文冠果XsSCL6基因克隆及表達分析

趙雅欣,陳雨欣,盧涵冰,顏秉舟,敖 妍*

(1 北京林業大學 省部共建森林培育與保護教育部重點實驗室,北京 100083;2 國家能源非糧生物質原料研發中心,北京 100083;3 遼寧文冠實業開發有限公司,遼寧朝陽 122000)

文冠果(XanthocerassorbifoliumBunge)屬于無患子科文冠果屬植物,種子含油量高,是中國特有的木本油料樹種,分布在東北、西北和華北地區[1]。文冠果雌雄同株異花,花分為雌能花和雄能花,雌能花的雌蕊發育正常并且可結實,但雄蕊退化不能散粉;雄能花的雄蕊發育正常,雌蕊退化敗育[2-3]。文冠果的頂芽多發育為雌能花,側芽多發育為雄能花。因此,雌能花的數量遠少于雄能花,導致文冠果綜合利用產業發展的原料供應受到制約[4]。因此,減少雄花雌蕊敗育能夠提高雌雄花比例,對解決文冠果產量低的瓶頸問題具有重要意義。通過克隆轉錄組中篩選到的文冠果雌蕊發育的關鍵差異基因XsSCL6,結合生物信息學解析其作用機制,旨在為進一步研究文冠果雄花雌蕊敗育的分子機制提供理論基礎。

GRAS家族是植物特有的一類重要轉錄因子,在植物大多數的生長發育過程中均能發揮作用[5]。根據蛋白結構特征,GRAS家族蛋白根據結構特征分為SHR、SCR、LISCL、PAT1、SCL、DELLA、LS和HAM等亞家族[6]。HAM亞家族蛋白(scarecrow-like 6,SCL6)能夠參與調控激素信號轉導、光信號轉導[7]、脅迫信號轉導[8]、根系發育[9]、葉片形成[10]、花芽分化[11]、生殖生長的轉化[12]和花器官發育[13]等多種生長發育進程。研究發現HAM的功能缺失促使植物莖端分生組織(shoot apical meristem,SAM)發生分化,導致植物由營養生長轉換至生殖生長,開花提前[12]。例如,擬南芥(Arabidopsisthaliana)3個HAM同源基因SCL6、SCL22和SCL27缺失表現出開花提前和花器官部分缺失等表型[14]。矮牽牛(Petuniahybrida)的HAM基因缺失突變體ham中表現出類似的表型[13]。竹子(Bambusoideae)中HAM類同源基因DlSCL6在擬南芥中異位表達,表現出開花延遲[15]。在水稻(Oryzasativa)中,scl6-IIb突變體表現為產量顯著降低、開花延遲[16]。因此,SCL6在植物開花、花發育和生殖生長等過程中有重要作用。

MicroRNA(miRNA)是大約21個核苷酸的非編碼RNA,能夠通過堿基互補配對原則抑制靶基因的轉錄[17]。研究發現,miR171能夠靶向GRAS基因,通過抑制SCL6、SCL22和SCL27等基因的表達控制植物發育過程[18]。擬南芥中,miR171a在花序中表達量最高,并且通過裂解SCL6基因降低其表達量[19]。過表達MIR171c的擬南芥與scl6突變體具有相似的表型,表現出分枝減少,開花提前等特征[20]。黃瓜(Cucumissativus)Csa-MIR171a的擬南芥過表達植株表現出花器官增大、果實增大和開花提前等特征,AtSCL6基因表達量顯著下調[21]。因此,SCL6基因可能會受到miR171的負調控而發揮不同的作用。

然而,XsSCL6基因在文冠果雌蕊發育中的作用尚不清晰,文冠果雌蕊中的miR171是否靶向XsSCL6基因發揮作用尚不明確。本研究在獲得文冠果雌蕊敗育全轉錄組和文冠果參考基因組的基礎上,利用PCR擴增得到4個XsSCL6基因的CDS全長序列,并構建主效作用基因pBI121-XsSCL6a-GFP表達載體進行亞細胞定位,驗證XsSCL6a是否為轉錄因子。利用生物信息學分析XsSCL6基因序列結構和染色體定位;預測XsSCL6基因編碼蛋白的理化性質和二、三級結構特性;分析XsSCL6基因啟動子順式作用元件功能;預測miR171和XsSCL6的靶向作用關系,解析miR171和XsSCL6基因在雌蕊敗育過程中的表達模式。此外,利用qRT-PCR技術驗證XsSCL6a、XsSCL6b、XsSCL6c和XsSCL6d基因在文冠果雌蕊敗育過程的中表達模式。研究結果可為后續進一步解析XsSCL6轉錄因子調控文冠果雌蕊發育的分子機制提供理論參考,為增加文冠果雌花數量和果實產量提供了新的策略。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

