受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1與腫瘤細胞信號通路關系的研究進展

其力木格, 李雪連, 紀 強

(1. 陽光融和醫院 藥學部 臨床藥學室, 山東 濰坊, 261061;2. 哈爾濱醫科大學 藥學院 藥理教研室 心血管藥物研究教育部重點實驗室, 黑龍江 哈爾濱, 150081)

受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1(ROR1)是受體酪氨酸激酶(RTKs)家族成員之一,是人類神經母細胞瘤細胞系中的一種高度保守的I型單次跨膜蛋白,被發現時其配體未知,故命名為孤兒受體,存在于人類、雞、小鼠、斑馬魚、果蠅和蛔蟲等多種物種中[1-2]。ROR1在小鼠胚胎早期起重要作用,出生后表達下降,在人正常組織中幾乎不表達[3]。研究[4]發現, ROR1是一種重要的癌胚蛋白,在多種惡性腫瘤中的表達遠高于相鄰正常組織。ROR1通過激活多種細胞內信號傳導通路來影響腫瘤的發生及發展[5]。本文就ROR1通過細胞內信號轉導通路對惡性腫瘤發揮作用的研究現狀展開綜述。

1 ROR1通過Wnt信號通路對惡性腫瘤的作用

Wnt(Wingless/Integrated)信號通路可調節細胞增殖、遷移和分化,在胚胎發育和成人組織穩態的維持中發揮重要作用,其信號轉導功能障礙存在于包括癌癥在內的多種人類疾病[6]。Wnt信號通路分為經典Wnt/β-catenin信號通路和非經典Wnt信號通路,后者包括Wnt/平面細胞極性(PCP)和Wnt/Ca2+通路[7]。最近研究[8]發現新的非經典Wnt通路,即通過ROR1介導的Wnt/ROR1信號通路,可與部分Wnt配體相互作用。在結構上,ROR1的富含半胱氨酸結構域(CRD)與卷曲蛋白(FZD)受體的CRD相似,已被確定為Wnt配體結合的必要結構域[9]。

1.1 Wnt5a/ROR1信號傳導通路

FUKUDA T等[10]在人胚腎細胞(HEK293T)共轉染NF-κB報告基因、β-半乳糖苷酶(β-gal)載體以及編碼ROR1、Wnt5a、Wnt3、Wnt5b和Wnt16的表達載體,并通過免疫共沉淀技術分析發現, ROR1只與Wnt5a基因共表達,進而誘導NF-κB激活,但未激活淋巴增強因子/T細胞轉錄因子(LEF/TCF)、活化T細胞核因子(NFAT)和激活蛋白-1(AP-1)的報告基因,表明ROR1可與Wnt5a相互作用,且活化NF-κB,而不是經典Wnt信號轉導通路。GHADERI A等[11]進一步證實了Wnt5a為ROR1的配體,其通過激活非經典Wnt信號通路來刺激ROR1信號通路。

在慢性淋巴細胞白血病(CLL)的細胞中, Wnt5a可誘導ROR1與ROR2形成異質低聚物,并激活鳥嘌呤交換因子(GEF)和Rho家族小分子鳥苷三磷酸酶(GTPases),從而促進細胞的侵襲或遷移,也可通過誘導ROR1與胞質分裂作用因子2(DOCK2)相互作用來激活大鼠肉瘤病毒相關C3肉毒菌毒素底物1(Rac1/2), 進而促進細胞增殖。然而,KAN0439834(535 Da)作為一種ROR1選擇性抑制劑,可抑制Wnt5a對ROR1的磷酸化作用,從而發揮細胞凋亡和抑制細胞生存作用[12-13]。

在黑素瘤中, ROR1的下調會導致ROR2和Wnt5a的表達增加,而ROR2的下調會刺激ROR1的表達[8]。Wnt5a也可以導致ROR1招募造血系細胞特異性蛋白-1(HS1)與細胞皮質區肌動蛋白結合蛋白,HS1細胞皮質區肌動蛋白結合蛋白復合物將ROR1連接到肌動蛋白細胞骨架上,從而促進平面細胞極性、絲狀偽足的形成和趨化因子定向遷移[14]。在細胞外, Wnt5a與ROR1的CRD的結合可以觸發ROR1信號通路的激活,最終在細胞核中表達細胞外信號調節酶1/2(ERK1/2)、核轉錄因子κB(NF-κB)和核因子紅細胞系2相關因子2(NRF2)靶基因[4]。

