滲透樹脂對早期釉質齲的防治效果觀察

劉 欣,黃銀珠,金成日

齲病是在以細菌為主的多種因素影響下,牙體硬組織發生慢性進行性破壞的一種疾病。藥物治療是臨床上常用的預防齲病和治療早期釉質齲的方法,通過使用某些藥物(氟、礦化液、中藥及木糖醇等)使牙釉質再礦化,阻止齲病進展。各種藥物治療中,以局部涂氟治療最為常見。臨床上有多種氟化物制劑可供使用,如氟化物溶液、氟凝膠、含氟牙膏等[1-2]。2009年,DMG公司開發了一種新型滲透材料即Icon滲透樹脂應用于治療早期齲。它是一種低黏度樹脂[3],主要由雙酚A甲基丙烯酸縮水甘油酯(bisphenol a methacrylate glycidol,Bis-GMA)、二甲基丙烯酸三甘醇酯(triethylene glycol dimethyl acrylate,TEGDMA)、光引發劑和溶劑乙醇組成。研究認為Icon滲透樹脂的粘接性能、抗磨耗性能、硬度及粗糙度、美觀性能等方面均具有優勢,因此Icon滲透樹脂的治療效果受到肯定[3-10]。

本實驗對離體牙采用酸凝膠法形成人工齲,運用原子吸收分光光度計檢測經滲透樹脂處理后牙釉質在酸性環境下溶出的Ca2+含量,以氟保護漆和氟化鈉溶液作對照,評價滲透樹脂對人牙釉質抗酸性的影響。采用掃描電鏡觀察釉質表面及縱剖面的超微結構,評價滲透樹脂封閉釉質脫礦區的情況,從而深入探討滲透樹脂的抗酸性能及防齲效果,為選擇安全有效、簡單易行的早期釉質齲治療方法提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 一般材料

收集北京航天總醫院口腔門診2021—2022年因正畸拔除的上下前磨牙110顆,患者10～25歲。10倍體視顯微鏡下觀察并選擇牙冠完整、無齲壞、無缺損、無變色、無裂紋的牙齒。排除標準:有充填物或齲壞的牙齒、釉質發育不全、氟斑牙、四環素牙、死髓牙。去除牙周膜,用超聲潔治器去除牙齒表面菌斑和牙石,充分清潔后放于含有1%麝香草酚液的生理鹽水中冷藏(4 ℃)保存,6個月內使用。

1.2 主要儀器與試劑

體視顯微鏡(Alpha,英國);Isomet 4000硬組織切片機(Buehler,美國);S-4800掃描電鏡(HITACHI,日本);Ⅱ6300原子分光光度計(島津,日本);37 ℃生化培養箱(上海福瑪實驗設備有限公司,中國);pH離子計(ORION868,美國);3.0 mm打孔器(Harris Micro-punch,美國);HZS-H水浴振蕩器(東方化玻科技有限公司,中國);B3510E-DTH超聲波洗滌器(Branson,美國);YM-ZA金相試驗預磨機(上海金相機械設備有限公司,中國);BSA124S電子天平(賽多利,德國);多功能圖像分析儀、BH-2顯微鏡(奧林巴斯,日本)。

抗酸指甲油(大寶公司,中國);Icon滲透樹脂(DMG公司,德國);15%鹽酸膠狀酸蝕劑(DMG公司,德國);0.5%氟保護漆(萊可麗專業產品公司,美國)。制備人工唾液(1 000 mL蒸餾水中加入KH2PO40.330 g,Na2HPO40.340 g,KCl 1.270 g,NH4Cl 0.160 g,CaCl2·2H2O 0.170 g,NaCl 0.580 g,NaSCN 0.160 g,尿素 0.200 g,葡萄糖 0.030 g,維生素C 0.002 g,黏蛋白2.700 g,以上各成分混合溶解后,pH調至6.8,高壓消毒滅菌后備用);制備人工齲液(0.1 mol/L 乳酸100 mL加入高黏度羥乙基纖維素3 g,調勻,用NaOH調節pH=4.5,37 ℃恒溫下靜置,待氣泡完全消失后使用);0.02%氟化鈉溶液、酸性溶液(50 mmol/L HAC,2.2 mmol/L Na2HPO4,以去離子水配成1 L,用NaOH調節pH=5.0)、0.5 mol/L硝酸溶液、20 g/L氧化鑭溶液(稱取純度>99.99%的氧化鑭23.45 g,先用少量水濕潤再加75 mL鹽酸于1 000 mL容量瓶中,加去離子水稀釋至刻度)。

