G-四鏈體結構用于固相納米孔增敏

王葉盛 于春淼 李艷茹 李冰凌*

1（中國科學院長春應用化學研究所，電分析化學國家重點實驗室，長春 130022）

2（中國科學技術大學應用化學與工程學院，合肥 230026）

納米孔技術是一種具有廣闊前景的單分子技術，可對蛋白質、核酸及聚合物等多種分子進行高靈敏度、高通量以及免標記分析[1-11]。在直徑為納米級別的孔道兩端施加一定的電壓時，會產生穩定的電流，當尺寸與孔徑相近的單個待測分子穿過孔道時，會產生阻塞效應，進而產生一個瞬時的電流改變[12]。通過對阻塞時間、阻塞電流強度、阻塞頻率以及阻塞電流形狀等進行分析，有望得到待測物的長度、尺寸、濃度以及結構等方面的相關信息。納米孔通常分為由蛋白質構成的生物納米孔[13-16]與由無機或有機材料制成的固相納米孔[17-20]兩類。生物納米孔作為最新一代測序方法，已被廣泛應用于DNA 測序[2]，但其相對較小的孔徑（通常小于5 nm）限制了檢測對象的范圍。相比之下，固相納米孔具有更高的化學/機械穩定性和尺寸可控性，并可以在相對寬松的環境（pH、溫度和離子強度）下進行長時間穩定的信號讀出，但較差的分辨率與制備重現性限制了其應用，特別對于尺寸遠小于固相孔孔徑的分子（如短鏈核酸等）時，無法滿足檢測的要求。

在本研究組前期的工作中，通過向納米孔電解質中加入具有高介電常數的溶劑甲酰胺，使納米孔的低頻電噪聲降低了約3 個數量級，并首次使用無修飾的錐形玻璃裸孔對催化發夾自組裝反應（Catalytic hairpin assembly，CHA）進行了原位跟蹤[21]。基于該增敏策略，可使用固相納米孔檢測到低至59 nt 的DNA 發夾結構。但是，受孔徑因素的制約，在對100 bp 左右的CHA 單體產物進行表征時，仍可能存在事件（Event）捕獲量較低的缺陷[22]。同時，甲酰胺對于蛋白質和RNA 等具有一定的破壞性，這也在一定程度上限制了該策略檢測的靶標范圍。另外，通過對核酸分子線路的設計進行優化，已經能得到可控的單體[21]以及尺寸與聚合度可控的1～4 聚體[22]，但在單體表征方面，仍可能無法產生滿意的、可重復的放大效應，需開發相應的解決方案。

本課題組在前期工作中利用分裂模式G-四鏈體結構放大雜交鏈式反應（Hybridization chain reaction，HCR）納米孔信號[23]，基于此，本研究以CHA 單體為模型，加入一條新的富G 短鏈與其結合，在組裝體的尾端形成了分裂模式的G-四鏈體。此結構增加了組裝體的易位體積，可將組裝體的易位電流放大2～3 倍，并在未加入甲酰胺的條件下，對反應單體的易位事件進行了穩定捕捉。不同于之前工作中的分裂G-四鏈體形成模式，即在底物發夾5′端或3′端添加分裂模式的G-四鏈體序列[23]，本研究在原有序列的基礎上，將其中單一反應底物的3′端延長約10 nt，并基于單體結構設計了一條富G 短鏈與其結合。基于富G 短鏈與結合位點設計的可編輯性，本方法具有靈活性與普適性。同時，本方法無需加入甲酰胺，因此有望拓展檢測靶標范圍。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

DS-11 FX+分光光度計（美國DeNovix 公司）；FlexCycler2多功能PCR 儀（德國耶拿分析儀器股份公司）；Axon Axopatch 200B 膜片鉗放大器、Axon Digidata 1550B 數模轉換器（美國MD 公司）；SUTTER P-2000 激光微電極拉制器（美國Sutter Instrument 公司）。

甲酰胺、LiCl（Sigma-Aldrich（上海）貿易有限公司）。除非另有說明，本研究使用的試劑均為分析純。CHA 緩沖液（pH=8.0）:20 mmol/L Tris-HCl、140 mmol/L NaCl、2.5 mmol/L MgCl2。所有寡核苷酸序列均由上海生工有限公司合成，并在初次使用前使用PAGE 純化，其序列如表1 所示。所有寡核苷酸均溶解在1 × TE 緩沖液中（10 mmol/L Tris-HCL,l mmol/L EDTA,pH=7.5）中，于?20 ℃儲存。

