紅豆杉多糖對D-半乳糖致衰老小鼠腎臟抗氧化作用研究

張宇彤,李欣然,焦文軒,郝浚含,史 巖,2

(1.佳木斯大學公共衛生學院,黑龍江 佳木斯 154007; 2.黑龍江省痛風研究重點實驗室,黑龍江 佳木斯 154000)

衰老是機體無法抗拒的自然規律,是身體對客觀環境的生理及心理適應能力的進展性下降,逐漸走向死亡的現象[1-2]。個體衰老是自然因素、環境因素及病理因素共同作用的結果,其中病理因素是指慢性消耗性疾病(如惡性腫瘤、高血壓、糖尿病等),容易造成身體長期的營養不良,加速衰老進程[3]。D-半乳糖能引起機體的氧化應激反應及細胞DNA與細胞膜的氧化損傷,不利于細胞的正常生長及代謝,會加速衰老與凋亡進程[4-5]。紅豆杉的藥用價值很高,含有紫杉萜、黃酮類、多糖類、糖苷類、揮發油等多種有效成分,具有溫腎通經、利尿消腫、祛邪散結等功效,可治療腎病、高血壓、高脂血癥等慢性疾病[6],但在抗衰老方面的機制尚不明確。本研究分析了紅豆杉多糖對D-半乳糖致衰老小鼠腎臟組織及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

清潔級雄性昆明小鼠,60日齡,體重18～22 g。D-半乳糖、維生素E均來自 Biotopped公司。丙二醛試劑盒(MDA)、超氧化物歧化酶試劑盒(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶試劑盒(GSH-PX)、谷胱甘肽還原酶試劑盒(GR)、過氧化氫酶試劑盒(CAT)、組織蛋白測定試劑盒均來自南京建成生物研究所。

UV1810紫外可見分光光度計(上海佑科儀器儀表有限公司生產),HH-10恒溫水浴箱(常州市中貝儀器有限公司生產),Multiskan FC酶標儀[賽默飛世爾(上海)儀器有限公司生產]。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及給藥

雄性昆明小鼠(清潔級)60只,除陰性對照組,其他各組小鼠均通過頸部皮下注射D-半乳糖150 mg/(kg.d),共 8 周。衰老小鼠分為5組,即衰老模型組、陽性對照組及紅豆杉多糖高、中、低劑量組,另設陰性對照組。各組均有10只小鼠樣本。造模第 3周起,紅豆杉高、中、低劑量組分別灌服800 mg/(kg.bw)、400 mg/(kg.bw)、200 mg/(kg.bw)紅豆杉多糖溶液,陽性對照組灌胃200 mg/(kg.bw)維生素E水溶液,另兩組灌服200 mg/(kg.bw)生理鹽水。連續給藥6周。

1.2.2 抗氧化測定指標的測定

實驗完成后,用乙醚麻醉小鼠,檢測其腎臟組織蛋白含量、MDA、 SOD、GSH-PX、GR及CAT,按照試劑盒上的方法操作。

1.2.3 統計分析

2 結果

2.1 小鼠的一般情況觀察

陰性對照組小鼠生長狀況良好。衰老模型組小鼠表現毛色無光澤,精神萎靡,活動力差。陽性對照組及紅豆杉多糖高劑量組小鼠均表現出良好的精神狀態,活動能力良好,進食量良好。

2.2 紅豆杉多糖對衰老小鼠抗氧化作用

2.2.1 對衰老小鼠腎臟臟器指數的影響

腎臟各組別間的臟器指數差異有統計學意義。與陰性對照組相比,模型組及紅豆杉多糖低劑量組臟器指數差異有統計學意義(P<0.05),而陰性對照組與陽性對照組及紅豆杉多糖高、中劑量組臟器指數差異無統計學意義(P>0.05)。與模型組相比,5組的臟器指數差異有統計學意義,臟器指數均高于模型組,表示衰老模型成功。與低劑量組相比,陰性對照組、高劑量組、中劑量組臟器指數差異顯著,具有統計學意義(P<0.05)。高劑量組與陽性對照組相比,臟器指數之間有明顯差異(P<0.05),紅豆杉多糖高劑量組與中劑量組相比,臟器指數相近,即差異無統計學意義(P>0.05),高劑量組的臟器指數最高。詳見表1與圖1。

