番茄類胡蘿卜素降解關鍵基因篩選

程國亭,李同政,閆瓏文,常海飛,王延峰,梁 燕

(1 延安大學 陜西省紅棗重點實驗室,延安大學 生命科學學院,陜西延安 716000;2 延安科育農業科技有限公司,陜西延安 716000;3 西北農林科技大學 園藝學院,陜西楊凌 712100)

番茄是世界第一大蔬菜作物,在國民經濟中占據重要地位。番茄作為研究漿果發育和果實品質形成的模式植物,在科學研究中被廣泛應用,特別是2012年番茄全基因組測序完成后,番茄各方面研究迅速推進[1]。番茄作為蔬菜和水果兼用的作物,其風味品質受到大家的極大關切。研究發現番茄果實風味主要由葡萄糖、果糖、檸檬酸、蘋果酸和29種揮發物組成[2]。番茄果實的揮發物主要是醛類、醇類、酮類、酯類等C4～C16的小分子有機化合物,其前體物質主要是必需營養物質脂肪酸、類胡蘿卜素和氨基酸。脂肪酸衍生的C6醇和C6醛含量較高,具有生青氣味,與番茄新鮮程度有關。類胡蘿卜素衍生的C13和C14酮類、醛類和醇類揮發物,雖然含量較低,但其嗅覺閾值濃度更低,氣味特征多為花香、果香、甜味,深受消費者喜愛。苯丙氨酸衍生的揮發物主要是具有刺激性氣味的芳香醛和醇,亮氨酸/異亮氨酸衍生的揮發物主要是具有焦糖味的C4化合物以及少量的短鏈酯?，F代栽培番茄風味下降與至少13種主要揮發物濃度降低密切相關[2]。因此,增加類胡蘿卜素衍生揮發物的含量可成為番茄風味提升的關鍵[3]。

番茄類胡蘿卜素衍生揮發物主要由類胡蘿卜素裂解雙加氧酶(CCDs)裂解類胡蘿卜素產生[4-7],只有啟動子區含有稀有等位基因的TomLoxC基因才具有裂解類胡蘿卜素的功能[8],SlCCDs是裂解類胡蘿卜素的關鍵基因[9-10]。與擬南芥同源性分析發現,番茄SlCCDs基因家族包括7個成員,分別是SlCCD1A、SlCCD1B、SlCCD4A、SlCCD4B、SlCCD7、SlCCD8和SlCCD-like[11-14],SlCCDs基因之間分工和作用機理并不是很清楚。本研究以香氣寡淡的TI4001和香氣濃郁的CI1005番茄育種自交系為材料,通過分析SlCCDs基因表達與類胡蘿卜素及其衍生揮發物含量的相關性,初步篩選出SlCCD1A和SlCCD1B基因是裂解類胡蘿卜素產生揮發物的關鍵基因,可為提升現代栽培番茄果實風味品質奠定理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

研究以風味差異顯著的番茄育種自交系TI4001和CI1005為材料,均來自西北農林科技大學番茄生物技術與遺傳改良團隊。TI4001為綠色普通大果番茄,總揮發物含量最低,不含異戊二烯衍生揮發物,香氣寡淡。CI1005為紅色櫻桃番茄,總揮發物含量最高,尤其是異戊二烯衍生揮發物含量最高,香氣濃郁[15]。2022年1月25日在延安市安塞生態農業示范園的育苗工廠播種,3月20日定植在安塞生態農業示范園日光溫室,進行田間常規管理。取番茄第三穗花瓣、花萼、根、莖、葉、側芽、幼果和綠熟期、轉色期、粉熟期和成熟期果實[16-17],用于SlCCDs基因表達量測定。同時,綠熟期、轉色期、粉熟期和成熟期果實用于類胡蘿卜素及其衍生揮發物含量測定。

1.2 試驗方法

1.2.1SlCCDs基因特異性表達

在NCBI網站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)下載SlCCDs基因核苷酸序列。根據實時定量引物設計原則,采用Primer primer 5.0軟件設計SlCCDs基因定量檢測引物[18](表1),SlActin作為內參基因,采用Trizol法提取番茄總RNA[19]。用Evo M-MLV反轉錄試劑盒Ⅱ(Accurate Biotechnology Co., Ltd,武漢)先將基因組DNA去除,再反轉成cDNA,用NanoDrop核酸濃度測定儀(ThermoFisher Scientific Co., Ltd,美國)檢測cDNA濃度,稀釋成100 ng/mL。以上述反轉錄的cDNA為模板,用SYBR?Green Pro Taq HS預混型qPCR試劑盒在QuantStudio 5 (Life Technologies Co.,Ltd,美國)上進行qRT-PCR反應。反應體系為20 μL,其中2×SYBR?Green Pro Taq HS Premix 10 μL,cDNA 200 ng,正向和反向引物各0.2 μmol/L,ROX Reference Dye 0.4 μmol/L,用RAase free water補齊至20 μL。反應條件為95 ℃預變性180 s,95 ℃變性10 s,60 ℃復性60 s,變性和復性40個循環[20]。每個樣品均設置3個生物學重復,然后根據2-ΔΔCT計算SlCCDs基因的相對表達量。