試驗材料于2021年4月19至5月7日在遼寧省朝陽市文冠果試驗基地(120°16′E,41°25′N)11號優良無性系中采集。采樣期內每天從東西南北方向選取頂芽、側芽為材料,分別取出雌蕊組織(圖1)經液氮速凍后存入-80 ℃冰箱保存備用。4月21日、4月26日和4月29日的雌蕊樣品分別命名為雌蕊敗育前期(B)、雌蕊敗育中期(C)和雌蕊敗育后期(E),每個樣品包含3組生物學重復,用于全轉錄組測序和檢測基因表達量。mRNA和sRNA測序基于HiSeq平臺完成,cDNA文庫構建、sRNA文庫構建和 Illumina 測序均委托北京百邁客生物科技有限公司(Biomarker)完成。轉錄組數據中建立了FPKM(fragments per kilobase million)表達矩陣以篩選差異表達基因,TPM(transcripts per million)表達矩陣用于篩選差異miRNA。根據文冠果雌蕊全轉錄組數據和Swissprot、Gene Ontology(GO)、KEGG Ortholog(KEGG)、Protein family(Pfam)等數據庫注釋結果,篩選出4個在雌雄花中差異表達的XsSCL6基因,分別命名為XsSCL6a、XsSCL6b、XsSCL6c和XsSCL6d(基因ID分別為EVM0021236.1;EVM0013538.1;EVM0011858.1;EVM0009975.1)。所有基因序列和氨基酸序列根據本課題組文冠果雌蕊轉錄組和NCBI文冠果參考基因組下載?！臼稀療煵?Nicotianabenthamiana)為亞細胞定位的受體材料。

圖1 文冠果的雌花和雄花

1.2 試驗方法

1.2.1 RNA提取以及cDNA逆轉錄

按照RN52-EASYspin通用植物RNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)的方法提取文冠果雌蕊總RNA。通過1%的瓊脂糖凝膠電泳和Nanodrop2000(thermo fisher scientific,MA,USA)檢測總RNA的質量和濃度。使用Takara PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(寶日醫生物技術有限公司)合成文冠果cDNA第一鏈。

1.2.2 文冠果XsSCL6基因克隆

利用軟件Primer 5.0設計XsSCL6a、XsSCL6b、XsSCL6c和XsSCL6d基因ORF上、下游引物(表1),并委托上海生工生物技術股份有限公司進行合成。

表1 研究所用的引物序列

表2 XsSCL6基因信息及編碼蛋白的理化性質

以上述cDNA為模板進行擴增,PCR程序:98 ℃預變性2 min,98 ℃變性30 s,60 ℃退火20 s,72 ℃延伸1 min,36個循環,最后再72 ℃延伸10 min。擴增得到DNA片段使用1%瓊脂糖凝膠電泳進行驗證。DNA片段經過回收純化后,連接到pTOPO-Blunt載體,轉化至大腸桿菌TOP10進行PCR鑒定后測序,使用30%甘油保存測序正確的菌株進行后續實驗。

1.2.3 文冠果XsSCL6基因生物信息學分析

使用在線工具ProtParam預測XsSCL6蛋白理化性質,利用SOPMA預測XsSCL6蛋白二級結構,并使用WoLF PSORT預測XsSCL6蛋白的亞細胞定位。利用SWISS-MODEL建模XsSCL6蛋白三維結構。使用在線網站(http://mg2c.iaski.n/mg2c_v2.1/)對XsSCL6基因進行染色體定位。用在線軟件GSDS2.0(http://gsds.cbi.pku.edu.cn/)分析XsSCL6基因結構。使用SMART網站(http://smart.embl-heidelberg.de/)及MEME 網站(http://meme.nbcr.net/meme/)分析XsSCL6基因保守結構域和保守基序(motif)。利用Blast程序(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)查找與XsSCL6基因同源的其他物種的相關序列,并用DNAMAN 8進行蛋白序列同源性分析,在MEGA 7.0軟件中Neighbor-Joining(NJ)法構建進化樹。利用Plant-CARE 數據庫(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析XsSCL6基因啟動子序列中的順式作用元件。