1.3 方法

1.3.1 人工釉質齲的建立

用打孔器在膠帶上打出直徑為3 mm的圓孔,粘接于經過處理的離體牙頰側釉質表面處,揭去膠帶,形成直徑為3 mm的圓形開窗區,剩余牙體用抗酸指甲油覆蓋兩次。在距牙根尖1 mm處打孔,穿入鐵絲,將離體牙懸吊在含有人工齲液的燒杯內(一般1個樣本需要20～25 mL的人工齲液),保證離體牙牙冠完全浸入人工齲液中,牙根部位暴露在空氣中,樣本連續浸泡4 d,每天更換一次人工齲液,保證37 ℃恒溫。4 d后取出標本,清水沖洗待用。

1.3.2 實驗分組

隨機取樣本10個,將牙根部包埋于自凝樹脂材料中,用硬組織切片機垂直開窗區表面。沿牙齒縱剖面由牙冠向根方進行連續切片,在玻璃磨板上磨至250 μm厚,在40倍光鏡和掃描電鏡下觀察脫礦情況。每個樣本選擇3個切片,每個切片隨機選擇3個位置進行測量,取其平均值作為該樣本的平均脫礦深度。余下100顆樣本隨機分成5組,每組20顆。滲透樹脂組為A組,氟保護漆組為B組,氟化鈉組為C組,去離子水組為D組,涂布指甲油組為E組。

滲透樹脂組(A組):開窗區涂布滲透樹脂,按照產品說明書操作,首先在開窗區采用15%HCl酸蝕120 s,沖洗30 s,99%乙醇干燥脫水30 s,用小毛刷涂布Icon滲透樹脂3 min,輕微吹干10 s,光照40 s,再涂布滲透樹脂1 min,同樣光照40 s。

氟保護漆組(B組):開窗區吹干,涂布氟保護漆(含有5%的NaF,其中氟離子濃度為2.26%,以松香作為基質)2次,自然干燥。

氟化鈉組(C組):樣本浸入0.02%氟化鈉溶液中24 h,然后取出,自然干燥。

陽性對照組(D組):開窗區涂布去離子水,自然干燥。

陰性對照組(E組):開窗區涂布抗酸指甲油2次,自然干燥。

5組樣本均保存在人工唾液中24 h,37 ℃恒溫。

1.4 觀察指標

1.4.1 Ca2+溶出量的測定

將樣本分別懸吊放入10 mL帶蓋的一次性塑料離心管內,每個離心管中加入酸性溶液5 mL(保證樣本牙冠全部浸入),蓋緊,放置于水浴恒溫振蕩器內。37 ℃恒溫回旋振蕩24 h后取出樣本,離心管內的溶液留作進行Ca2+溶出量的測量。Ca2+溶出量采用原子分光光度計測量。

1.4.2 掃描電鏡觀察

使用硬組織切片機垂直開窗區表面,沿牙齒長軸方向切開,一部分做連續切片,玻璃磨板磨至250 μm厚,超聲洗滌后備用,開窗區的縱剖面進行掃描顯微鏡觀察。另一部分超聲洗滌備用,開窗區的表面進行掃描電鏡觀察。

1.5 統計學分析

使用SPSS 17.0統計軟件包,5組樣本的Ca2+溶出量采用單因素方差分析方法(one-way ANOVA)進行統計學檢驗,Tukey HSD法進行各組間比較,分析3種材料對釉質表面抗酸性能影響的差異。

2 結 果

2.1 人工釉質齲的建立

脫礦后樣本的切片在40倍體視顯微鏡下觀察,釉質層形成以表層下脫礦為主要特征的病理改變,可見較為完整的釉質表層及下方的病損體部。并且病損范圍均在釉質淺層,未達到釉牙本質界(圖1)。測量樣本的脫礦深度為(0.551±0.658)mm(n=10)。

A:正常牙釉質;B:脫礦牙釉質;黑箭頭:脫礦的釉質表層;白箭頭:釉質脫礦范圍

在掃描電子顯微鏡下觀察,正常釉質表面光滑平整(圖2A)。人工齲釉質表面可見孔隙增大,呈現帶有很多凹坑狀的、不規則的外觀。釉柱晶體溶解,結構破壞(圖2B)。人工齲剖面見釉質表層較完整,表層下方釉柱間隙增大,可見與釉質生長線一致的短裂隙狀改變,向內延伸。表層下方脫礦區脫礦深度較一致,病損范圍局限在釉質層(圖3)。

A:正常釉質;B:釉質齲表面

a:牙釉質;b:牙釉質脫礦區;白箭頭:脫礦的釉質表層

2.2 Ca2+溶出量的測定結果

陰性對照組、滲透樹脂組、氟保護漆組、氟化鈉組、陽性對照組Ca2+溶出量分別為(0.109±0.535)、(6.432±1.867)、(31.208±7.784)、(41.176±3.512)、(77.616±10.789)μg/mL。