表1 實驗中使用的DNA序列Table 1 Sequences of DNA primers used in the experiment

1.2 實驗方法

1.2.1 玻璃錐形納米孔的制備與表征

玻璃錐形納米孔由石英玻璃管（外徑1 mm，內徑0.7 mm，美國Sutter Instrument 公司）拉制而成，在使用前將玻璃管在現制的食人魚溶液（98% H2SO4/30% H2O2，3∶1，V/V）中浸泡約1.5 h，以除去其表面的有機雜質。使用去離子水將玻璃管沖洗干凈，置于丙酮中超聲20 min，置于丙酮中保存。在采集納米孔信號前，將玻璃管置于真空干燥箱中，于70 ℃下干燥20 min，使用P-2000 移液管拉制器拉制納米孔，備用。本研究中使用的所有納米孔均使用同一拉制參數：HEAT=760，FIL=4，VEL=31，DEL=120，PUL=170。

1.2.2 納米孔數據的采集與分析

所有納米孔數據的采集均在實驗室自行設計與搭建的納米孔測試平臺[21-23]上進行。在進行DNA 易位實驗前，樣品溶液被注入納米孔尖端外側的玻璃樣品池（cis端），向玻璃錐形納米孔（trans端）中注入與樣品池中溶液離子強度一致的電解質溶液，并排出孔中氣泡，確保電解質溶液完全注入納米孔孔尖。在樣品池和孔內腔中分別放置2 個氯化銀電極，用于施加電位。在采集納米孔數據時，在納米孔兩端施加600 mV 的恒電位，從而驅動樣品池中的DNA 樣品定向穿孔。離子電流由Axopatch 200B 電流放大器采集，使用5 kHz 的低通Bassel 濾波器，并使用Digidata 1550B 數字化儀以250 kHz 的采樣頻率進行數字化。使用Clampfit 11.2 軟件對電流信號進行處理，根據閾值收集易位數據，其中，最小電流幅度水平為20 pA，最小易位時間為0.02 ms。所有實驗均在室溫（25 ℃）下進行。

1.2.3 三通催化發夾自組裝反應

選擇三通催化發夾自組裝反應（3-way catalytic hairpin assembly reaction，3w-CHA reaction）為模板進行實驗。實驗開始前，將C1、H1、H2 和H3 的儲備液在CHA 緩沖液中稀釋至5 μmol/L，在95 ℃下孵育5 min，以0.1 ℃/s 的變溫速度降溫至25 ℃。在40 μL CHA 反應體系中，C1 的最終濃度為0.025 μmol/L，H1、H2 和H3 的最終濃度為0.25 μmol/L，并加入終濃度為40 mmol/L 的KCl 溶液。25 ℃下孵育反應3 h。反應結束后，取5 μL 反應產物與2 μL 上樣緩沖液混合，采用2.5%瓊脂糖凝膠進行電泳，每毫升瓊脂糖凝膠含有0.07 μL Gel Red 染料。電泳在1×TAE 緩沖液中進行，在120 V 電壓下運行35 min 后，在紫外燈下對核酸條帶進行觀察。另取20 μL 反應產物，與10 μL 甲酰胺（100%）和20 μL 10 mol/L LiCl 混合，制成樣品溶液，采用納米孔表征。

1.2.4 附加分裂模式G-四鏈體的催化發夾自組裝反應

在1.2.3 節的反應體系中，增加一條S 鏈，其濃度與加入體積均與H2 相同。在40 μL CHA 反應體系中，S 的最終濃度為0.25 μmol/L。在K+的對比實驗中，在反應開始2 h 后，向對應的反應體系中補充KCl溶液，使K+的終濃度為40 mmol/L，無K+的反應體系則補充等體積的CHA 緩沖液，并繼續反應1 h，使反應總時間為3 h。電泳與納米孔樣品的配制均與1.2.3 節相同。