1.2.4 文冠果XsSCL6基因表達分析

基于XsSCL6基因全長序列及保守域的分析,使用Primer 5.0設計熒光定量PCR引物(表1),UBQ作為內參基因。上述cDNA稀釋10倍作為qRT-PCR反應模板,總反應體系20 μL,各組分及體積:cDNA 2 μL;TB Green Premix Ex TaqⅡ(Til RNaseH Plus,TaKaRa)10 μL;Rox Reference Dye(Til RNaseH Plus,TaKaRa) 0.4 μL;正向引物及反向引物各 0.4 μL;RNase-free Water 6.8 μL。在Step One Plus(Applied Biosystems)中以如下反應程序設置3次重復:95 ℃預變性3 min,95 ℃變性10 s,58 ℃退火20 s,72 ℃延伸20 s,循環40次。采用2-ΔΔCT法計算目的基因相對表達量,使用Origin 2022對數據進行統計分析并作圖。使用Excel和SPSS軟件統計分析相對表達量,采用單因素方差分析(one-way ANOVO)對其進行顯著性分析。

1.2.5 文冠果XsSCL6基因亞細胞定位

以測序正確XsSCL6a-pTOPO-Blunt大腸桿菌菌液為模板,BamHI-XsSCL6a-F和KpnI-XsSCL6a-R為引物(表1)擴增目的片段。使用BamHⅠ和KpnⅠ限制性核酸內切酶雙酶切pBI121-GFP空載。擴增的目的片段和pBI121-EGFP空載線性載體進行同源重組后,轉化至大腸桿菌Top10感受態。

使用高純度質粒小量快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)提取pBI121-EGFP和pBI121-XsSCL6a-GFP表達載體質粒,轉化至根癌農桿菌GV3101感受態,PCR驗證陽性單克隆菌株并測序。利用農桿菌介導的瞬時轉化法,將pBI121-EGFP和pBI121-XsSCL6a-GFP導入煙草葉片中,培養3 d后使用激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP8)觀察‘本氏’煙草葉片中的GFP熒光信號并拍照。

1.2.6 miR171和XsSCL6靶向關系分析

使用psRNA Target(https://www.zhaolab.org/psRNATarget/),分別上傳xso-miR171s成熟體序列和XsSCL6基因序列進行靶向關系預測。根據文冠果雌蕊敗育轉錄組中xso-miR171s(TPM)和XsSCL6基因的表達量(FPKM),使用TBtools繪制熱圖。

2 結果與分析

2.1 文冠果XsSCL6基因的克隆

以文冠果雌蕊cDNA為模板,通過設計引物進行PCR擴增得到XsSCL6a、XsSCL6b、XsSCL6c和XsSCL6d完整的ORF序列(圖2),結果表明擴增片段的長度與預期相符。XsSCL6a、XsSCL6b、XsSCL6c和XsSCL6d的ORF測序結果與轉錄組數據符合,表明文冠果XsSCL6基因存在4個同源基因。

M. DL5000.

2.2 XsSCL6基因編碼蛋白質的理化性質分析

文冠果XsSCL6蛋白中XsSCL6a蛋白序列最長,由751個氨基酸編碼。而XsSCL6b蛋白序列最短,由669個氨基酸編碼。文冠果XsSCL6蛋白的相對分子量介于74 673.21～82 326.59 D之間,理論等電點介于5.67～6.33之間。文冠果XsSCL6蛋白的親水性平均系數介于(-0.397)～(-0.204)之間,蛋白不穩定指數介于53.69～61.7之間,均屬于親水不穩定蛋白。

2.3 XsSCL6蛋白二級、三級結構和亞細胞定位分析

4個文冠果XsSCL6蛋白的二級結構分析結果顯示,其蛋白的高級結構主要以不規則卷曲和α-螺旋為主(圖3),XsSCL6b、XsSCL6c和XsSCL6d的二級結構曲線趨勢最相似。如表3所示,XsSCL6b和XsSCL6d的不規則卷曲占比更高,達到56%左右,而XsSCL6a和XsSCL6c蛋白不規則卷曲占比為52%左右。XsSCL6c蛋白的α-螺旋占比最高,達到36.26%,而XsSCL6d蛋白的α-螺旋占比最低,為29.43%;此外,XsSCL6蛋白的β-轉角均占比為3%左右。4個XsSCL6蛋白的三級結構主要由無規則卷曲和α-螺旋構成(圖4),建模結果與二級結構分析結果一致。