經單因素方差分析(one-way ANOVA),滲透樹脂組、氟保護漆組及氟化鈉組分別與陽性對照組、陰性對照組之間差異有統計學意義(P<0.05),其中陽性對照組的Ca2+溶出量明顯高于滲透樹脂組、氟保護漆組及氟化鈉組(P<0.01),氟保護漆組及氟化鈉組的 Ca2+溶出量明顯高于陰性對照組(P<0.01),滲透樹脂組的Ca2+溶出量略高于陰性對照組(P<0.05)。經one-way ANOVA中的Tukey HSD檢驗,3個實驗組之間兩兩比較,差異有統計學意義(P<0.01)(表1)。

表1 實驗組和對照組牙釉質Ca2+溶出量(24 h)的比較

2.3 實驗后的樣本SEM觀察結果

滲透樹脂組(A組)可見釉質表面有完整、相對平滑的材料覆蓋,呈條紋狀,在高倍鏡下未見到明顯的孔隙結構(圖4A、B)。觀察開窗區縱剖面,可見釉質表層覆蓋一薄層樹脂材料,較致密。滲透樹脂能較好地占據表層下釉質由于脫礦所產生的孔隙,且材料相對致密,呈密集的網篩狀。材料沿著牙釉質的釉柱間隙滲透,病損體部的大部分被材料完全滲入,僅有少部分脫礦的釉質區域未見滲入的材料。齲損部位從底部到上方形成了一個不規則的樹脂帶(圖4C、D)。氟保護漆組(B組)可見牙釉質表面完整,覆蓋一層漆膜,似碎玻璃狀晶體結構,局部可見凹陷痕跡、裂紋、孔隙,但裂紋和孔隙較小(圖4E、F)。觀察開窗區縱剖面,可見釉質表層被一薄層材料覆蓋,材料呈絲網狀,不致密,釉質內可見到大面積的白色團塊狀沉積物,形態不規則,但仍有部分脫礦區域未見到白色沉積物(圖4G、H)。氟化鈉組(C組)釉質表面孔隙清晰,孔隙直徑明顯大于氟保護漆組,釉質表面有成片的小塊狀的白色沉積物覆蓋,數量較少,釉質表面結構尚完整(圖4I、J)。開窗區縱剖面見釉質表層覆蓋物不完整,釉質內可見少量的不規則白色沉積物充填釉質孔隙,正常釉柱結構消失,結構紊亂(圖4K、L)。陽性對照組(D組)表現為釉質表面結構的破壞,高倍鏡下釉質表面布滿了酸蝕脫礦的孔隙(圖5)。

紅箭頭示釉質表面暴露的牙體組織;白箭頭示白色沉積物斑外觀。Icon滲透樹脂滲入后的折光率接近正常牙釉質的折光率,使美觀得以改善[15]。Enan等[13]提出正畸患者在戴上托槽后很可能會出現白堊病變,可以在矯正前或矯正后使用滲透樹脂,通過再礦化脫礦的牙釉質來達到更滿意的矯正效果。國內學者也有類似報道,通過比較滲透樹脂與氟保護漆治療正畸后產生的齲白斑,發現滲透樹脂能明顯改善白堊斑的美觀問題[16-17]。

圖5 陽性對照組釉質表面SEM圖像

3 討 論

本實驗采用構建人工齲模型來模擬自然狀態下形成的齲。酸凝膠法模擬口腔的酸性環境,較其他方法操作簡單、重復性強、容易控制,能獲得與自然釉質齲損相似的病變結構[11],單純研究齲病的進展和礦物鹽離子的變化常采用此方法。本實驗采用酸凝膠法連續脫礦4 d制備人工釉質齲,樣本經過酸凝膠脫礦液處理后,肉眼可見呈均勻的白堊色改變的脫礦區。光鏡及掃描電鏡觀察,脫礦的牙釉質表層完整,且表層下方脫礦區脫礦深度較一致,脫礦深度為(0.551±0.658)mm,病損局限在牙釉質層。