圖1 臟器指數Fig.1 Visceral index

2.2.2 對衰老小鼠腎臟組織過氧化氫酶(CAT)活力的影響

腎臟各組別間CAT活力差異有統計學意義。與陰性對照組相比,模型組與紅豆杉多糖中、低劑量組小鼠CAT活力水平有差異,具有統計學意義(P<0.05);與模型組做相比,5組試驗小鼠的CAT活力差異具有統計學意義(P<0.05),5組的CAT活力均高于模型組;與陽性對照組相比,模型組、紅豆杉多糖低劑量組CAT活力差異達到了顯著性水平(P<0.05),與紅豆杉多糖低劑量組相比,陰性對照組、模型組、陽性對照組、高劑量組CAT活力之間差異明顯(P<0.05);與紅豆杉多糖中劑量組相比,陰性對照組、模型組、高劑量組CAT活力差異有統計學意義(P<0.05)。中劑量組與低劑量組、陽性對照組CAT活力差異無統計學意義(P>0.05);陰性對照組與陽性對照組及紅豆杉多糖高劑量組CAT活力差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表1與圖2。

2.2.3 對衰老小鼠腎臟組織中丙二醛(MDA)含量的影響

腎臟各組別間的MDA含量差異有統計學意義。與陰性對照組相比,模型組與紅豆杉多糖中、低劑量組MDA含量差異有統計學意義(P<0.05);與模型組相比,5組的MDA含量差異有統計學意義,MDA含量均低于模型組;與陽性對照組相比,模型組、紅豆杉多糖低劑量組MDA含量差異有統計學意義(P<0.05);與低劑量組相比,5組的MDA含量差異有統計學意義(P<0.05)。紅豆杉多糖高劑量組與中劑量組MDA含量差異有統計學意義(P<0.05)。陰性對照組、陽性對照組及紅豆杉多糖高劑量組MDA含量差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表1與圖3。

圖3 MDA含量Fig.3 MDA content

2.2.4 對衰老小鼠腎臟組織中超氧化物歧化酶(SOD)活力的影響

腎臟各組別間的超氧化物歧化酶活力差異有統計學意義。與陰性對照組相比,模型組與紅豆杉多糖中、低劑量組SOD活力差異有統計學意義(P<0.05);與模型組相比,5組的SOD活力差異有統計學意義,SOD活力均高于模型組;與陽性對照組相比,紅豆杉多糖中、低劑量組SOD活力差異有統計學意義(P<0.05);與低劑量組相比,其他5組的SOD活力差異有統計學意義(P<0.05)。與中劑量組相比,陽性對照組、高劑量組SOD活力差異有統計學差異(P<0.05)。陰性對照組、陽性對照組、紅豆杉多糖高劑量組SOD活力差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表1與圖4。

圖4 SOD活力Fig.4 SOD vitality

2.2.5 對衰老小鼠腎臟組織中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活力的影響

腎臟各組別間的谷胱甘肽過氧化物酶活力差異有統計學意義。與陰性對照組相比,模型組、紅豆杉多糖高劑量組GSH-PX活力差異有統計學意義(P<0.05);與模型組相比,5組的GSH-PX活力差異有統計學意義,GSH-PX活力均高于模型組;與低劑量組相比,模型組、陽性對照組、紅豆杉多糖高劑量組、紅豆杉多糖中劑量組GSH-PX活力差異有統計學意義(P<0.05)。紅豆杉多糖高劑量組與陽性對照組相比,GSH-PX活力差異有統計學意義(P<0.05);紅豆杉多糖高劑量組與紅豆杉多糖中劑量組相比,GSH-PX活力差異有統計學意義(P<0.05)。陰性對照組、陽性對照組、紅豆杉多糖中、低劑量組GSH-PX活力差異無統計學意義(P>0.05)。詳見表1與圖5。

圖5 GSH-PX活力Fig.5 GSH-PX vitality

2.2.6 對衰老小鼠腎臟組織中谷胱甘肽還原酶(GR)活力的影響

腎臟各組別間的谷胱甘肽還原酶活力差異有統計學意義。與陰性對照組之間做比較,模型組與紅豆杉多糖中、低劑量組GR活力差異具有統計學意義(P<0.05);與模型組相比,5組的GR活力差異有統計學意義,GR活力均高于模型組;與低劑量組相比,其他5組的GR活力差異達到了顯著水平(P<0.05)。紅豆杉多糖中劑量組與陽性對照組、紅豆杉多糖高劑量組GR活力差異明顯(P<0.05)。陰性對照組、陽性對照組、紅豆杉多糖高劑量組GR活力體現出均衡性,即差異未見統計學意義(P>0.05)。詳見表1與圖6。

