSH和HO-1含量。

1.6 免疫印跡試驗檢測腎組織HO-1、p-mTOR、ULK1、SQSTM1/p62和LC3-B表達

腎組織分離后加入RIPA裂解緩沖液以裂解細(xì)胞提取總蛋白，使用Bradford試劑測定蛋白質(zhì)濃度，腎組織樣品通過十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)移到聚乙烯亞胺（PVD）膜上。隨后使用5%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉2 h以阻斷非特異性結(jié)合位點后，將膜與HO-1（1∶1 500）、p-mTOR（1∶1 000）、mTOR（1∶1 500）、ULK1（1∶500）、SQSTM1/p62（1∶800）、LC3-B抗體（1∶400）于4 ℃孵育16 h。TBS-T緩沖液洗膜3次后，加入二抗HRP IgG 室溫孵育2 h，然后加入化學(xué)發(fā)光顯影試劑成像。通過目標(biāo)靶蛋白與抗β-肌動蛋白內(nèi)參抗體的吸光度比值來評估靶蛋白表達相對水平。

1.7 免疫熒光染色檢測LC3-B表達

腎組織分離后加入4%多聚甲醛溶液，4 ℃過夜固定，制備5 μm切片，切片經(jīng)脫蠟、水化、洗滌后，進行高壓抗原修復(fù)和山羊血清封閉，然后與LC3-B一抗在4 ℃孵育過夜。PBS緩沖液洗滌3次后，與HRP標(biāo)記IgG二抗在37 ℃孵育40 min，PBS再次洗滌3次，然后在室溫下用4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）復(fù)染5 min，再次洗滌切片后，通過共聚焦顯微鏡（LeicaTCS-SP5）進行熒光成像觀察（Alexa Fluor? 555發(fā)射波長為535 nm，DAPI發(fā)射波長為340 nm）。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 23.0進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組腎臟組織病理損傷比較

對照組腎組織形態(tài)正常，腎小管上皮細(xì)胞核膜光滑，細(xì)胞質(zhì)染色均勻，核質(zhì)比正常，細(xì)胞間距正常；與對照組相比，SA染毒組腎小球球囊增大，毛細(xì)血管充血，腎小管管腔不規(guī)則，小管上皮細(xì)胞水腫，部分核消失，Scr和TI評分明顯升高（P＜0.05）。與SA染毒組相比，人參皂苷Rg1+SA染毒組腎小球毛細(xì)血管充血、腎小管上皮細(xì)胞和腎間質(zhì)水腫改善，Scr和TI評分下調(diào)（P＜0.05）。人參皂苷Rg1對照組腎組織形態(tài)正常，與對照組類似。見圖1、表1。

2.2 各組腎組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

與對照組相比，SA染毒組小鼠腎組織GSH和HO-1表達水平降低，MDA表達水平升高（P＜0.05）；與SA染毒組相比，人參皂苷Rg1+SA染毒組小鼠腎組織GSH和HO-1細(xì)胞水平升高，而MDA細(xì)胞水平降低（P＜0.05），見表1。

2.3 各組腎組織中HO-1、p-mTOR、SQSTM1/p62、ULK1和LC3-B水平比較

與對照組相比，SA染毒組小鼠腎組織中HO-1、p-mTOR和SQSTM1/p62表達水平降低，ULK1和LC3-B表達水平升高（P＜0.05）。與SA染毒組相比，人參皂苷Rg1+SA染毒組HO-1、p-mTOR和SQSTM1/p62水平上調(diào)，ULK1和LC3-B水平降低（P＜0.05），見圖2、3，表2。腎組織免疫熒光染色顯示，與對照組相比，SA染毒組小鼠腎組織呈紅色斑點的LC3-B染色強度增強、增多。與SA染毒組相比，人參皂苷Rg1+SA染毒組顯示LC3-B免疫熒光染色強度減弱、減少，見圖4。