1.2.5 附加完整G-四鏈體的催化發夾自組裝反應

在H2 的3′端加添加完整的G-四鏈體序列（GGGTGGGTGGGTGGGT，T30695），得到新的H2 發夾（H2-G）。與1.2.4 節的實驗相比，將H2 替換為等體積與濃度的H2-G，并移除加入的S 鏈。其余步驟與1.2.4節相同。

1.2.6 熒光共振能量轉移表征

在熒光共振能量轉移表征中，新加入F 和Q，并使用H3-FQ 替換H3。在反應開始前，將濃度相同的F 和Q 按體積比3∶4 混合，在95 ℃下孵育5 min，以0.1 ℃/s 的變溫速度降溫至25 ℃，備用，其它步驟與1.2.3～1.2.5 節對應的反應前準備步驟相同。在終體積為40 μL 的CHA 反應體系中，C1（若存在）的終濃度為0.01 μmol/L，H1、H2（H2-G）、H3-FQ 和S（若存在）的終濃度均為0.10 μmol/L，F 的終濃度為0.15 μmol/L，Q 的終濃度為0.20 μmol/L，并加入終濃度為2 μmol/L 的dT21，防止熒光吸附造成讀數損失。將反應體系混合均勻，立刻取17 μL 產物于Cytation-5 全自動微孔板檢測器（美國Bio Tek Instrument）中，在25℃條件下，每1.5 min 進行一次讀數。

1.2.7 原卟啉(Protoporphyrin IX,PPIX)熒光表征

使用PPIX 熒光驗證是否形成G-四鏈體結構。在反應開始2 h 后，向反應體系中加入終濃度為0.5 μmol/L 的PPIX 溶液，并繼續反應1 h。反應結束后，取17 μL 產物于全自動微孔板檢測器中，在25 ℃、410 nm 的激發波長下，記錄580～660 nm 的熒光發射光譜。

2 結果與討論

2.1 催化發夾自組裝反應的原理以及附加G-四鏈體的催化發夾自組裝反應的設計

本研究的基礎是產物為三叉（也稱三臂）結構的CHA 反應，簡稱3w-CHA 反應。該反應涉及3 個發夾底物H1、H2 與H3，彼此之間存在部分互補的序列，但受動力學勢阱的制約，相互之間的雜交反應被嚴重抑制。如圖1A 所示，當存在長度為24 nt 的引發劑C1 時，1*結構域與發夾底物H1 的1 結構域雜交，啟動一個基于立足點遷移的鏈置換反應，進而將發夾底物H1 的莖打開，釋放出3*結構域；基于同樣的原理，3*結構域與發夾底物H2 的3 結構域結合后，可將發夾底物H2 的莖打開，釋放出4 結構域；4 結構域與發夾底物H3 的4*結構域結合后，可將發夾底物H3 的莖打開，最終形成H1·H2·H3 結構，并將C1釋放回溶液中，繼續進行催化反應[24，25]。如圖1B 所示，在底物發夾H2 被打開后，S 鏈的5*與8*結構域可與H2 的5、8 結構域雜交，并在H2 與S 鏈連接端的外側保留a 與b 兩個結構域。當存在一定濃度的K+時，a 與b 兩個結構域可形成3∶9 分裂模式的G-四鏈體結構。如圖1C 所示，將3w-CHA 中的H2 替換為H2-G 后，通過CHA 反應，可得到反應產物H1·H2-G·H3。當存在一定濃度的K+時，其結構域c 可自身形成G-四鏈體結構。在下文中，將附加分裂模式G-四鏈體序列的催化發夾自組裝反應產物（3w-CHA with split G-quadruplex tail）簡稱為sG4-CHA，該反應簡稱為sG4-CHA 反應；對于附加完整G-四鏈體序列的催化發夾自組裝反應產物（3w-CHA with full G-quadruplex tail）稱為G4-CHA，該反應簡稱為G4-CHA 反應。將加入了C1 的反應體系作為反應組，未加入C1 的反應體系作為對照組。

圖1 3 種催化發夾自組裝（CHA）反應的原理示意圖：（A）3w-CHA 反應；（B）sG4-CHA 反應；（C）G4-CHA 反應Fig.1 Schematic diagram of three kinds of catalytic hairpin assembly(CHA)reactions: (A)3w-CHA reaction;(B)sG4-CHA reaction;(C)G4-CHA reaction