1.2.2 果實類胡蘿卜素和揮發物含量測定

番茄果實4個不同成熟期類胡蘿卜素含量用LC-2010A HT高效液相色譜(日本島津株式會社)檢測[21]。用YMC Carotenoid(C30)色譜柱(YMC美國公司,長度×內徑為250 mm× 4.6 mm I.D.,填料顆粒徑5 μm)對類胡蘿卜素進行分離,用番茄紅素、β-胡蘿卜素、葉黃素和玉米黃素標準品確定出峰時間,并做線性回歸校準曲線[22]。

類胡蘿卜素(色譜級)標準品均購買自上海源葉生物科技有限公司。番茄果實4個不同成熟期揮發物定性和定量方法參照[23]。

1.2.3 果實SlCCD1A和SlCCD1B基因克隆

根據Primer primer 5.0軟件設計SlCCD1A和SlCCD1B基因CDS全長引物(表1)[24]。采用Trizol法提取果實總RNA,用反轉錄試劑盒(Takara)生成cDNA[25-26]。PCR擴增SlCCD1A和SlCCD1B基因CDS全長均為1 638 bp。反應體系為50 μL,其中2×高保真酶25 μL,cDNA 400 ng,正向和反向引物各0.5 μmol/L,用RAase free water補齊至50 μL。PCR反應條件:98 ℃預變性58 s,98 ℃變性10 s,58 ℃退火5 s,72 ℃延伸30 s,35個循環,72 ℃終延伸300 s,4 ℃保存[27-31]。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,將含有目的條帶的凝膠用膠回收試劑盒(天根公司)進行回收,然后送生工有限公司(上海)進行測序[32]。

1.3 數據分析

用Office 2019軟件處理數據,用SPSS 22.0軟件單因素方差分析中的Duncan(D)檢驗分析數據之間差異性,用Origin 2019軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 SlCCDs基因表達特性

2.1.1 組織表達特性

番茄7個SlCCDs基因的組織相對表達量如圖1所示。SlCCD1A和SlCCD1B在CI1005和TI4001番茄果實中基因表達量顯著高于其他組織,SlCCD4A在2個番茄花瓣中表達量顯著高于其他組織,SlCCD7和SlCCD8在根中表達量顯著高于其他組織。CI1005中,SlCCD4B在側芽中表達量極顯著高于其他組織,在花瓣和綠熟期果實中表達量也較高。SlCCD-like在花瓣中表達量顯著高于其他組織。TI4001中,SlCCD4B在轉色期果實中表達量顯著高于其他組織,SlCCD-like在花萼中表達量高于其他組織。共同點表現為SlCCD1A和SlCCD1B在果實中表達量最高,SlCCD4A在花瓣中表達量最高,SlCCD7和SlCCD8在根中表達量最高。

2個番茄材料SlCCDs基因組織相對表達量不同。CI1005中,SlCCD1A、SlCCD1B、SlCCD4A、SlCCD4B和SlCCD8在各組織表達量均高于TI4001,SlCCD-like表達量在葉、芽和花瓣中顯著高于TI4001。TI400中,SlCCD7在根中,SlCCD-like在花萼、幼果和莖中表達量顯著高于CI1005。

2.1.2 果實發育時期表達特性

SlCCDs基因表達量在番茄果實發育不同時期有差異(圖1)。CI1005中,SlCCD4B在綠熟期果實中最高,SlCCD1B和SlCCD-like在粉熟期最高,SlCCD1A在紅熟期最高。TI4001中,SlCCD-like在幼果期最高,SlCCD1A和SlCCD4B在轉色期果實中最高,SlCCD1B在紅熟期最高。2個番茄材料果實成熟過程中SlCCD4A、SlCCD7和SlCCD8表達量均很低。說明SlCCD4B主要在成熟早期表達,SlCCD1B主要在成熟后期表達,其他SlCCDs表達量幾乎不受果實成熟進程的影響。

2個番茄材料SlCCDs基因果實發育期表達不同。CI1005中,SlCCD4B表達量在綠熟期果實中顯著高于TI4001番茄,SlCCD1A和SlCCD1B表達量在轉色期、粉熟期和紅熟期顯著高于TI4001。TI4001中,SlCCD4B表達量在轉色期果實中顯著高于CI1005。其他SlCCDs表達量在2個材料間沒有顯著性差異。

