大黃蒽醌對大鼠糖皮質(zhì)激素性股骨頭壞死的保護(hù)作用

朱覺新，黃連芳（廣東醫(yī)科大學(xué).廣東天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.廣東湛江海洋醫(yī)藥研究院，廣東湛江 524023）

隨著臨床上糖皮質(zhì)激素的廣泛應(yīng)用，激素性股骨頭壞死（SANFH）人發(fā)病率逐年上升，目前已超過了外傷所致的股骨頭壞死的發(fā)病率[1]。股骨頭內(nèi)微結(jié)構(gòu)的改變是SANFH 發(fā)病的一個(gè)必不可少的病理特征，也可作為SANFH 早期發(fā)展的一個(gè)很重要的指標(biāo)和依據(jù)[2]。大黃蒽醌來源于掌葉大黃，其生物活性與大黃原藥相同[3-5]。本實(shí)驗(yàn)采用大黃蒽醌給藥，觀察不同給藥周期大黃蒽醌對大鼠激素性股骨頭壞死大鼠的預(yù)防作用，為SANFH 動(dòng)物模型的建立及大黃蒽醌在激素性股骨頭防治提供依據(jù)。

1 對象和方法

1.1 研究對象

選擇2019 年12 月-2022 年1 月由廣東醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供的162 只SD 級雌性大鼠，體質(zhì)量（280.0±30.0）g，隨機(jī)分為正常組、模型組與實(shí)驗(yàn)組，每組54 只。其中實(shí)驗(yàn)組給予大黃蒽醌（由西安銳禾生物工程技術(shù)有限公司提供，純度為98%）+醋酸潑尼松，模型組給予等容生理鹽水+醋酸潑尼松，正常組給予等容生理鹽水作為對照。

1.2 給藥方式

實(shí)驗(yàn)組：上午灌胃大黃蒽醌（70 mg/kg），下午灌胃醋酸潑尼松（3.5 mg/kg），液體均按0.1 mL/100 g灌胃給藥。模型組：上午灌胃等容生理鹽水（0.3 mL），下午灌胃醋酸潑尼松（3.5 mg/kg），液體均按0.1 mL/100 g 灌胃給藥。正常組：上午灌胃等容生理鹽水（0.3 mL），下午無灌胃操作。每周稱體質(zhì)量1 次，并按體質(zhì)量變化調(diào)整給藥量，連續(xù)給藥13 周。

1.3 飼養(yǎng)條件

飼養(yǎng)室內(nèi)溫度保持24～28℃，濕度在50%～60%。分籠專室飼養(yǎng)，每籠兩只，自由攝食攝水，專人負(fù)責(zé)，每周稱體質(zhì)量1 次。

1.4 取材

在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，實(shí)驗(yàn)組大鼠先給予3%戊巴比妥鈉進(jìn)行全身麻醉后心臟抽血至盡處死，采集四肢骨，用生理鹽水紗布包裹后再覆錫紙包裹、標(biāo)記，置-20 ℃貯藏，備用。

1.5 CT顯影及重建

采用Viva Micro CT40（瑞士，SCANCO Medical AG 公司）對大鼠骨遠(yuǎn)端進(jìn)行掃描，掃描分辨率10 μm，能量值選擇70 kV，1200 HA，重建灰度閾值選擇447，Gauss Sigma 不變。小梁重建時(shí)灰度閾值在300 以下。

1.6 骨形態(tài)計(jì)量學(xué)分析

CT掃描后取同側(cè)股骨不脫鈣骨包埋，并經(jīng)Leica 2155 硬組織切片機(jī)分別切成5 μm和10 μm的骨片。薄片Goldner 染色后測量和觀察骨小梁結(jié)構(gòu)、破骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。厚片直接封片后經(jīng)熒光顯微鏡觀察熒光形成情況，骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)軟件測量骨代謝相關(guān)指標(biāo)：骨小梁骨密度（BMD）、骨體積（BV）、總體積（TV）、相對骨體積或骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV）、結(jié)構(gòu)模型指數(shù)（SMI）、骨小梁厚度（Tb.Th）、骨小梁分離度（Tb.Sp）、骨小梁數(shù)量（Tb.N）。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