3 討論

砷是一種環(huán)境中廣泛存在的高毒性致癌物，通常由于含砷礦開采冶煉、含砷農(nóng)藥生產(chǎn)使用等活動導(dǎo)致環(huán)境砷污染，通過直接接觸或食物鏈攝入過量砷可導(dǎo)致急慢性砷中毒發(fā)生，產(chǎn)生肝、腎、皮膚、神經(jīng)系統(tǒng)等多器官損害效應(yīng)［15］。本研究發(fā)現(xiàn)，急性砷暴露可導(dǎo)致小鼠腎臟組織病理損傷，表現(xiàn)為Scr、腎小管損傷評分和氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA水平升高，而腎組織抗氧化劑GSH和HO-1含量降低，提示氧化應(yīng)激在砷致腎毒性中扮演著重要的角色。人參作為一種廣泛使用的傳統(tǒng)中藥，其生物活性提取物富含與多糖結(jié)合的甾體皂苷，其用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)、代謝、感染和腫瘤等疾病治療已有約5 000年歷史［16］。研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1具有上調(diào)GSH和下調(diào)MDA的抗氧化應(yīng)激效應(yīng)［17］，具有抑制小鼠NOD樣受體熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）炎癥信號激活及改善腎臟衰老期腎小球纖維化效應(yīng)［18］。Fan等［19］發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rg1可拮抗D-半乳糖誘導(dǎo)的小鼠亞急性腎組織損傷。Guo等［20］發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1可通過抑制腎小管上皮細(xì)胞鐵死亡而改善膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷。本研究中，與SA染毒組相比，人參皂苷Rg1干預(yù)+SA染毒組小鼠腎組織損傷程度明顯減輕，Scr、腎小管損傷評分和腎組織MDA水平降低，HO-1和GSH水平升高，而自噬標(biāo)志物ULK1和LC3-B水平降低以及自噬反應(yīng)底物SQSTM1/p62蛋白水平升高，提示HO-1激活、自噬抑制與人參皂苷Rg1拮抗砷誘導(dǎo)小鼠腎毒性效應(yīng)有關(guān)。

HO-1是機體內(nèi)廣泛分布的一種重要的抗氧化酶，與細(xì)胞內(nèi)絲氨酸或蘇氨酸激酶家族mTOR信號激活有關(guān)。乙醇可誘導(dǎo)人食管鱗癌細(xì)胞HO-1水平上調(diào)，伴隨著p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）和mTOR信號激活［21］；HO-1可與甾醇異構(gòu)酶相互作用，從而激活mTOR信號通路以減輕膽固醇誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞缺氧［22］。mTOR信號通路激活后，可磷酸化ULK1第757位絲氨酸并阻止ULK1激活，破壞ULK1與腺苷酸活化蛋白激酶的相互作用，從而抑制細(xì)胞自噬［23］。反之，mTOR信號抑制可導(dǎo)致下游靶p70核糖體蛋白S6激酶和真核起始因子4E結(jié)合蛋白1磷酸化抑制，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)基因-蛋白質(zhì)翻譯減少、細(xì)胞生長周期及細(xì)胞增殖抑制，從而激活細(xì)胞自噬［24］。在青蒿琥酯染毒的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎小鼠模型中，抑制mTOR信號通路可加速軟骨細(xì)胞自噬［25］。本研究發(fā)現(xiàn)，與SA染毒組相比，人參皂苷Rg1+SA染毒組腎組織p-mTOR水平升高，因此推測人參皂苷Rg1可誘導(dǎo)HO-1介導(dǎo)的mTOR信號激活，促進細(xì)胞生長及增殖、抑制腎組織細(xì)胞自噬以改善SA誘導(dǎo)的腎組織損傷。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1通過激活HO-1信號介導(dǎo)抗氧化應(yīng)激，并激活mTOR信號介導(dǎo)的細(xì)胞自噬抑制效應(yīng)減輕SA誘導(dǎo)小鼠腎臟病理損傷。目前，人參皂苷Rg1拮抗砷誘導(dǎo)的腎毒性作用機制尚未完全清楚，人參皂苷Rg1激活HO-1和mTOR信號通路以及抑制細(xì)胞自噬的分子調(diào)控機制需要進一步探索。

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（2022-11-07收稿 2023-03-01修回）

（本文編輯 李志蕓）