清熱涼血方治療尋常型銀屑病血熱證的臨床療效觀察及對外周血miR-31 表達(dá)的影響

王錦慧 曹 毅 陶茂燦 馬麗俐 楊曉紅

銀屑病是一種以皮損部位表皮過度增殖和毛細(xì)血管過度增生為特征的紅斑鱗屑性皮膚病[1]，屬中醫(yī)學(xué)“白疕”范疇，歷代醫(yī)家多從血熱、血瘀、血虛論治，目前基本形成了“辨血為主、從血論治”的基本思路和經(jīng)典理論體系，以“理血”為治療總綱[2-3]。其中血熱證被認(rèn)為是本病的重要起始環(huán)節(jié)和疾病轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵期[4-6]。本研究擬通過觀察清熱涼血方治療尋常型銀屑病血熱證皮膚鏡下血管球擴(kuò)張直徑及外周血miR-31 表達(dá)的變化，探討清熱涼血類中藥治療銀屑病的可能作用機制。

1 臨床資料

1.1 一般資料 選取2021 年5 月至2022 年2 月就診于浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚科的尋常型銀屑病患者60 例。按照計算機產(chǎn)生的隨機號隨機分為治療組和對照組，各30 例。另外采集與入選樣本治療組患者性別、年齡匹配的健康人群血標(biāo)本，標(biāo)本來源于本院體檢中心健康人群。本項目經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查通過（倫理審批號：2021-KL-116-01）。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 西醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《中國臨床皮膚病學(xué)》[7]、《中國銀屑病診療指南（2018 版）》[8]中的診斷標(biāo)準(zhǔn)：符合尋常型銀屑病的臨床表現(xiàn)，包括點滴狀銀屑病和斑塊狀銀屑病。皮損為不同形態(tài)、境界清晰的紅色丘疹、斑丘疹或斑塊，覆以多層緊密附著鱗屑，可伴有薄膜現(xiàn)象、Auspitz 征、蠟滴現(xiàn)象、同形反應(yīng)及束狀發(fā)、頂針狀甲。

1.2.2 中醫(yī)診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照《中國銀屑病診療指南（2018 版）》[8]、《尋常型銀屑病（白疕）中醫(yī)藥循證臨床實踐指南（2013 版）》[3]中血熱證辨證標(biāo)準(zhǔn)。（1）主癥：多見于銀屑病進(jìn)行期，皮損發(fā)展較快，新出皮疹不斷擴(kuò)大、增多，皮損呈鮮紅色，血露現(xiàn)象明顯，鱗屑干燥而厚，瘙癢較甚；（2）次癥：心煩、口渴、小便色黃、大便干，舌質(zhì)紅絳，苔黃，脈弦滑或數(shù)。具備主癥及2 項以上的次癥即可判定為血熱證。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) （1）符合上述西醫(yī)尋常型銀屑病診斷標(biāo)準(zhǔn)及中醫(yī)血熱證辨證標(biāo)準(zhǔn)；（2）年齡18～80 周歲，病程超過6 個月以上；（3）近1 個月未使用系統(tǒng)或局部銀屑病藥物治療；（4）簽署知情同意書，自愿入選本次研究。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) （1）合并有嚴(yán)重的肝腎、心腦血管及造血系統(tǒng)疾病；（2）慢性嚴(yán)重感染、精神病、糖尿病、吸煙、酗酒者；（3）近1 個月內(nèi)有免疫抑制用藥史的患者；（4）備孕、妊娠或哺乳期婦女；（5）過敏體質(zhì)或?qū)χ委煼桨钢兴幬镞^敏的患者。

1.5 剔除標(biāo)準(zhǔn) （1）治療中途不遵醫(yī)囑用藥或自行使用其他藥物及觀察資料不全者；（2）治療依從性差，未能完成治療療程。

1.6 脫落標(biāo)準(zhǔn) （1）治療過程中出現(xiàn)影響觀察的其他系統(tǒng)疾病；（2）治療過程中合并或轉(zhuǎn)為膿皰型、紅皮病型等其他型患者。

2 方 法

2.1 治療方法 對照組：外用糠酸莫米松乳膏[拜耳醫(yī)藥上海有限公司，批號H19991418，規(guī)格：0.1%（5 g∶5 mg）]卡泊三醇軟膏（LEO Laboratories Limited，批號HJ20160069，規(guī)格：30 g∶1.5 mg）。治療組：外用藥同治療組，另予中藥清熱涼血方口服（中藥組成：水牛角、土茯苓各30 g，紫草、生地黃各20 g，大青葉15 g，丹皮、槐花、黃芩、制大黃、露蜂房、郁金各10 g）。所有中藥顆粒來自浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房，將上述劑量顆粒劑250 mL 沸水中，攪拌均勻后充分溶解，每日1 劑，早晚分服。女性患者在經(jīng)期前3 d 停服，避免性味寒涼中藥影響月經(jīng)。連續(xù)治療2 周為1 個療程，共4 個療程，2 周觀察隨訪1 次。