2.2 3w-CHA、G4-CHA以及sG4-CHA的電泳與熒光表征

首先采用凝膠電泳和熒光共振能量轉移兩種方式對2.1 節中的3 種CHA 反應進行了表征。由圖2A的電泳條帶可見，3w-CHA、G4-CHA 與sG4-CHA 在有無C1 加入時區分明顯，可以由此判斷C1 的確對反應具有驅動作用。熒光共振能量轉移的檢測方式如圖2B 所示，當未發生CHA 反應時，H3-FG 的結構域“7”被包埋在發夾的莖中；發生反應后，結構域“7”被釋放，在溶液中可與F-Q 形成的Reporter 雙鏈體（Reporter duplex）發生基于立足點遷移的鏈遷移反應，將標記有猝滅基團的探針Q 從雙鏈體上置換，并產生可被檢測到的熒光信號。分析圖2C 的熒光動力學曲線可知，對于3w-CHA、G4-CHA 與sG4-CHA反應，在K+不存在時，反應組均展現出遠快于對照組的熒光增強速度，進一步驗證了C1 對于CHA 反應的驅動（催化）作用。并且G4-CHA 與sG4-CHA 反應組的產物電泳條帶深度和熒光增強速度均與3w-CHA 非常相近，說明替換H2 或引入S 鏈后，并不會對CHA 反應產生負面影響。值得注意的是，在不含K+的反應體系下，G-四鏈體結構的形成趨勢較弱，因此，同時考察了K+對于G-四鏈體結構形成的影響。由圖2A 可見，K+加入與否，電泳條帶幾乎沒有區別，因此僅從電泳圖上無法判斷是否形成了G-四鏈體結構。為了驗證G4-CHA 與sG4-CHA 兩種反應是否能夠按照預期設計形成G-四鏈體結構，利用PPIX熒光法驗證G-四鏈體結構的形成，其原理圖如圖2D 所示，PPIX 在水溶液中通常聚集成低熒光背景的膠束，與G-四鏈體結合后，其熒光強度顯著增強。對比了K+存在與否時G4-CHA 與sG4-CHA 反應的反應組，結果如圖2E 所示。因為H2-G 自身具有完整的G-四鏈體序列，在較高濃度一價陽離子（Na+）存在下，也會誘導形成一部分G-四鏈體結構[26]，所以G4-CHA 的兩組PPIX 信號相差不大。sG4-CHA 的PPIX 信號較弱，加入K+后，信號較強，表明隨著K+的加入形成了分裂模式的G-四鏈體結構。K+存在時，sG4-CHA的PPIX 信號強度低于G4-CHA，這是由于分裂模式的結構變化導致的[27]。

圖2 3w-CHA、G4-CHA 以及sG4-CHA 的電泳與熒光表征：（A）3w-CHA、G4-CHA 以及sG4-CHA 的瓊脂糖凝膠電泳表征；（B）熒光動力學原理示意圖；（C）3w-CHA、G4-CHA 以及sG4-CHA 的熒光動力學表征；（D）原卟啉（PPIX）熒光原理示意圖；（E）G4-CHA 與sG4-CHA 的PPIX 熒光表征Fig.2 Electrophoretic and fluorescence characterization of 3w-CHA,G4-CHA and sG4-CHA;(A)Agarose gel electrophoresis characterization of 3w-CHA,G4-CHA and sG4-CHA;(B)Schematic diagram of fluorescence dynamics;(C)Fluorescence characterization of 3w-CHA,G4-CHA and sG4-CHA;(D)Schematic diagram of protoporphyin IX (PPIX) fluorescence;(E)PPIX fluorescence characterization of G4-CHA and sG4-CHA

2.3 3w-CHA、G4-CHA以及sG4-CHA的納米孔表征

利用固相納米孔對3w-CHA、G4-CHA 以及sG4-CHA 進行了表征。固相納米孔的裝置如圖3A 所示。對于3w-CHA，截取基線電流與部分原始電流，對300 s 的原始電流進行統計后，繪制穿孔電流與穿孔時間的散點圖（圖3B），反應組與對照組的事件量與分布相差較明顯；對相應的穿孔電流進行統計，繪制其絕對值的分布圖（圖3C），反應組的穿孔電流集中在?40 pA 附近，相比對照組的電流分布為5～10 pA，這也與本研究組此前的研究結果基本吻合[21-22]。

