穗花牡荊花芽分化過程中形態和生理指標變化

易仁知,秦 俊,黃清俊*

(1 上海應用技術大學 生態技術與工程學院,上海 201418;2 上海辰山植物園城市園藝技術研發與推廣中心,上海 201602)

穗花牡荊(Vitexagnus-castus),屬唇形科(Lamiaceae)牡荊屬(Vitex),小型落葉花灌木,原產于歐洲,主要分布于亞洲中部, 歐洲南部及地中海地區,國內多見于江浙滬一帶地區栽培[1]。其藍紫色花序大而多,花色艷麗且夏季花期長,觀賞效果佳,常在湖濱、溪地、道路兩側或公園等園林配植。穗花牡荊不僅是園林應用前景好的夏花植物,且其果實藥用歷史悠久,已在國外廣泛用于婦產科疾病治療[2]。目前關于穗花牡荊的園林研究主要集中于育種方面[3-7],如扦插繁育、組織培養、多倍體誘導等;少數學者就栽培技術進行了闡述,僅見于遮陰、摘心、水分脅迫、多效唑處理[8-9],對其開花生理特性和花期調控技術鮮有報道。

花芽分化作為植物從營養生長向生殖生長轉變的重要標志[10],劃分植物花芽分化進程常分為分化初期、萼片分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期和雌蕊分化期等多個時期,不同物種具有差異性。比如,趙通等將杏(Prunusarmeniaca)花芽分化進程劃分為未分化期、分化初期、萼片分化期、花瓣分化期、雄蕊分化期、雌蕊分化期、花粉細胞期7個時期[11]。張詩艷等將海南蒲桃(Syzygiumcumini)花芽形態分化過程劃分為7個階段:花序原基分化期、小花原基分化期、萼片原基分化期、花瓣原基分化期、雄蕊原基分化期、雌蕊原基分化期和雄蕊雌蕊形成期[12]。目前,關于花芽分化的調控存在許多假說,例如碳氮比學說[13]、激素平衡[14]和信號調節假說[15]等。碳氮比學說提出碳氮比達到較高的比例才會促使花芽分化,在一理論在許多植物中得到驗證[11,16]。王楨等人研究表明,較低ABA/GA3、IAA/GA3、ABA/IAA促進西紅花頂芽花芽分化[17]。

據物候期觀察,在上海地區穗花牡荊返青萌芽一般3月下旬開始,頂芽迅速膨大后4月初展葉,展葉后植物整體枝條、葉片加快生長,為花芽分化做準備。在江浙一帶穗花牡荊一年主要有兩季集中的花期,主要在6-8月份。花芽分化的數量和質量很大程度上影響著穗花牡荊的觀賞品質,目前該物種花芽分化相關研究尚未報道。因此,通過劃分穗花牡荊花芽分化進程和掌握不同時期形態特征,以及探究花發育過程中生理及內源激素變化,可為今后穗花牡荊的花期調控和栽培選育提供理論基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料與處理

供試物種為上海辰山植物園所種植的5年生穗花牡荊盆栽苗,選擇生長健壯,長勢相似且無病蟲害的植株取樣,共100株。試驗連續1年物候觀察,從2020年12月初觀察頂部冬芽的萌動情況,從冬季清晨約每隔5 d采樣,春季約每隔3 d采樣,直到花盛開為止。采用物候期觀察和形態解剖結合觀測穗花牡荊花發育過程,2021年3月24日開始返青萌芽進入營養生長期,4月初花芽逐漸進入形態分化期,4月12日開始觀察到穗花牡荊花序軸原基分化,于4月中旬出現肉眼可見的分生組織,5月中旬大部分花芽現蕾。

1.2 試驗方法

1.2.1 花芽形態觀察

于 2021 年 3 月 24 日開始試驗,連續2～3 d采樣,直至現蕾。每次隨機取大小一致芽體發育程度相似的20個新梢中上部頂芽,1/2數量芽體置于體視顯微鏡Olympus SZX16縱剖觀察,確定花芽分化時期;剩余頂芽剝去葉片,固定于FAA(95%乙醇∶冰醋酸∶甲醛=9∶0.5∶0.5)溶液中,48 h后70%的酒精永久保存。固定好的花芽采用常規石蠟切片方法切片,用萊卡Leica2245切片機進行6～8 μm切片,切片后放置于萊卡H1220烘片臺烘干后用甲苯胺藍染色,置于生物顯微鏡Nikon BX41下拍照。在顯微成像系統下將各時段解剖的花芽和石蠟切片數量進行花芽分化情況觀察和數據統計,花芽階段的劃分標準為某一分化階段花芽數量超過50%。