2.2 觀察指標(biāo)

2.2.1 臨床各項積分 （1）銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）評分[8]：將人體分為頭頸、上肢、軀干、下肢四部分，計算皮損面積分，各部分鱗屑（D）、紅斑（E）、和浸潤（I）的嚴(yán)重程度分，乘以各自系數(shù)，最后將四部分得分相加，即為PASI 總分，總分分值0～72 分。（2）瘙癢程度評分[8]：總分分值0～10 分，分為五個等級。（3）皮膚病生活質(zhì)量指數(shù)（DLQI）評分[8]：包括患者癥狀、心理活動、工作狀態(tài)、日常行為以及娛樂休閑五個方面，分值范圍0～30 分。（4）中醫(yī)證候評分[3，9]：中醫(yī)證候的分級量化評分，主癥包括皮疹色深紅、劇烈瘙癢2 項，次癥包括口干、心煩易怒、小便深黃、大便便秘，舌紅、苔黃厚，脈弦滑數(shù)6 項。各癥根據(jù)無、輕度、中度、重度分別計0、2、4、6 分，分值0～48 分，評分越高，血熱證越明顯。各項評分由本院兩位主治以上皮膚科醫(yī)師進(jìn)行，取兩者平均值。

2.2.2 皮膚鏡下血管球擴(kuò)張直徑 拍攝入組患者典型皮損的鏡下圖像（高倍、低倍）。打開Image-Pro Plus（Version 6.0，Media Cybernetics）軟件處理靶部位皮損圖像：在高倍圖像下，按照垂直、水平分割法，按照“井”字將視野均分為上下三等份，形成九宮格模式。任意選取四格，取每張等分圖像中最大的血管球，分點多次測量血管管腔擴(kuò)張直徑，分別測量選取的血管球長軸及短軸，取其長度平均值。

2.2.3 外周血miR-31 表達(dá)的檢測

2.2.3.1 主要試劑及儀器 QPCR 儀（杭州博日FQD-96A）、PCR 儀（郎基A300）、QPCR 酶[TSE202，2xT5 Fast qPCR Mix（SYBR Green I），擎科]、逆轉(zhuǎn)錄酶[Goldenstar RT6 cDNA Synthesis Mix（TSK314S），擎科]等。

2.2.3.2 總RNA 的提取、cDNA 的制備及PCR 擴(kuò)增外周血血清提取總RNA 參照擎科動物組織/細(xì)胞總RNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行，嚴(yán)格無酶操作，提完后測各組RNA 濃度后分裝，-80 ℃保存待用。miR-31 c DNA 嚴(yán)格按擎科逆轉(zhuǎn)錄試劑盒Goldenstar RT6 cDNA Synthesis Mix。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系包括：RNA template 5μL，gDNA remover 1 μL，10XgDNA remover Buffer 1 μL，RNase-free water up to 10 μ，42 ℃2 min，60 ℃ 5 min 后加入Rnasin 1 μL，Goldenstar RT6 cDNA Synthesis Mix 4 μL，RNase-free water up to 20 μL，總反應(yīng)體系20 μL，逆轉(zhuǎn)錄條件：25 ℃10 min，50 ℃30 min，85 ℃5 min。逆轉(zhuǎn)錄完成后立即放冰上冷卻。反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA 產(chǎn)物3 倍稀釋后作為qPCR 模板，以擎科2×T5 Fast qPCR Mix（SYBR Green I）進(jìn)行擴(kuò)增進(jìn)行相應(yīng)PCR 擴(kuò)增操作。Real-time PCR 在ABI 7900 HT 高通道熒光定量PCR 儀上進(jìn)行，每個樣本重復(fù)5 次。反應(yīng)條件：第1步：預(yù)變性95 ℃2 min；第2 步：PCR 反應(yīng)，95 ℃15 s，60 ℃15 s，72 ℃20 s 重復(fù)40 次；第3 步：熔解。采用2-ΔΔCt表達(dá)量法計算miR-31 的相對表達(dá)量。