圖3 3w-CHA 的納米孔表征：（A）納米孔裝置的示意圖；（B）3w-CHA 對照組與反應組的原始電流以及穿孔電流與穿孔時間的散點統計圖；（C）3w-CHA 對照組與反應組的穿孔電流絕對值的分布圖。所有數據均由同一納米孔測得Fig.3 Nanopore characterization of 3w-CHA: (A)Schematic diagram of the nanopore set-up;(B)The current traces and the scatter statistics of the amplitude and duration time of 3w-CHA;(C)Distribution of absolute of amplitude of 3w-CHA.All the data are measured with the same nanopore

對于G4-CHA 及sG4-CHA，分別對不存在C1 與K+、僅存在C1、僅存在K+以及同時存在C1 與K+這4 種條件下的產物進行了納米孔表征。對于G4-CHA，分別截取相應的原始電流（圖4A），繪制了對應的散點圖（圖4B），不存在K+時，G4-CHA 的反應組與對照組的事件量相差明顯；統計對應的穿孔電流，繪制了絕對值的分布圖（圖4C），相較于對照組，反應組的穿孔電流有較大偏移，在–50～–100 pA 的范圍內存在較多事件。發生電流偏移的原因可能是H2-G 的G-四鏈體序列在Na+影響下形成了部分G-四鏈體結構，剛性的G-四鏈體會增加組裝體的相對體積，從而增加穿孔電流。K+存在時，反應組與對照組的事件量相差明顯，并且反應組存在明顯的電流偏移，在–50～–150 pA 范圍內存在較多事件。此時，事件數的差異與電流偏移均可歸結于G4-CHA 反應的進行程度不同。

圖4 G4-CHA 與sG4-CHA 的納米孔表征：（A）不同條件下G4-CHA 的部分原始電流;（B）不同條件下G4-CHA 的穿孔電流與穿孔時間的散點統計圖;（C）不同條件下G4-CHA 的穿孔電流絕對值的分布圖;（D）不同條件下sG4-CHA 的部分原始電流;（E）不同條件下sG4-CHA 的穿孔電流與穿孔時間的散點統計圖;（F）不同條件下sG4-CHA 的穿孔電流絕對值的分布圖。所有數據均由同一納米孔測得Fig.4 Nanopore characterization of G4-CHA and sG4-CHA: (A) Current traces of G4-CHA under different conditions;(B) Scatter statistics of amplitude and duration time of G4-CHA under different conditions;(C) The distribution of absolute of amplitude of G4-CHA under different conditions;(D) Current traces of sG4-CHA under different conditions;(E) Scatter statistics of amplitude and duration time of sG4-CHA under different conditions;(F)The distribution of absolute of amplitude of sG4-CHA under different conditions.All the data are measured with the same nanopore

對于sG4-CHA，分別截取相應的原始電流（圖4D），繪制了對應的散點圖（圖4E），不存在K+時，sG4-CHA 的反應組與對照組的事件量相差明顯，此時即可判斷反應是否發生；統計對應的穿孔電流，并繪制了絕對值的分布圖（圖4F），其穿孔電流集中在?50 pA 附近，相較于3w-CHA，sG4-CHA 的穿孔電流整體有增大的趨勢，這是由于結合了S 鏈的sG4-CHA 尺寸略有增加。存在K+時，sG4-CHA 的對照組與反應組相較于不存在K+時均有較大的電流偏移且事件數增加。事件數增加主要來自G-四鏈體帶來的結構放大效應，電流偏移則來自分裂模式形成的G-四鏈體。相較于背景組，反應組在–100～–150 pA 范圍內存在更多的穿孔事件，整體的電流分布也明顯偏移。兩者的分布圖差異較明顯，可以判斷反應是否發生。