圖6 GR活力Fig.6 GR vitality

表1紅豆杉多糖對衰老小鼠腎臟組織中MDA、SOD、CAT、GSH-PX、GR、臟器指數的影響

Tab.1InfluenceofTaxuspolysaccharideonMDA,SOD,CAT,GSH-PX,GRandorganindexinkidneytissueofagingmice

3 討論

腎臟很易被氧化應激所傷,而自由基的增加會使機體出現明顯的氧化應激反應,糖尿病、高血脂癥等慢性消耗性疾病可能會引起氧化應激,還可能是環境因素造成自由基增加導致的。腎臟是機體受衰老影響最顯著的一個器官,是功能減退最為快速的器官之一[7]。LDF被認為是機體衰老的一個主要表征,與MDA、谷胱甘肽(GSH) 、SOD共同作為衰老標志物[8]。植物多糖有廣泛的生物活性,目前,紅豆杉多糖的研究主要集中在降血糖、抗腫瘤、免疫調節等方面,在抗衰老方面報道較少。很多研究選擇MDA、SOD、GSH-PX等作為氧化應激損傷分析的主要參考指標。SOD是體內的一種抗氧化金屬酶,能催化超氧陰離子自由基歧化生成氧與過氧化氫,維持機體氧化與抗氧的平衡狀態,減少細胞損傷問題。GSH-PX自身是一種過氧化物分解酶,能夠把有毒性的過氧化物還原成羥基化合物,減少過氧化物對細胞膜結構及功能的侵害,發揮良好的保護效用。MDA是具有代表性的硫代巴比妥酸反應物,是衡量脂質過氧化物水平的標志。CAT是組成抗氧化系統的一部分,是過氧化物酶體的一類標志酶,占所有過氧化物酶總量的40%左右,是催化過氧化氫(H2O2)分解的常用工具,抗氧化性較強,能減輕因機體氧化應激引起的功能或結構損傷程度。CAT能強化機體對羥基自由基及超氧陰離子的抵制能力,可顯著減少MDA含量[9-11]。

通過建立衰老模型檢測紅豆杉多糖對衰老小鼠腎臟的抗氧化功能,研究表明,與衰老模型組相比,陰性對照組、陽性對照組及紅豆杉多糖高、中、低劑量組的MDA含量、SOD、GSH-PX、GR、CAT的活力差異均具有統計學意義,5組的臟器指數差異明顯,具有統計學意義,5組臟器指數均高于模型組,SOD、GSH-PX、GR、CAT活力均有提高,MDA含量水平均呈現出走低態勢,說明成功建設了衰老模型。與低劑量組相比,陰性對照組、高劑量組、中劑量組臟器指數差異顯著,紅豆杉多糖高劑量組與陽性對照組相比,臟器指數差異有統計學意義,高劑量組的臟器指數為最高。結果表明,紅豆杉多糖可增加小鼠臟器指數,對衰老小鼠具有抗氧化作用,劑量越高抗氧化作用越明顯。與陰性對照組相比,模型組與紅豆杉多糖中、低劑量組的MDA含量、CAT、SOD、GR活力差異均具有統計學意義,與紅豆杉多糖低劑量組相比,陽性對照組、高劑量組的MDA含量、SOD、CAT、GR、GSH-PX活力差異均具有統計學意義。紅豆杉多糖中劑量組與高劑量組的MDA含量、CAT、SOD、GSH-PX、GR活力活力差異均具有統計學意義,紅豆杉多糖組抗氧化作用高劑量組優于中劑量組優于低劑量組。紅豆杉多糖高劑量組與陽性對照組相比,GSH-PX活力差異有統計學意義;陰性對照組、陽性藥對照組、紅豆杉多糖高劑量組的MDA含量、CAT、SOD、GR活力差異無統計學意義;陰性對照組與紅豆杉多糖高劑量組GSH-PX活力差異有統計學意義,其中紅豆杉多糖高劑量組GSH-PX活力高于陽性對照組。陽性對照組與紅豆杉多糖組對衰老小鼠腎臟均具有抗氧化作用,而高劑量的紅豆杉多糖抗氧化作用效果更為明顯,有進一步開發利用的價值。

4 結論

紅豆杉多糖可提高衰老小鼠腎臟組織中的SOD、GSH-PX、GR、CAT活力,降低MDA含量,發揮抗氧化作用,且高劑量紅豆杉多糖抗氧化作用優于維生素E,此實驗結果可為紅豆杉多糖對衰老小鼠腎臟抗氧化作用的應用提供理論依據。