2.3 療效判定[9]療效計算公式：（治療前評分-治療后評分）/治療前評分×100%。療效判定標(biāo)準(zhǔn)：痊愈：PASI 評分減少95%以上；顯效：PASI 評分減少60%～94%；有效：PASI 評分減少25%～59%；無效：PASI 評分減少＜25%。總有效率=（臨床痊愈率+顯效率）/該組總病例數(shù)×100%。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用IBM SPSS Statistics 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)管理和統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s） 表示，采用兩獨立樣本t 檢驗進(jìn)行兩組間比較，偏態(tài)分布的計量資料以中位數(shù)（下四分位數(shù)，上四分位數(shù)）[M（P25，P75）]表示，采用兩獨立樣本非參數(shù)檢驗進(jìn)行兩組間比較。計數(shù)資料以例（%）表示，采用χ2檢驗，等級資料采用秩和檢驗，相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)性檢驗，重復(fù)測量方差分析比較各指標(biāo)的縱向變化趨勢。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 兩組尋常型銀屑病患者一般資料比較 本次研究共納入患者60 例，部分患者因病情加重，合并使用生物制劑或其他免疫抑制劑治療及其他原因未能完成治療療程，剔除共6 例；最終完成研究患者54例。治療組男16 例、女12 例，年齡（46.29±15.95）歲，病程（8.39±7.64）個月；對照組男16 例、女10 例，年齡（45.62±15.83）歲，病程（8.23±5.30 個月）。兩組患者性別、年齡、病程比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），均具可比性。

3.2 兩組尋常型銀屑病患者臨床各項評分比較 兩組患者治療前臨床各項評分比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），治療后臨床各項評分均有一定程度降低（P＜0.05），且治療組患者治療后各項評分均低于對照組（P＜0.05）。見表1。

表1 兩組尋常型銀屑病患者臨床各項評分比較（分，±s）

表1 兩組尋常型銀屑病患者臨床各項評分比較（分，±s）

注：對照組予常規(guī)治療；治療組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上予中藥清熱涼血湯口服治療；PASI 為銀屑病皮損面積和嚴(yán)重程度指數(shù)；DLQI 為皮膚病生活質(zhì)量指數(shù)；與本組治療前比較，aP＜0.05；與對照組同期比較，bP＜0.05

組別對照組治療組t 值P 值例數(shù)26 28 PASI 評分瘙癢評分DLQI 評分中醫(yī)證候評分治療前9.81±4.04 10.04±4.28 0.201 0.841治療后6.30±3.47a 4.54±2.53ab-7.263＜0.001治療前4.04±1.51 4.25±1.46 0.524 0.602治療后2.96±1.54a 2.54±1.55ab-5.490＜0.001治療前9.15±2.62 9.32±3.20 0.457 0.650治療后6.58±3.09a 4.93±2.88ab-6.207＜0.001治療前20.77±3.84 20.21±4.97 0.210 0.835治療后15.15±4.81a 7.93±2.52ab-13.725＜0.001

3.3 兩組尋常型銀屑病患者皮膚鏡下血管球直徑比較及其與臨床評分相關(guān)性 對治療前、治療后4 周、治療后8 周兩組患者的皮膚鏡下血管球直徑進(jìn)行重復(fù)測量方差分析，皮膚鏡下血管球直徑的時間效應(yīng)、組間效應(yīng)、交互效應(yīng)均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），見表2。治療后PASI 評分相對指數(shù)與血管球直徑相對指數(shù)呈正相關(guān)性（r=0.851，P＜0.001）。治療后中醫(yī)證候評分相對指數(shù)與血管球直徑相對指數(shù)呈正相關(guān)性（r=0.420，P=0.002）。見圖1。

圖1 尋常型銀屑病患者血管球直徑相對指數(shù)與PASI 評分、中醫(yī)證候評分相對指數(shù)相關(guān)關(guān)系

表2 兩組尋常型銀屑病患者皮膚鏡下血管球直徑比較（μm，±s）

表2 兩組尋常型銀屑病患者皮膚鏡下血管球直徑比較（μm，±s）

注：對照組予常規(guī)治療；治療組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上予中藥清熱涼血湯口服治療

組別治療組對照組皮膚鏡下血管球直徑組間效應(yīng)交互效應(yīng)例數(shù)時間效應(yīng)26 28治療前81.29±11.50 80.88±14.80治療后4 周44.57±13.81 59.04±13.02治療后8 周33.32±17.14 49.96±19.64 F 值180.615 P 值＜0.001 F 值9.583 P 值0.003 F 值9.262 P 值0.001

3.4 外周血miR-31 表達(dá)水平比較 比較治療組患者治療前與健康對照人群血清miR-31 表達(dá)水平，健康對照組低于銀屑病治療組患者[（1.42±0.58）比（2.98±1.92），P＜0.05]。比較治療組患者治療前后血清miR-31-5p 表達(dá)水平，治療組患者治療后低于治療前[（1.26±1.04）比（2.98±1.92），P＜0.05]。