表3 文冠果XsSCL6蛋白二級結構及亞細胞定位預測

A. XsSCL6a;B. XsSCL6b;C. XsSCL6c;D. XsSCL6d.

亞細胞預測(表3)顯示,4個文冠果XsSCL6蛋白都定位在細胞核中。經過煙草表皮細胞的亞細胞定位驗證(圖5),pBI121-GFP侵染煙草表皮細胞后細胞膜和細胞核中都有綠色熒光,融合表達載體pBI121-XsSCL6a-GFP在細胞核上集中檢測到綠色熒光,說明XsSCL6a蛋白定位在細胞核。

2.4 XsSCL6染色體分布及基因結構分析

文冠果的4個XsSCL6基因分布在2條染色體上,其中XsSCL6a和XsSCL6d位于第1條染色體,XsSCL6b和XsSCL6c位于第11條染色體上(圖6,A)。文冠果XsSCL6基因結構分析結果顯示,XsSCL6b和XsSCL6c基因序列中均包含內含子區域,其他XsSCL6基因序列只包含UTR區和外顯子區(圖6,B);同時,結合motif和domain分析發現這4個XsSCL6基因motif類型及排列順序較為保守,都包含motif8、motif6、motif10、motif3、motif4、motif2、motif7和motif1,并且均具有GRAS保守結構域;但是XsSCL6b基因中的GRAS結構域為超家族,推測其功能與其他XsSCL6基因有所不同(圖6,C)。

A. XsSCL6基因在文冠果染色體的定位;B. XsSCL6基因的結構;C. XsSCL6蛋白的保守基序和保守結構域。

2.5 XsSCL6蛋白質的同源比對和進化分析

圖7為文冠果和銀白楊(Populusalba)、白梨(Pyrusxbretschneideri)、大豆(Glycinemax)、黃瓜(Cucumissativus)、擬南芥(Arabidopsisthaliana)、向日葵(Helianthusannuus)、萵筍(Lactucasativa)、本氏煙草(Nicotianatabacum)、蒂羅花(Telopeaspeciosissima)、阿月渾子(Pistaciavera)、克萊門柚(Citrusclementina)、甜橙(Citrussinensis)、水稻(Oryzasativa)和玉米(Zeamays)的SCL6同源蛋白的系統進化樹。

圖7 XsSCL6與其他植物SCL6蛋白的系統進化樹分析

結果表明,文冠果XsSCL6a、XsSCL6d和克萊門柚CcSCL6b、甜橙CsiSCL6a的親緣關系最近,其次是和銀白楊PaSCL6a、PaSCL6c和PaSCL6b的親緣關系近,文冠果XsSCL6b、XsSCL6c和克萊門柚CcSCL6a、甜橙CsiSCL6b和阿月渾子PvSCL6親緣關系最近。如圖8所示,文冠果XsSCL6蛋白和親緣關系最近的蛋白質多序列比對發現,蛋白序列總相似度為60.32%。文冠果XsSCL6a、XsSCL6d和CcSCL6b、甜橙CsiSCL6a蛋白序列總相似度為77.48%,文冠果XsSCL6b、XsSCL6c和克萊門柚CcSCL6、甜橙CsSCL6蛋白序列總相似度為77.68%。

圖8 XsSCL6與不同物種SCL6蛋白的氨基酸序列比對

2.6 XsSCL6啟動子分析

在文冠果4個XsSCL6基因的啟動子中,順式作用元件主要包括光信號響應元件、植物發育相關作用元件、激素響應元件和逆境響應元件4個種類(圖9,A)。其中,XsSCL6基因的啟動子中逆境響應元件和光信號響應元件占比都較高,植物發育相關作用元件占比較少。對比4個XsSCL6基因發現,XsSCL6a基因的啟動子中包含的元件數量最多,而XsSCL6d基因的啟動子中包含的元件數量最少;此外,XsSCL6基因所有啟動子中都包含激素響應元件,XsSCL6a基因的啟動子中響應激素元件數量最多。