應(yīng)用python 3.9.1+pycharm64 2021.2.2，加載scipy科學(xué)計(jì)算數(shù)據(jù)包，計(jì)量資料以表示，選用t檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Micro-CT三維數(shù)字模型重建圖

3 周時(shí)3 組大鼠的骨小梁結(jié)構(gòu)相似，見圖1。第13 周時(shí)，模型組的骨小梁結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，全骨結(jié)構(gòu)特性破壞，而實(shí)驗(yàn)組又接近于正常組，見圖2。

圖1 3 周時(shí)股骨頭骨小梁結(jié)構(gòu)Micro-CT三維數(shù)字模型重建圖

圖2 13 周時(shí)股骨頭骨小梁結(jié)構(gòu)Micro-CT三維數(shù)字模型重建圖

2.2 Tb.BMD、BV/TV、SMI、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp 各項(xiàng)指標(biāo)情況

與正常組比較，模型組與實(shí)驗(yàn)組第3、5、7、9、11周的Tb.BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N水平下降，SMI、Tb.Sp 升高，模型組更為顯著（P＜0.05 或0.01）。第13 周實(shí)驗(yàn)組的Tb.BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N 水平高于模型組（P＜0.01），SMI、Tb.Sp 水平低于模型組（P＜0.01），見表1。

表1 3 組各周期Tb.BMD、BV/TV、SMI、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp的比較 （,n=9）

表1 3 組各周期Tb.BMD、BV/TV、SMI、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp的比較 （,n=9）

與正常組比較：aP＜0.01；與模型組比較：bP＜0.01,cP＜0.05

3 討論

SANFH預(yù)后差、致殘率高，迄今發(fā)病機(jī)制尚未完全明確[6]。本實(shí)驗(yàn)通過建立激素性股骨頭壞死大鼠模型，通過大黃蒽醌干預(yù)SANFH進(jìn)展，發(fā)現(xiàn)第3 周時(shí)實(shí)驗(yàn)組大鼠的SMI 與正常組比較均P＜0.05 或0.01；從表1 可見，3 周時(shí)模型組的Tb.BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N 較正常組和實(shí)驗(yàn)組均明顯下降，SMI、Tb.Sp則較正常組和實(shí)驗(yàn)組明顯升高；第13 周時(shí)實(shí)驗(yàn)組的Tb.BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N 水平高于模型組（P＜0.01），SMI、Tb.Sp水平低于模型組（P＜0.01）。本研究結(jié)果表明造模成功，而且大黃蒽醌在實(shí)驗(yàn)初期即起到一定的干預(yù)作用。在實(shí)驗(yàn)周期的進(jìn)展中，第7～9周為激素性股骨頭壞死模型的平衡區(qū)，模型組和實(shí)驗(yàn)組的Tb.BMD、BV/TV、Tb.Th、Tb.N 均處于最低谷，而SMI、Tb.Sp則處于峰值，說明該模型在此周期前處于各項(xiàng)指標(biāo)快速下降狀態(tài)，到這個(gè)周期后各項(xiàng)指標(biāo)將會(huì)變得平穩(wěn)。第11～13 周則各項(xiàng)指標(biāo)稍微往好的方向發(fā)展，其中實(shí)驗(yàn)組恢復(fù)最快，13 周時(shí)實(shí)驗(yàn)組各指標(biāo)均恢復(fù)到正常水平，說明大黃蒽醌對激素性股骨頭壞死有顯著的預(yù)防治療作用。

在Micro-CT 三維數(shù)字模型重建圖可見第3 周時(shí)實(shí)驗(yàn)組和正常組基本一致，而模型組較差，13 周時(shí)實(shí)驗(yàn)組和正常組依舊效果接近，而模型組的骨小梁則破壞嚴(yán)重，表明大黃蒽醌對激素性股骨頭壞死有顯著的預(yù)防治療作用。

綜上，本研究通過大黃蒽醌干預(yù)激素性股骨頭壞死模型大鼠發(fā)現(xiàn)，該模型是可以重現(xiàn)激素性股骨頭壞死，在模型開始8 周時(shí)間內(nèi)骨小梁結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，全骨結(jié)構(gòu)特性破壞，大黃蒽醌對于糖皮質(zhì)激素性股骨頭壞死有顯著的預(yù)防治療作用。