3.5 兩組尋常型銀屑病患者總體療效比較 治療組治療后總有效率82.14%（23/28），其中有效10 例（35.71%），顯效13 例（46.43%），無效5 例（17.86%）；對照組治療后總有效率53.85%（14/26），其中有效9例（34.62%），顯效5 例（19.23%），無效12 例（46.15%）。兩組整體療效比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Z=5.004，P=0.025）。

4 討 論

目前認(rèn)為炎癥反應(yīng)和血管增生是銀屑病的發(fā)病基礎(chǔ)[10-11]。血管增生被視為銀屑病的啟動因素，銀屑病的初始變化伴隨著促血管生成因子和抗血管生成因子的失平衡狀態(tài)以及真皮乳頭血清因子引起的血管擴(kuò)張[12]。微血管的異常增生是銀屑病的發(fā)生發(fā)展、持續(xù)、復(fù)發(fā)的一個重要環(huán)節(jié)，血管擴(kuò)張、增殖為過度增殖的角質(zhì)形成細(xì)胞提供營養(yǎng)，促進(jìn)炎癥細(xì)胞遷移，對銀屑病病情進(jìn)展至關(guān)重要[13-15]。

清熱涼血方以《備急千金要方》中犀角地黃湯化裁為基礎(chǔ)方藥，方中以水牛角、生地為君，清營分之血熱，解營分之熱毒，生地協(xié)水牛角涼血養(yǎng)陰，防清涼苦寒之藥傷陰化燥。丹皮涼血祛瘀生新，防止熱瘀互結(jié)，涼血而不散血，清中有養(yǎng)。再加甘咸性寒之紫草，咸可入血，寒則清熱，功善涼血活血解毒、透疹消斑。大黃、黃芩涼血兼顧清血分之血熱毒邪。槐花、郁金入肝經(jīng)，苦寒沉降，清肝經(jīng)之郁熱，泄血分之郁遏。方中大青葉、土茯苓增清熱解毒之功；本病屬頑癬固疾，在草木之品之上，再伍露蜂房搜風(fēng)通絡(luò)止癢。全方直切病機，圍繞血熱、從血論治，精巧配伍，共奏清熱解毒、涼血活血消斑之效，使熱清血寧、斑疹透消。基礎(chǔ)實驗證實，清熱涼血方通過多種生物學(xué)機制發(fā)揮效應(yīng)，可能通過抑制磷脂酰肌醇3 激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）、Janus 激酶/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄因子（JAKs/STATs）等信號通路，減少腫瘤壞死因子（TNFα）、γ 干擾素（IFN-γ）、白介素-1（IL-1）、白介素-6（IL-6）的分泌，抑制銀屑病角質(zhì)形成細(xì)胞過度增殖、表皮過度角化，從而影響銀屑病的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程[17-18]。

利用皮膚鏡在鏡下對銀屑病患者靶部位皮損的血管擴(kuò)張直徑進(jìn)行評價，可以做到評價指標(biāo)的進(jìn)一步客觀量化，運用皮膚鏡評價尋常型銀屑病臨床療效及微循環(huán)改變是一個新的切入點。本研究患者血管球直徑相對指數(shù)與PASI 評分相對指數(shù)呈高度相關(guān)，銀屑病靶部位皮損恢復(fù)程度與皮膚鏡下血管球直徑趨向正常水平呈正性線性相關(guān)。隨著清熱涼血方聯(lián)合糠酸莫米松乳膏、卡泊三醇軟膏的治療，皮損逐漸消退，血管球直徑逐漸回歸正常值，兩者變化呈高度一致。說明清熱涼血方可能通過改善銀屑病患者的局部血管擴(kuò)張和增生，進(jìn)一步對銀屑病皮損起治療作用。

miR-31 因其具有較為明顯的表達(dá)改變和生物學(xué)活性而受到關(guān)注，在銀屑病皮損和外周血中miR-31 表達(dá)明顯升高[19]。本研究結(jié)果顯示，外周血miR-31 相對表達(dá)量與銀屑病患者皮損嚴(yán)重程度的變化趨于一致，銀屑病患者紅斑變淡、浸潤減輕、鱗屑減少等癥狀的好轉(zhuǎn)，可能伴隨著外周血miR-31 表達(dá)量的降低。我們基于此推測外周血miR-31 與銀屑病皮損毛細(xì)血管增生擴(kuò)張有關(guān)，清熱涼血方治療血熱證銀屑病的機理之一可能是通過調(diào)控miRNA 基因的表達(dá)，抑制外周血miR-31 水平，使miR-31 基因的異常表達(dá)趨向正常，使受miR-31 調(diào)控的編碼蛋白的mRNA 表達(dá)趨于正常，從而糾正血熱證銀屑病患者的中醫(yī)證型，達(dá)到減少皮損部位新生血管生成而改善臨床癥狀的治療作用。