A. XsSCL6基因的啟動子中順式作用元件的數量;B. 響應不同激素的作用元件數量。

對激素相關順式作用元件進行分類有助于進一步分析XsSCL6基因在激素信號轉導中的作用(圖9,B)。XsSCL6基因的啟動子激素響應元件主要包括茉莉酸(JA)、脫落酸(ABA)、水楊酸(SA)、赤霉素(GA)和生長素(IAA)等響應元件,說明XsSCL6可能應答多種激素信號參與文冠果雌蕊生長發育。其中,4個XsSCL6基因的啟動子中都包含ABA和SA響應元件,而JA和GA相關順式作用元件僅存在于XsSCL6a基因的啟動子中;另外,XsSCL6a基因的啟動子中激素響應元件種類最多,僅沒有IAA響應元件;XsSCL6d基因的啟動子中激素響應元件種類最少,XsSCL6b和XsSCL6c基因的啟動子中激素響應元件種類相同。

2.7 文冠果XsSCL6基因雌蕊敗育過程中表達模式分析

結合轉錄組FPKM數據(圖10),利用qRT-PCR驗證了文冠果雌雄花的雌蕊組織中XsSCL6a、XsSCL6b、XsSCL6c和XsSCL6d基因在不同雌蕊敗育時期的表達量(圖11)。

圖10 文冠果XsSCL6基因轉錄組FPKM數據分析

*表示同時期雌花和雄花中存在顯著差異(P<0.05)。

如圖10和圖11所示,該過程中,XsSCL6a基因在雌花中FPKM值和相對表達量均表現為降低趨勢;XsSCL6b、XsSCL6c和XsSCL6d基因呈現出先升高后降低的趨勢,與相對表達量的趨勢基本相同。在雄花中,XsSCL6a基因的FPKM值和相對表達量都隨著雌蕊敗育過程逐漸升高;XsSCL6b、XsSCL6c和XsSCL6d基因的FPKM值和相對表達量都呈現先升高后降低的趨勢。qRT-PCR實驗結果與轉錄組數據保持良好的一致性,驗證了轉錄組數據的有效性和準確性。

圖11為XsSCL6基因在雌蕊敗育前期、雌蕊敗育中期和雌蕊敗育后期在雌雄花中的表達量對比結果。在雌蕊敗育的3個時期,XsSCL6a、XsSCL6b、XsSCL6c和XsSCL6d基因在雄花中的表達量顯著高于雌花,表明XsSCL6基因可能參與了雌蕊敗育過程,并主要在雄花中發揮作用。此外,在雌蕊敗育后期,XsSCL6a基因在雄花中的表達量顯著高于其他基因;XsSCL6a、XsSCL6b、XsSCL6c和XsSCL6d在雌花的表達量均降至最低。

2.8 xso-miR171和XsSCL6基因靶向關系分析

基于已鑒定的xso-miR171a/b/c/d-3p成熟序列,利用psRNA target得到xso-miR171和XsSCL6基因靶向關系(表4)。預測結果顯示,xso-miR171a/b/c/d-3p均能夠靶向XsSCL6的4條同源基因,抑制方式均為裂解,每個XsSCL6基因可能被裂解的CDS區域一致。xso-miR171a-3p和xso-miR171d-3p對XsSCL6基因的錯配率均為1.5,xso-miR171b-3p和xso-miR171c-3p對XsSCL6基因的錯配率均為1,說明不同的xso-miR171對靶基因XsSCL6的作用強度可能存在差異。

表4 xso-miR171和XsSCL6基因靶向關系預測

圖12為基于轉錄組xso-miR171和XsSCL6基因TPM、FPKM繪制的表達量熱圖,雌蕊敗育過程中,xso-miR171a/b/c/d-3p在雌花中的表達量逐漸升高,而XsSCL6a在雌花中的表達量逐漸降低,XsSCL6b、XsSCL6c和XsSCL6d表達量也存在降低趨勢,同時,xso-miR171a/b/c/d-3p在雄花中的表達量逐漸降低,而XsSCL6a在雄花中的表達量逐漸升高,XsSCL6b、XsSCL6c和XsSCL6d表達量也存在升高趨勢。xso-miR171和XsSCL6基因相反的表達趨勢說明xso-miR171可能對XsSCL6基因存在靶向作用。