2.2 果實不同時期類胡蘿卜素及其衍生揮發物含量

2.2.1 類胡蘿卜素含量

2個材料果實番茄紅素、β-胡蘿卜素、葉黃素和玉米黃素含量如圖2所示。CI1005中,番茄紅素含量遠高于其他3種類胡蘿卜素。番茄紅素含量隨著果實成熟顯著升高,紅熟期高達75.84 mg/(100 g)。β-胡蘿卜素含量綠熟期至粉熟期顯著升高,粉熟期到紅熟期顯著降低,粉熟期最高,為8.53 mg/(100 g)。葉黃素在綠熟期未檢測到,轉色期到紅熟期顯著降低,轉色期最高,為3.89 mg/(100 g)。玉米黃素只在轉色期和粉熟期檢測到,含量分別只有0.08,0.07 mg/(100 g)。TI4001中,未檢測到番茄紅素,β-胡蘿卜素含量隨著果實成熟持續升高,粉熟期最高,為1.18 mg/(100 g)。葉黃素在綠熟期未檢測到,轉色期、粉熟期和紅熟期含量分別為0.76,0.58,0.67 mg/(100 g)。玉米黃素含量綠熟期和轉色期高于粉熟期和紅熟期,轉色期最高,為0.20 mg/(100 g)。說明紅色CI1005番茄中類胡蘿卜素主要由番茄紅素和β-胡蘿卜素組成,綠色TI4001番茄中各種類胡蘿卜素含量均較低。2個番茄材料類胡蘿卜素含量差異顯著。CI1005中,番茄紅素和β-胡蘿卜素含量4個發育時期均顯著高于TI4001,葉黃素在轉色期和粉熟期顯著高于TI4001。TI4001中,只有在轉色期玉米黃素顯著高于CI1005。2個材料在其他時期類胡蘿卜素含量差異均不顯著。說明CI1005中類胡蘿卜素含量顯著高于TI4001。

2.2.2 類胡蘿卜素衍生揮發物含量

番茄果實不同發育期類胡蘿卜素衍生揮發物如圖3所示。CI1005中,類胡蘿卜素衍生揮發物含量由高到低依次為6-甲基-5-庚烯-2-酮、香葉基丙酮、檸檬醛和6-甲基-5-庚烯-2-醇,均隨著果實成熟持續升高,紅熟期最高,分別為179.15,77.54,33.09,6.35 μg/kg。TI4001中,只檢測到6-甲基-5-庚烯-2-酮和香葉基丙酮,最高含量只有7.70,3.64 μg/kg,且在果實不同成熟期差異均不顯著。說明類胡蘿卜素衍生揮發物主要在成熟后期積累。

圖3 番茄果實不同成熟期類胡蘿卜素衍生揮發物含量

2個材料6-甲基-5-庚烯-2-酮和香葉基丙酮含量在綠熟期差異不顯著,在轉色期、粉熟期和紅熟期,CI1005中6-甲基-5-庚烯-2-酮和香葉基丙酮含量在極顯著高于TI4001。說明CI1005中類胡蘿卜素衍生揮發物含量顯著高于TI4001,且隨著果實成熟,差異急劇增大。

2.3 SlCCDs基因與類胡蘿卜素及其衍生揮發物之間的相關性

SlCCDs基因表達量與類胡蘿卜素(番茄紅素、β-胡蘿卜素和玉米黃素)、類胡蘿卜素衍生揮發物(檸檬醛、6-甲基-5-庚烯-2-醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮和香葉基丙酮)含量之間的相關性如表2所示。

表2 SlCCDs基因與類胡蘿卜素及其衍生揮發物之間的相關性

SlCCD1A、SlCCD1B和SlCCD4A與番茄紅素、β-胡蘿卜素、6-甲基-5-庚烯-2-酮、香葉基丙酮、檸檬醛和6-甲基-5-庚烯-2-醇之間均呈極顯著正相關。SlCCD1A和SlCCD1B還與β-胡蘿卜素呈極顯著正相關,SlCCD-like僅與呈玉米黃素顯著正相關,其他SlCCDs基因表達量與類胡蘿卜素及其衍生揮發物之間相關性不顯著,說明SlCCD1A和SlCCD1B是裂解番茄果實中類胡蘿卜素產生揮發物的關鍵基因。番茄紅素和β-胡蘿卜素含量與檸檬醛、6-甲基-5-庚烯-2-醇、6-甲基-5-庚烯-2-酮和香葉基丙酮含量之間均呈極顯著正相關,4種類胡蘿卜素衍生揮發物含量之間葉呈極顯著正相關,說明番茄紅素和β-胡蘿卜素是這些揮發物的前體。