1.2.2 生理指標測定

根據形態解剖觀察結果從花芽分化初期(2021 年 4 月6 日后)連續采樣葉片和花芽用于生理指標測定,部分葉片和花芽105 ℃殺青15min,72 ℃烘干至恒重后磨樣用于總碳和總氮含量測量,部分直接放入液氮罐中冷凍后轉入-80 ℃超低溫冰箱保存用于各項生理指標的測定。碳氮比(C/N):稱取烘干后樣品0.01 g,加入5 mL重鉻酸鉀(0.8 mol/L),加入5 mL濃硫酸油浴消煮,用0.2 mol/L的硫酸亞鐵滴定,測定總碳含量。稱取樣品0.3 g,加入5 mL濃硫酸,消煮,分3次加入雙氧水,直至消煮液呈清亮,轉移至100 mL容量品,定容過濾,量取10 mL進行蒸餾,利用0.01 mol/L H2SO4進行滴定,測定總氮含量。可溶性糖、可溶性蛋白含量通過試劑盒測定,試劑盒購于索萊寶有限公司。赤霉素GA3、細胞分裂素CTK、生長素IAA以及脫落酸ABA采用酶聯免疫吸附法,試劑盒及試驗方法來源于上海酶聯生物公司。

1.3 數據與圖像處理

用Excel 2021軟件進行數據整理,SPSS 25.0進行單因素分析和 Duncan’s多重比較, SigmaPlot 14.5和Prism 9軟件繪制圖表,圖片拼接借助 Photoshop 2021軟件。

2 結果與分析

2.1 穗花牡荊花芽分化過程內部形態觀察

根據穗花牡荊開花物候期和花芽分化進程的觀測結果,研究發現該物種在當年主要有2次集中穩定的夏季開花和秋末零星開花現象,花芽分化類型為當年多次分化型。穗花牡荊在3月展葉后迅速進行營養生長,同時受到花芽分化誘導,頂部生長錐轉化為總軸花序原基;花序原基在4-6月不斷進行形態分化直至花器官發育完成。據石蠟切片觀察結果可劃分為7個時期:未分化期、總軸花序原基分化期、初級分軸花序原基分化期、次級分軸花序原基分化期、小花原基分化期、花器官分化前期和花器官分化后期。

未分化期:2月初芽未萌動,生長點突起,混合芽形態,處于未分化期。3月中旬,芽體生長點頂端較小,基本呈圓錐型,在營養生長錐兩側的葉原基逐漸向內分化,保護內側生長點,外層細胞排列緊密,處于花芽誘導態 (圖1,A)。

A.未分化期;B.總軸花序原基分化期;C.初級分軸花序原基分化期;D.次級分軸花序原基分化期;E.小花原基分化期;F.花器官分化前期;G.花器官分化后期。Lp.生長錐;Gp.葉片;Bp.頂生花序原基;Br.初級腋生花序原基;Apm.次級腋生花序原基;1st Axm.苞片原基;2nd Axm.苞片;Fp.小花原基;Fsp.小花萼片原基;Fpp.小花花瓣原基;Pp.雌蕊原基;Sp.雄蕊原基;Se.萼片;Pe.花被;St.雄蕊;Pi.雌蕊;An.花藥;Ov.子房。圖A-E為整個花芽,圖F-G為花芽頂端部位。

總軸花序原基分化期:葉芽生長錐呈現半圓形逐漸變寬,由花芽分化前期的花芽誘導態變為花序總軸原基分化期。靠近枝條頂端的芽體生長點有小程度的突起,肉眼很難分辨外部形態發生的變化,此時芽為混合芽。由切片可見,突起處細胞排列緊密,染色較深,原形成層由半圓形變成“八”字形,總軸原基直徑為0.11 mm(圖1,B)。整個生長錐趨向半圓形,長度顯著增加,形成多級苞片,保護內部幼嫩的花芽分生組織。此期出現約在2021年3月14至4月9日, 4月9日觀察的花芽全部進入此時期。