由此可見, Wnt5a-ROR1結合可能通過誘導Rac1/2、GTP、NF-κB、ERK1/2、NRF2激活非典型Wnt通路,以維持細胞存活和增殖。

1.2 Wnt5b/ROR1信號傳導通路

Wnt5b與ROR1結合后激活蓬亂蛋白2/3(DVL2/3)、Rac1、細胞分裂周期蛋白42(Cdc42)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)、細胞周期蛋白依賴性激酶5(CDK5)、SIN3轉錄調節因子家族成員A(Sin3A)信號傳導和抑制β-catenin活性,從而抑制成骨細胞的分化[15]。人類Wnt5b是非典型的Wnt配體受體,通過FZD3或FZD6受體以及ROR1、ROR2或蛋白酪氨酸激酶7(PTK7)共受體傳導Wnt/PCP信號[16]。

1.3 Wnt3a/ROR1信號傳導通路

研究[17]證明,在HEK293T細胞共轉染ROR1與Wnt5a和Wnt3a時,可抑制Wnt3a誘導的報告基因質粒活性,并呈劑量依賴性,表明Wnt5a和ROR1可能通過抑制Wnt3a信號通路來調控卵巢發育。

1.4 Wnt9a/ROR1信號傳導通路

共表達Wnts和ROR1或ROR2的HEK293T細胞提取物的免疫共沉淀實驗結果表明, Wnt9a(曾稱Wnt14)可以與ROR1相互作用,且Wnt9a是通過與ROR1的免疫球蛋白樣結構域結合而發揮其作用[18]。ROR1和Wnt9a在成人肌肉骨骼系統的再生和維持中起著關鍵作用[19-20]。ROR1hyp/hyp和Wnt9a-/-單突變體均沒有顯示出與腭裂表型, ROR1hyp/hyp沒有表現長骨相關表型, Wnt9a突變體僅顯示出輕微的縮短; 然而在ROR1hyp/hyp與Wnt9a-/-雙突變體模型中表現出較短的長骨; 還觀察到腭裂繼發性表型,這表明ROR1在基因上與Wnt9a相互作用,且ROR1和Wnt9a的下游通路在軟骨細胞成熟過程中匯聚并協同作用[18]。

1.5 Wnt16b/ROR1信號傳導通路

在t(1; 19)(q23; p13)異位的B前體急性淋巴細胞白血病(BCP-ALL)中過表達的ROR1和Wnt16b均不激活經典的Wnt信號通路,而是通過上調Rho GTPases來驅動非典型Wnt通路激活,從而促進增殖生存和抑制分化,表明這些細胞中可能存在Wnt16b/ROR1信號通路[21]。對ROR1和Wnt16共轉染的HEK293T細胞的ROR1免疫沉淀樣本進行蛋白印跡(WB)分析,結果顯示ROR1和Wnt16之間存在直接相互作用,提示Wnt16可能是ROR1的另一種配體[22]。

2 ROR1通過磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動物西羅莫司靶蛋白(PI3K/Akt/mTOR)信號通路對惡性腫瘤的作用

PI3K/Akt/mTOR信號通路在信號轉導和細胞增殖、凋亡、代謝和血管生成等生物調節中起重要作用[23]。在許多腫瘤實體中, ROR1的激活會導致PI3K、Akt、環磷腺苷效應元件結合蛋白(CREB)和mTOR以及其下游靶點核糖體蛋白S6(RPS6)和重組人翻譯起始因子4E結合蛋白1(4EBP1)的磷酸化[24-25]。

2.1 ROR1通過PI3K/Akt/mTOR對血液及淋巴腫瘤的作用

在套細胞淋巴瘤(MCL)中, ROR1的異常表達可激活PI3K-Akt細胞信號通路,從而促進MCL細胞的生長[26]。

研究[27]表明, ROR1是彌漫性大B細胞淋巴瘤(DLBCL)生存的新型預后標志物, ROR1通過調節PI3K/Akt/mTOR信號通路顯著促進DLBCL腫瘤發生。肺腺癌細胞株用siRNA沉默ROR1可顯著抑制Akt、mTOR、Raptor和核糖體40s小亞基S6蛋白激酶(p70S6K)Thr389部位的磷酸化,并顯著降低體外肺腺癌細胞的遷移和侵襲能力,這表明ROR1可能通過Akt/mTOR信號在肺腺癌的腫瘤進展和轉移中發揮關鍵作用[28]。