3 討 論

前人研究發現,CCDs基因通過多步驟多場所的協同作用裂解類胡蘿卜素[33]。在質體中,C40類胡蘿卜素先被CCD7和CCD4酶裂解成C27阿樸類胡蘿卜素,再被CCD4酶裂解為C13酮和C14二醛揮發物,或者C27阿樸類胡蘿卜素進入細胞基質,被CCD1酶裂解為無色C13環己烯酮和黃色C14多烯衍生物[34-36]。本研究表明,SlCCD1A和SlCCD1B基因在番茄果實中表達量顯著高于其他組織,隨著番茄果實成熟表達量顯著升高;類胡蘿卜素及其衍生的揮發物積累也表現出同樣的趨勢,隨著番茄果實含量顯著增加;SlCCD1A和SlCCD1B基因表達與類胡蘿卜素及其衍生揮發物顯著正相關,推測SlCCD1A和SlCCD1B基因是番茄果實中裂解類胡蘿卜素的關鍵基因,需要進一步通過過量表達和基因編輯技術進行驗證。Simkin等[37]發現,在果實成熟過程中,SlCCD1A表達量綠熟期至橙熟期逐漸降低,橙熟期至紅熟期迅速升高,在紅熟期達到最高。而SlCCD1B表達量變化趨勢與SlCCD1A恰好相反,在橙熟期SlCCD1B表達量最高。Ilg等[38]表明SlCCD1B基因在番茄成熟果實中表達量較高,裂解產物對果實香味貢獻最大。Wei等[14]認為SlCCD1A基因在綠熟期表達量最高,破色期迅速降低,粉熟期略有升高,紅熟期又開始下降。SlCCD1B與SlCCD1A基因表達變化趨勢恰好相反,粉熟期表達量最低,紅熟期表達量最高,可能不同番茄材料之間SlCCD1基因表達量變化趨勢存在差異,有待進一步驗證。

CCD1酶沿著碳主干,在不同位置切割各種立體化學結構的線性、單環和雙環類胡蘿卜素,產生眾多阿樸類胡蘿卜素[39-40],如5,6-環氧-3-羥基-β-紫羅酮、香葉基丙酮、β-紫羅酮、C14二醛、3-羥基-β-紫羅酮、9-順式-新黃質在C9-C10雙鍵裂解產物、9-順式-新黃質在C9′-C10′雙鍵裂解產物、4,9-二甲基十二烷-4,6,8-三烯二醛、α-紫羅酮、假紫羅酮、3-羥基-α-紫羅酮[38,41-42]。在C9-C10和C9′-C10′雙鍵位置對稱降解而生成C13衍生物,如β-紫羅蘭酮、環檸檬醛、二氫獼猴桃內酯等降異戊二烯香氣物質和C14二醛[43-44]。CCD1也可作用于C5-C6、C7-C8和C11-C12雙鍵[45]。番茄SlCCD1A和SlCCD1B對底物和切割位點沒有強的選擇性,可多個雙鍵位置氧化裂解順式類胡蘿卜素和全反式類胡蘿卜素,以及不同的阿樸類胡蘿卜素,產生大量的揮發物、單阿樸類胡蘿卜素和二醛產品,包括順式假紫羅蘭酮、橙花醛、香葉醛和法尼基丙酮[37-38]。番茄SlCCD1可在9和10(9′和10′)C-C雙鍵位置對稱地切割多個類胡蘿卜素,產生的C14二醛和C13環己酮[37]。CCD1還可根據碳C7-C8(7′-8′)和C11-C12(11′-12′)之間的飽和狀態以及C5、C9和C13(5′、9′和13′)上的甲基識別其裂解位點[41]。雙環類胡蘿卜素主要在9,10(9′,10′)雙鍵處被裂解,非環類胡蘿卜素在末端斷裂形成香葉醛[46]。

反義表達番茄SlCCD1基因,轉基因番茄的葉片和果實中的SlCCD1A和SlCCD1B的mRNA水平降低了87%～93%,β-胡蘿卜素衍生的C13環己酮——β-紫羅蘭酮和番茄紅素衍生的C13無環產物——香葉基丙酮含量分別只下降了50%和60%,轉基因植株形態和類胡蘿卜素含量并無明顯變化[47]。對SlCCD1A和SlCCD1B進行敲除的株系顯著降低了所有阿樸類胡蘿卜素揮發物的濃度,但他們并沒有被徹底消除[37],說明阿樸類胡蘿卜素揮發物的產生存在轉錄后調控,或者還與其他酶有關,需要進行進一步研究。