早期齲的發生是牙釉質脫礦與再礦化交替進行的動態過程,酸對釉質的損害首先發生在釉柱鞘,然后是釉柱芯和釉柱間質,釉質結構破壞,呈多孔性,從表及里有許多微小通道,這些微小通道相互連通構成網絡系統,使脫礦過程中溶解的礦物質如鈣、磷離子等向外擴散,通過檢測從牙齒中脫出的Ca2+濃度,可以反映釉質脫礦的程度。原子吸收分光光度計是一種檢測溶液中微量原子濃度的常用標準儀器,它可以準確地定量檢測牙釉質中脫出的Ca2+濃度。本實驗通過測量釉質中Ca2+溶出量來衡量滲透樹脂材料提高釉質抗酸性能的程度。實驗結果顯示滲透樹脂組Ca2+溶出量為(6.432±1.867)μg/mL,明顯低于陽性對照組(77.616±10.789)μg/mL、氟保護漆組(31.208±7.784)μg/mL及氟化鈉組(41.176±3.512)μg/mL。說明滲透樹脂應用后,減少了釉質表面在酸性環境下的Ca2+溶出量,可以提高釉質表面的抗酸能力,且優于氟保護漆及氟化鈉。滲透樹脂組檢出的Ca2+溶出量高于陰性對照組(0.109±0.535)μg/mL,說明滲透樹脂組仍有一定的Ca2+溶出,即滲透樹脂材料不能完全抑制釉質的進一步脫礦,這與Paris等[12]報道的研究結果相同。Enan等[13]用可樂和紅牛制造酸性環境,經實驗得出在酸性環境中滲透樹脂對脫礦的牙釉質有保護作用。梁向陽等[14]同樣在碳酸飲料中做實驗發現滲透樹脂能夠有效地阻斷碳酸飲料所致牙釉質脫礦的發展。本實驗中,樣本一直處于酸性環境中,滲透樹脂雖然不能完全抑制釉質脫礦,但是與氟保護漆、氟化鈉相比,滲透樹脂在提高釉質表面的抗酸性能方面,已經具有明顯的優勢。滲透樹脂提高釉質表面的抗酸性能效果還需要長期觀察和研究。

Torres等[10]進行了滲透樹脂的顏色穩定性實驗,證明了滲透樹脂可以較好地覆蓋脫礦釉質區的白堊色,使其接近正常釉質色,恢復美觀。其中釉質的折光率取決于晶體的空間大小,在早期齲時隨著晶體開始溶解,產生了脫水,水又被替換成空氣,折光率從大變小, 因此隨著對光的散射不同出現了白滲透樹脂是一種采用滲透原理治療早期齲的新型材料。滲透樹脂治療早期齲的原理是封閉釉質由于脫礦造成的孔隙,從而阻止進一步脫礦[18]。Meyer-Lueckel等[3]使用橫斷顯微放射照相術(transverse microradiography,TMR)和激光掃描共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscope,CLSM)檢測發現,Icon滲透樹脂在自然齲釉質層內的滲透深度大約為171 μm,經過光照固化,滲透樹脂機械性地固化在部分溶解的羥基磷灰石上,形成樹脂-多孔羥基磷灰石復合體,填滿釉柱間隙,堵塞釉質表面孔隙,封閉了齲損進展通道,使致齲酸不能滲入釉質深層,阻止病變發展。Perdig?o[19]發現白堊區域釉質表面晶體被滲透樹脂聚合物包裹,而實驗得出樹脂聚合物與釉質的結合相比于釉質更能抵抗酸的侵蝕,從而阻止進一步脫礦。梁向陽等[14]通過激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察,發現經滲透樹脂處理的離體牙釉質表面較光滑平坦,無明顯凹陷,熒光染料沉積較少,僅在釉質最表面看到較微弱的熒光圖像。本實驗SEM觀察結果顯示,滲透樹脂組可見釉質表面完整、相對平滑,條紋狀,未見到明顯的孔隙結構。縱剖面觀察可見釉質表層覆蓋一薄層樹脂材料,較致密均勻。少部分脫礦的釉質區域未見滲入的材料。釉質表層一薄層未滲入的樹脂材料構成了一個樹脂膜,雖然能較好地封閉釉質表面孔隙,提高了釉質的抗酸性能,但也說明了滲透樹脂的滲透性能有限。滲透樹脂具有聚合收縮性能[20],樹脂材料在聚合時會伴隨一定的體積收縮,材料內部會產生內聚力,從而引發材料的微裂紋、微隙[21],酸性物質易通過這些微裂紋或者微隙進入釉質,使釉質繼續脫礦。雖然本實驗SEM觀察顯示釉質表面未見到明顯裂紋及孔隙,但滲透樹脂提高釉質抗酸性能的長期效果還有待于研究。

本實驗的結果提示滲透樹脂能提高釉質表面的抗酸性能,阻止齲進展,明顯優于氟保護漆及氟化鈉,在早期釉質平滑面齲防治方面具有優勢。由于此材料臨床應用時間較短,長期的臨床效果還有待進一步研究;滲透樹脂具有較強的滲透性,材料能在釉質表層形成一薄層樹脂膜,并能較好地滲入到釉質孔隙中,和氟保護漆在釉質表面形成的漆膜相比,此層結構更加均勻致密、平滑,能較好地封閉釉質的脫礦孔隙,阻止酸性物質對釉質的進一步侵蝕。本實驗采用體外形成的人工釉質齲,和臨床上致齲環境存在一定差異,真實的口腔環境有可能存在影響滲透樹脂治療效果的因素[22],還需研究其臨床的使用效果。此材料在口腔臨床領域有著廣闊的應用前景。