將從接受Cirmtuzumab(ROR1特異性抗體)治療的CLL患者分離的細胞用轉錄組測序技術(RNA-seq)進行分析,發現ROR1的特異性抗體降低了mTORC1(mTOR含有2種復合體: mTORC1、mTORC2)誘導的基因,表明mTORC1通路是ROR1的下游信號通路[29]。

2.2 ROR1通過PI3K/Akt/mTOR對呼吸系統腫瘤的作用

在PC-9人肺腺癌細胞中,阻斷ROR1顯著下調了細胞周期誘導分子CDK4和Cyclin E1及抗凋亡分子Bcl-XL和Bcl-2的表達,同時顯著上調了Bak、Caspase-3和Caspase-7等促凋亡分子的表達,導致Akt失活,并通過去磷酸化激活糖原合成酶激酶3α/β(GSK3α/β), 最后使mTOR失活,從而有效地調節肺癌的細胞周期、細胞凋亡和自噬等[30]。在NSCLC細胞中沉默ROR1后發現, GSK3β、磷酸酶張力蛋白同源物(PTEN)、Akt、mTOR和核糖體蛋白S6激酶β1(RPS6Kβ1)等Akt/mTOR信號通路關鍵分子的活性顯著降低[31]。評估ROR1對肺腺癌靶向治療的適用性研究[32]發現,在人肺腺癌細胞沉默ROR1后顯著下調了PI3K/Akt/mTOR信號通路的活性,這與腫瘤細胞的凋亡和抗增殖有關。在肺腺癌中,過表達的ROR1很可能對維持存活期PI3K-Akt和促凋亡p38信號傳導之間的有利平衡發揮作用[33]。

2.3 ROR1通過PI3K/Akt/mTOR對乳腺腫瘤的作用

在人類乳腺癌的腫瘤細胞, ROR1與酪蛋白激酶1(CK1)的相互作用可使PI3K介導的Akt磷酸化和激活CREB[34]。在三陰性乳腺癌中,木麻黃素可抑制ROR1的磷酸化Akt為p-Akt作用,進而抑制下游GSK3β的磷酸化,最終導致細胞存活率的降低和激活半胱氨酸蛋白酶級聯反應[35]。

2.4 ROR1通過PI3K/Akt/mTOR對其他惡性腫瘤的作用

ROR1通過蓬亂蛋白相關形態形成活化因子1(Daam1)和PI3K/Akt信號通路激活RhoA, 并調節骨肉瘤細胞的遷移[36]。在人絨毛膜滋養層細胞過表達的ROR1通過上調PI3K/Akt/mTOR通路中關鍵激酶的磷酸化水平而促進細胞增殖、遷移和侵襲,而ROR1表達被干擾時具有相反的效果[37]。

3 ROR1與Hippo-YAP信號傳導通路

Hippo信號通路是由一組保守的激酶構成的抑制細胞生長的信號通路, Yes關聯蛋白(YAP)為其核心效應分子,是一個候選致癌因子[38]。近年研究[39]證實,Hippo信號傳導通路還在癌癥發生、組織再生以及干細胞的功能調控方面發揮著重要的作用。

研究[40]證明,神經肽1觸發ROR1和人表皮生長因子受體3(HER3)的異源二聚化,導致HER3的Tyr1307位點磷酸化, p-HER3募集幼蟲巨大致死性基因2(Lgl2)、lncRNA MAYA和tRNA 5-甲基胞嘧啶-甲基轉移酶(NSUN6)為LLgl2-MAYA-NSUN6復合物,后者使Lys59處的Hippo/Mst1甲基化,導致Mst1的失活和YAP靶基因的激活,從而引起破骨細胞分化和骨吸收。

抗體藥物結合恩美曲妥珠單抗(T-DM1)治療HER2陽性乳腺癌可誘導ROR1的表達,后者再通過激活Hippo轉錄共激活因子YAP1, 從而產生耐藥,并且抑制YAP1可限制T-DM1治療誘導的ROR1過表達和腫瘤干細胞(CSC)自我更新[41]。Wnt5a結合ROR1/FZD復合體后激活RhoAα12/13, 并導致大腫瘤抑制因子1/2(Lats1/2)活性的抑制,從而引起YAP/TAZ(基于PDZ結合基序的轉錄共激活子)去磷酸化和核易位, YAP/TAZ轉錄水平的升高又可以上調ROR1的表達[42]。

4 ROR1與JNK信號傳導通路

NADANAKA S等[43]發現,硫酸軟骨素通過MDA-MB-231細胞中的ROR1/JNK軸促進癌癥侵襲性。在B細胞淋巴細胞白血病中,ROR1通過上調JNK信號誘導細胞侵襲性、轉移能力和治療抵抗[44]。

