烏蘇里貉源大腸桿菌分離鑒定與藥敏試驗

文│馬亮 （河北省秦皇島市撫寧區農業農村局）

近年來，隨著我國養殖業的迅速發展，我國狐貍、水貂、貉和長毛兔等毛皮動物主要分布于河北、山東、吉林、黑龍江等多個省份和地區，尤其是狐貍、水貂和貉等毛皮動物的養殖數量呈逐漸上升趨勢，許多地區已經進入規模化和集約化養殖模式。隨著我國狐貍、水貂和貉等毛皮動物的養殖數量和養殖密度日益增加，在毛皮動物養殖過程中的相關病毒性、細菌性疾病及寄生蟲病的報道也逐漸增加，經統計，毛皮動物養殖過程中細菌病發展與流行占較大比重。相關研究表明，大腸桿菌屬于革蘭氏陰性桿菌，該菌具有多種血清型，大腸桿菌的抗原結構復雜，主要包括K、O、H 3種不同的抗原結構，不同血清型之間的菌株無交叉保護，不同血清型可以感染不同的動物。大腸桿菌不僅可以引起多種宿主動物發病，還有一些致病菌株如大腸桿菌O157等可以引起人的感染，該菌對動物和人的危害較高，同時威脅多種動物和人的公共衛生安全。貉大腸桿菌病是由不同血清型大腸桿菌引起的一種細菌性傳染病，當貉感染大腸桿菌后，臨床癥狀以敗血癥、腸炎為主要，該病主要對幼貉危害嚴重，具有較高的感染率和死亡率，該病對貉的健康養殖造成嚴重危害。在貉的飼養過程中，隨著抗菌藥物及含抗菌藥物添加劑的濫用，會造成嚴重的耐藥性，給該病治療帶來一定難度。本試驗采集20份死亡貉的病料樣品并進行病原菌（大腸桿菌）鑒定，對其致病性及藥敏試驗進行檢測，以期為該地區貉大腸桿菌病的防控提供理論參考。

一、材料與方法

1.病料來源。于2023年采集河北省秦皇島市撫寧地區養殖場及散養戶中患病死亡的烏蘇里貉的肝、腎、肺及糞便等病料組織40份。

2.細菌分離與培養。對采集的肝、腎、肺及糞便等病料組織樣片進行編號（1～40），將樣品處理接種到增菌液中，37℃恒溫震蕩培養12～18小時后，取震蕩培養的培養物，無菌條件下分區劃線接種于伊紅美藍培養基上，37℃恒溫培養8～12小時后挑取典型的單個菌落進行革蘭氏染色、形態學觀察。

3.生化試驗鑒定。將大腸桿菌顯色鑒別培養基分離得到的菌株再挑取單個菌落接種于營養肉湯中，37℃恒溫純化培養12～18小時后調整菌液濃度為0.5個麥氏濁度，參照革蘭氏陰性菌試劑盒說明書，無菌條件接種于革蘭氏陰性菌試劑盒中，在37℃培養12～18小時進行生化鑒定，并根據細菌編碼表進行生化試驗結果判讀。

4.致病性試驗。將臨床中分離的菌株（大腸桿菌）接種于營養肉湯中培養至對數期進行菌落計數，用無菌的普通營養肉湯調整菌液濃度1×108CFU/毫升。將5只小鼠分為1組，每1株分離的菌株腹腔注射攻毒5只昆明系小鼠為1個攻毒組，每1只小鼠的攻毒劑量為0.25毫升（108CFU/毫升），對照組5只小鼠，每只小鼠注射等量的無菌營養肉湯。致病性試驗期間（7天）觀察每個小組的小鼠發病與死亡情況。

5.藥敏試驗。將分離菌株培養至對數期，調整臨床分離菌株的菌液濃度為108CFU/毫升，對每一株分離菌株進行藥敏試驗，其操作技術及判定標準參照美國臨床實驗室標準化協會（CLSI）2013年推薦的標準K-B紙片法進行。