B、C和E分別表示雌蕊敗育前期、中期和后期;a表示雌花;b表示雄花。

3 討 論

植物GRAS轉錄因子在植物生長發育、抗逆性和激素信號轉導途徑中具有重要的生物學功能,在多種植物中都有報道[22-25]。HAM亞家族與GRAS其他亞家族明顯不同,其基因序列上都包含高度匹配miR171的位點,并受到miR171的抑制調控作用[26]。大多數植物種HAM亞家族存在多個功能冗余的同源基因,其中1個基因出現突變不會出現明顯的表型變化[24]。例如擬南芥的HAM亞家族基因SCL6-Ⅱ、SCL6-Ⅲ和SCL6-Ⅳ突變體表現出側芽的數量少、葉和花發育不正常的表型,與過表達miR171c的表型[11]相似。本研究克隆得到4個文冠果XsSCL6基因序列都包含miR171靶向位點(GAT-ATTGGCGCGGCTCAATCA),說明XsSCL6基因屬于GRAS家族HAM亞家族,推測XsSCL6基因在文冠果雌蕊發育過程中共同發揮作用,并受到miR171的靶向調控。

對文冠果XsSCL6基因結構分析結果顯示,XsSCL6a、XsSCL6c和XsSCL6d基因均包含GRAS保守結構域,并且XsSCL6蛋白和其他物種的SCL6蛋白一致性高,和克萊門柚及甜橙的親緣關系最近,這與已報道的文冠果進化分析結果[27-28]相同。這說明XsSCL6基因可能和其他HAM亞家族具有相似的基因功能,推測能夠調控文冠果的側芽發育、花發育等。此外,4個XsSCL6蛋白二級和三級結構主要由無規則卷曲和α-螺旋組成,文冠果XsSCL6蛋白為親水不穩定蛋白,這與其他物種中SCL6的結構特征及蛋白疏水性特征[15,24,29]類似。文冠果XsSCL6蛋白和其他物種蛋白結構及理化性質相似也說明它們的功能可能具有相似性。本研究通過亞細胞定位的方式預測并驗證了關鍵XsSCL6a蛋白主要在細胞核中表達,表明XsSCL6a可能參與功能重要的復合物合成[30],確定XsSCL6a基因為在細胞核表達的轉錄因子,為后續在植物轉化體系對其進行深入功能研究提供理論基礎。

文冠果XsSCL6基因的啟動子中激素響應類元件占比大,XsSCL6基因除了能對外界環境的光、低溫和干旱等信號做出響應,還可能主要通過應答激素來參與文冠果雌蕊發育過程。每個XsSCL6基因的啟動子元件中都包含SA響應元件,而SA在植物性別分化調控中具有重要作用,能夠影響花器官發育和分化[31-32]。特別是XsSCL6a基因啟動子的激素元件數量明顯多于其他基因,并包含了JA、SA和GA響應元件。JA會影響植物花器官的形成和花朵開放[33-34],赤霉素途徑作為植物成花誘導的4條主要途徑之一,對植物生殖生長和花器官發育意義重大[35-37]。因此,推測XsSCL6a基因能夠響應激素信號,并且是文冠果SCL6基因中發揮主要作用的基因。

植物SAM是保證植物持續生長和器官發育的重要基礎,WUS/CLV3負反饋系統是SAM活性維持的核心[38-40],有很多其他基因共同參與植物SAM活性維持的自主調控系統。在石榴(Punicagranatum)中,發現PgWUS基因在兩性花中的表達量高于功能性雄花,在雌蕊中的表達量顯著高于雄蕊和莖尖[41]。本研究中的4個文冠果XsSCL6基因可能具有與其他植物類似的調控SAM狀態、影響開花和器官發育等功能。對文冠果XsSCL6基因qRT-PCR結果分析發現,4個XsSCL6基因的表達模式相似,在雌蕊敗育的3個時期,4個XsSCL6基因在雄花中的表達量顯著高于在雌花中。推測文冠果XsSCL6基因在雄能花的雌蕊中顯著高表達,影響了該部位的SAM活性維持的自主調控系統和其他調控基因,共同導致了雌蕊敗育的發生。此外,有研究發現甘菊ClSCL6a基因在花粉成熟前期表達量達到最高,在花粉發育中起重要作用[24]。Huang等[42]在土豆(Solanumtuberosum)miR171和靶基因的功能研究中也報道了HAM亞家族能夠參與雄蕊發育。文冠果XsSCL6基因在雄能花顯著高表達,表達量隨雌蕊敗育總體呈現出升高趨勢,可能是由于XsSCL6基因還具有促進雄蕊發育的作用,在一定程度上抑制了雌蕊的發育。綜上所述,XsSCL6基因在文冠果的花發育中的作用機制仍需要通過進行植物過表達等方法繼續研究,進一步解析并驗證XsSCL6基因的重要功能。