5 ROR1與NF-κB信號傳導通路

在豚鼠耳蝸毛細胞,ROR1與Wnt5a相互作用,通過誘導p65的磷酸化來激活NF-κB信號通路,且Wnt5a依賴性NF-κB信號通路可減少過表達ROR1的噪聲性聽力損失(NIHL)豚鼠的聽力受損[45]。FUKUDA T等[10]研究發現,在HEK293細胞中共表達Wnt5a與ROR1可誘導NF-κB的活化,并增強CLL細胞在體外的存活率,然而該作用被抗ROR1抗血清所中和。

6 ROR1與ERK信號傳導通路

細胞外調節蛋白激酶(ERK)是胚胎發生,細胞分化,細胞增殖和細胞死亡調控的關鍵組成部分,ERK途徑起源于質膜中的活化受體,并通過Ras/Raf/MEK至ERK[46]。在MCL細胞中,ROR1與CD19結合形成ROR1/CD19復合物,并以B細胞抗原受體(BCR)信號通路獨立的方式激活MEK-ERK信號通路,從而促進細胞生長[26]。

7 ROR1與STAT3信號傳導途徑

信號傳導與轉錄激活因子3(STAT3)最早被發現為癌基因,參與調控細胞生長、分化、凋亡等生理途徑[47]。

IKEDA T等[48]研究發現,在腫瘤微環境中, Wnt5a-ROR2信號通路在骨髓間充質干細胞(MSC)中誘導CXCL16的表達, CXCL16以旁分泌的方式作用于人胃癌細胞(MKN45)激活CXCR6, 進而刺激STAT3信號通路,最終誘導MKN45細胞中ROR1的表達,產生促進腫瘤的增殖和遷移作用。在CLL細胞中,凝膠遷移實驗(EMSA)和染色質免疫沉淀技術(ChIP)研究[49]表明,激活的STAT3與ROR1啟動子結合,激活ROR1, 并誘導CLL細胞中ROR1蛋白的產生。研究[50]發現, Wnt5a-ROR1信號通過激活RhoA/Rac1 GTPases和上調STAT3來活化非規范Wnt信號,從而增強TCF3-PBX1細胞的存活和增殖[12]。研究發現白細胞介素6(IL-6)通過激活ROR1, 誘導STAT3磷酸化,并以時間和劑量依賴的方式上調ROR1蛋白水平。

8 靶向ROR1腫瘤免疫治療

8.1 應用于腫瘤免疫治療的單克隆抗體

單克隆抗體是人體細胞特異性識別、抵抗病原微生物入侵產生的物質,可直接阻斷配體結合,激活免疫系統消除腫瘤細胞,具有特異性強、靈敏度高、毒性低等優點。單克隆抗體主要應用于臨床診療,中國已研制出300多種用于腫瘤治療的單克隆抗體。目前,針對ROR1不同結構域(CRD結構域、Ig結構域、Kringle結構域)構建的抗ROR1單克隆抗體已經被開發出來,可產生明顯的抗體依賴性毒性或補體依賴性毒性,使腫瘤細胞凋亡加劇[51]。有研究利用小鼠抗ROR1單克隆抗體5F1-B10評估ROR1在膀胱癌細胞表面的表達,流式細胞術結果顯示5F1-B10單抗在人膀胱細胞系5637、EJ138中分別能識別86.1%和45.6%的ROR1分子。ROR1在非癌性人胎包皮成纖維細胞(HFFF)中表達量為5.49%。免疫細胞化學和免疫組織化學染色結果也證實了ROR1分別存在于膀胱癌細胞和組織表面。細胞凋亡實驗結果表明, 5F1-B10單抗可誘導5637和EJ138細胞株凋亡。該研究[52]認為ROR1可能是開發新型膀胱癌治療藥物的一個有希望的靶點。另外,有研究提供了抗ROR1單克隆抗體Zilovertamab在高級別漿液性卵巢癌、子宮內膜癌中的臨床前證據。單藥Zilovertamab在72 h內能顯著抑制高級別漿液性卵巢癌細胞和子宮內膜癌細胞的增殖, Ⅰ期臨床試驗中顯示出Zilovertamab血漿半衰期為32.4 d[53]。靶向ROR1的Cirmtuzumab人源化單克隆抗體也在臨床試驗中進行了評估,在cirmtuzumab治療CLL患者的Ⅰ期試驗中觀察到有益的效果,可抑制CLL患者腫瘤細胞ROR1信號傳導[54]。