二、結果

1.細菌分離培養。從采集患病死亡的烏蘇里貉的肝、腎、肺及糞便等40份病料組織中分離得到10株疑似大腸桿菌的菌株，通過分離菌株的培養特性（伊紅美藍培養基、大腸桿菌顯色培養基）及形態學觀察等進行鑒定，與《伯杰細菌鑒定手冊》報道的大腸桿菌的培養特性及形態學基本一致。

2.細菌生化試驗。從采集患病死亡的烏蘇里貉的肝、腎、肺及糞便等40份病料組織樣品中分離得到10株疑似大腸桿菌的分離菌株，通過革蘭氏陰性菌生化鑒定試劑盒鑒定，結果顯示，分離的10株菌株均鑒定為大腸桿菌。與《伯杰細菌鑒定手冊》報道的大腸桿菌的生化特性基本上一致，分離率為25%（10/40）。

3.致病性試驗。在致病性試驗期間，攻毒組小鼠在攻毒后2～7天出現了不同的臨床癥狀，如采食量減少、扎堆、腹瀉等，個別小鼠攻毒后未表現臨床癥狀且出現急性死亡。剖檢死亡小鼠可見嚴重腸道病變（腫大、出血及黏膜脫落等）。采集死亡小鼠的肝，并分離到大腸桿菌，對照組小鼠健康存活，經過統計分離的5株大腸桿菌均能引起小鼠發病與死亡，其死亡率在60%以上。說明臨床分離5株沙門菌為致病性大腸桿菌，并命名為E1、E2、E3、E4、E5。

4.藥敏試驗。采用K-B藥敏紙片法檢測5株致病性大腸桿菌分離菌株（E1～E5）的耐藥性。結果表明，臨床分離的5株致病性大腸桿菌（E1～E5）對頭孢噻呋、頭孢噻肟、安普霉素、恩諾沙星、環丙沙星、大觀霉素6種藥物高度敏感，對新霉素、氟苯尼考、多黏菌素3種藥物中度敏感，對其他7種藥物耐藥性嚴重。說明從患病貉病料組織中分離的5株致病性大腸桿菌（E1～E5）對臨床常用藥物具有不同的敏感性。

表1 5株大腸桿菌的藥敏試驗結果

三、討論

大腸桿菌病是貉養殖過程中常見的細菌性傳染病之一，該病是由血清型大腸桿菌引起的不同日齡的貉（幼貉、母貉）發病，尤其是幼貉發病率和死亡率均較高，主要引起母貉流產等，該病對幼貉、母貉的危害較大。大腸桿菌為臨床中常見的人畜共患病原菌之一，該菌在我國養殖場中廣泛分布與流行，應引起注意，做好綜合防控措施，減少沙門菌病的發生與流行。近幾年，隨著貉養殖量的增加，貉的相關疾病，尤其是細菌性疾病比較復雜，常呈現混合感染，當發生疾病時要通過實驗室進行診斷，才能快速確定病原，進行有效防控。近幾年，在我國不同地區均報道大腸桿菌感染引起貉死亡的病例，并呈現逐年增高趨勢。大腸桿菌成為貉養殖過程中常見疾病，因此在養殖過程中應注意該病的綜合防控。本研究從40份病料樣品中分離到10株大腸桿菌，其分離率為225%（9/40），其中分離的5株大腸桿菌均能引起小白鼠死亡，均為致病性大腸桿菌。說明引起該地區養殖場及散養戶烏蘇里貉死亡的病原菌為大腸桿菌。因此，規模化養殖場及散養戶應注意貉大腸桿菌病的綜合防控。研究表明，分離的5株致病性大腸桿菌（E1～E5）均對頭孢噻呋、頭孢噻肟、安普霉素等6種藥物高度敏感，對新霉素、氟苯尼考、多黏菌素3種藥物中度敏感，對其他7種藥物耐藥性嚴重。因此，在臨床防治貉大腸桿菌病時，應合理使用抗菌藥物，減少其耐藥性，提高治療效果，同時注意貉養殖過程中的環境消毒。