綜上，與3w-CHA 反應相比，G4-CHA 反應與sG4-CHA 反應在K+的調控下，均能實現較大的信號增敏。即使在不加入K+時，G4-CHA 與sG4-CHA 的反應組與對照組的電流分布區分明顯。同時，對于不加入C1 的對照組，加入K+也能實現信號放大。相較于sG4-CHA，G4-CHA 在不加入K+時也具有一定的背景，而sG4-CHA 在不存在與存在K+時差距明顯。在底物發夾H2 未打開時，S 鏈與H2 只有6 個互補堿基，不足以使H2 與S 鏈穩定結合。發生CHA 反應后，或至少在H2 被H1 打開后，H2 與S 鏈存在12 個互補堿基，此時H2 與S 鏈才能較穩定地結合，因此sG4-CHA 對K+的調控能力更出色。同時，鑒于H2-G自身帶來的高PPIX 背景，使得根據G4-CHA 反應的PPIX 熒光無法判斷G-四鏈體結構是否在CHA 產物上形成，相較之下，由于存在一步S 鏈與單體產物的結合步驟，sG4-CHA 反應的PPIX 熒光大致能反映分裂模式G-四鏈體結構的形成數量。因此，從序列設計與多角度表征等方面考慮，選擇引入表征方式相對較多、背景較低、序列靈活性較高的分裂模式G-四鏈體結構作為增敏方法更合適。

2.4 sG4-CHA在水相中的納米孔表征

本研究已經驗證了3∶9 分裂模式G-四鏈體結構的信號放大作用。為了進一步探索此設計的增敏效果，移除了電解質與樣品中的降噪組分（甲酰胺），并將其替換為等體積的水，對K+存在條件下的sG4-CHA 進行了納米孔表征。分別截取相應的原始電流（圖5A），繪制對應的散點圖（圖5B），統計對應的穿孔電流分布，繪制其絕對值的分布圖（圖5C）。盡管原始電流波動較大，但仍能捕捉到sG4-CHA 的穿孔事件（電流變化幅度大于50 pA）。從事件分布較多的穿孔電流范圍（–50～–150 pA）來看，反應組在各個電流區間的事件數均多于對照組，且整體電流分布相較于對照組偏移約20 pA。反應組的事件數接近于對照組的3 倍，這也與原始電流基本相符。上述結果說明固相納米孔在水相中也能成功識別反應是否發生，即在無需加入降噪組分時，此增敏策略也能成功實現對sG4-CHA 的捕捉。

圖5 在水相中sG4-CHA 的納米孔表征：（A）sG4-CHA 的部分原始電流；（B）sG4-CHA 的穿孔電流與穿孔時間的散點統計圖；（C）sG4-CHA 穿孔電流絕對值的分布圖。所有數據均由同一納米孔測得Fig.5 Nanopore characterization of the products of sG4-CHA in water: (A)Current traces of sG4-CHA;(B)Scatter plots of sG4-CHA;(C)Columnar distribution of absolute of amplitude of sG4-CHA.All the data are measured with the same nanopore

3 結論

本研究提出了一種基于G-四鏈體結構的納米孔增敏策略，能增加固相納米孔對小尺寸核酸組裝體的識別與捕捉。3w-CHA 反應單體附加完整模式或分裂模式的G-四鏈體序列后，均可通過控制G-四鏈體結構的形成實現納米孔信號放大。相較于完整模式的G-四鏈體結構，分裂模式的G-四鏈體結構具有更低的背景與更高的序列設計靈活性。本方法僅需對3w-CHA 反應中單個底物略做修改，并加入一條經過設計的約20 nt 的短鏈，即可通過堿基互補配對在產物上附加分裂模式的G-四鏈體序列，通過控制G-四鏈體結構的形成，可將產物的穿孔電流增大約2～3 倍，借此實現對小分子組裝產物的高靈敏檢測。值得注意的是，在單體產物上附加分裂模式G-四鏈體序列后，固相納米孔能準確捕捉與判斷是否形成G-四鏈體，這證明固相納米孔具有分析納米結構的動態構象的能力，也表明此結構具有作為K+特異性響應的分子機器的潛力。在移除了具有較差生物相容性的降噪組分甲酰胺后，此增敏策略同樣能準確檢測小分子核酸組裝體，這有利于靶標范圍向RNA 等方向拓展。未來，通過對納米孔分析平臺裝置、納米孔孔徑等重要因素的優化，可能為更小的靶標檢測提供基礎，推動固相納米孔在核酸分子層面的表征的發展與應用。