8.2 應用于腫瘤免疫治療的基因工程抗體

基因工程抗體是指將編碼抗體的基因進行加工改造后轉染受體細胞表達所得的抗體,又稱為重組抗體。基于ROR1靶向單克隆抗體, ROR1靶向基因工程抗體也被開發出來,包括單鏈片段可變抗體(scFv)、Fab抗體片段、抗體藥物偶聯物(ADC)等。

scFv是由抗體重鏈可變區、輕鏈可變區在一段肽鏈的連接下構成的小分子,是具有抗體活性的最小功能結構單位,相對于單克隆抗體而言,scFv分子質量小,穿透力強,半衰期短,免疫原性低,在藥代動力學、藥效學方面具有潛在的治療優勢。AGHEBATI-MALEKI L等[55]利用噬菌體展示技術選擇了針對ROR1細胞外區域特定肽的scFvs, 結果表明,分離的scFvs對ROR1肽具有特異性反應。scFv對多發性骨髓瘤細胞和CLL細胞的生長有顯著抑制作用。此外,用特異性scFv處理24 h可誘導多發性骨髓瘤細胞和CLL細胞凋亡。該研究結果表明,使用肽特異性scFv靶向ROR1可能是一種有效的血液惡性腫瘤免疫治療策略。

Fab片段是由一條完整的輕鏈與重鏈的VH和CH1結構域(Fd段)組成,也叫做抗原結合片段,分子量約5×104。Fab類抗體片段具有分子質量小、免疫原性低、組織特異性強、可基因工程操作等特點,使Fab成為了醫藥研究領域的重要成員之一。嵌合Fab片段是由鼠源可變區和人源恒定區組成, YIN Z N等[56]研究開發了一種新型嵌合抗ROR1 Fab抗體(ROR1-cFab), 該研究通過三輪亞克隆親和篩選,將ROR1免疫滴度高的小鼠脾細胞與骨髓瘤細胞融合,構建ROR1-cfab陽性融合細胞原核表達載體,發現ROR1-cfab可以特異性結合ROR1蛋白和ROR1陽性卵巢癌A2780細胞,并抑制腫瘤細胞的增殖和遷移,誘導ROR1陽性A2780細胞凋亡,且呈劑量依賴性。該研究[56]認為ROR1-cfab是一種新型的抗ROR1抗體,是治療ROR1陽性卵巢癌的可能候選者之一。

ADC是將單克隆抗體和強效高毒性小分子毒物通過生物活性連接子偶聯而成的定點靶向癌細胞的強效抗癌藥物, ADC既能保證靶向性,又能改善細胞毒藥物的治療窗,被認為是未來疾病治療的重要手段。VLS-101是一種ADC, 用于治療表達ROR1(ROR1+)的癌癥,中國于2022年批準其用于治療難治性或復發性彌漫性大B細胞淋巴瘤。VLS-101包括UC-961(一種人源化免疫球蛋白G1單克隆抗體,可結合人ROR1的細胞外表位),一種馬酰亞胺丙基-纈氨酸-瓜氨酸-對氨基苯甲酸酯連接物,以及一種微管聚合抑制劑單甲基奧瑞他汀E (MMAE)。VLS-101與ROR1的結合導致MMAE的快速細胞內化和傳遞,從而誘導腫瘤細胞死亡。VAISITTI T等[57]研究了4例RS患者來源的異種移植模型,其具有不同水平的ROR1表達(11%、32%、85%和99%), VLS-101對表達ROR1最低的患者無效,但可完全緩解ROR1表達水平較高患者的腫瘤負擔。

9 小 結

綜上所述, ROR1是腫瘤相關信號傳導通路的重要成員,可以結合配體并激活下游的信號通路,對各種腫瘤細胞的增殖、生存、生長、遷移和轉移中發揮關鍵作用。雖然有研究揭示了ROR1在癌癥中的促腫瘤功能,但其在不同腫瘤中的調節機制和在腫瘤發生中的作用還不完全清楚。在各種臨床前模型中, ROR1結合小分子抑制ROR1可誘導腫瘤細胞顯著凋亡并抑制腫瘤細胞功能,充分了解ROR1的結構特征以及下游信號轉導等生物學特性,可優化在血液和非血液惡性腫瘤中的ROR1靶向癌癥治療方案。目前開發了許多靶向ROR1的抗體,可特異性識別腫瘤抗原,高效殺滅腫瘤細胞,但獲得上市批準的藥物不多,期待將來會有更多的靶向ROR1應用于腫瘤免疫治療。