初級分軸花序原基分化期:于3月末腋芽表面御寒的芽鱗已基本脫落,芽體逐漸返青展葉,新梢生長出5～8個節間數,頂部和腋間混合芽直徑迅速膨大。4月中旬,總軸不斷伸長,花芽從混合芽中露出,肉眼可見苞片腋間有明顯的分生組織,進而產生雙側分軸,為第二級花序分軸原基分化期。在總軸兩側的線形苞片腋間產生隆起的分生組織,隨后發育成側級花序,為花芽分化分軸原基。切片可見,花序分軸原基上已分化出保護幼花的苞片原基(圖1,C)。此期出現盛期在4月12至4月22日。

次級分軸花序原基分化期:花梗不斷增長,花蕾增大。在初級分軸花序原基兩側腋間以第一輪花序分化方式重復分化次級分軸花序原基(圖1,D)。4月底花序表面包裹著多層苞片,伴隨著分化逐漸伸長膨大露出十分明顯的總狀花序,每個總軸上末端最表層苞片不脫落,最終發育成葉片。此期出現盛期在4月25日至4月28日。

小花原基分化期:總軸花序梗和次級分軸更迅速增長,整個花序長度驟增。隨后在次級分軸花序原基底部兩側按照二歧聚傘花序依次分化出小花原基(圖1,E),次級分軸花序軸上著生的兩側的小花原基較中間的小花原基分化程度較晚,隨著小花分化程度增加,小花數目明顯增加。此期出現盛期在4月28日至5月5日。

花器官分化前期:萼片原基逐漸出現,隨后覆蓋花頂。花序軸上大量小花原基上兩側有小花萼片原基發生(圖1,F)。此期出現盛期在5月1日到5月8日。

花器官分化后期:在與萼片相間的位置上,5枚花瓣原基同一時間分化,隨后,4枚雄蕊原基同時分化。花瓣大部分內彎后,環形心皮在花頂出現,后演變為子房、花柱、柱頭3部分(圖1,G)。穗花牡荊花器官發生是較典型的輪狀發生,萼片、花瓣、雄蕊、心皮,向心式逐輪分化,每朵小花發育順序從花序底部向上,由中間向兩側。此期出現盛期在5月8日至5月16日。

伴隨著新梢的長度增加和花序軸不斷生長,小花在分軸花序上呈聚傘狀花序構成次級分軸花序,且離花序頂端越遠,分化越早,處同一水平位置花芽分化進程相似。花序總梗常有0～4個分軸,構成復圓錐花序。4月下旬開始分化萼片原基、花瓣原基、雄蕊原基、雌蕊原基,單個芽體開始現出兩芽鱗之外和體積膨大,從外向心式發育;同時花梗不斷伸長,5月16日全部現蕾,頂部花芽已經分化完成,處于育蕾階段,即花器官逐步發育過程。所有小花依次從下向上從里往外開放。花萼鐘狀頂端5齒裂,花冠頂端5裂,2唇形,雄蕊4～5,柱頭2裂,子房由2心皮組成。

2.2 花芽分化進程中碳氮物質含量變化

隨著花芽分化時間推進,花芽和葉片可溶性糖總量整體呈現升高的趨勢。由圖2可知,總軸花序原基分化期前期葉片可溶性糖含量低于花芽。4月6日至4月12日,總軸花序原基分化時,葉片中可溶性糖含量第1次急劇上升,且含量高于花芽。隨著腋間分生組織的出現,即初級分軸花序原基分化期,葉片中可溶性糖含量在4月15日達到最低值4 mg/g;后期次級分軸花序原基大量分化時,葉片4月25日中可溶性糖含量達到低峰值10.5 mg/g,說明花序原基分化均需消耗葉片中大量可溶性糖。4月6日至4月25日,花芽中的可溶性糖含量緩慢上升,有一定的可溶性糖積累,說明葉片內可溶性糖往花芽內運輸和花芽中可溶性糖的積累有利于花芽花序原基分化。4月25日以后,葉片可溶性糖含量整體上升積累,為花器官分化做準備。4月25日至5月8日,花芽中可溶性糖含量整體上升,有利于小花原基的分化,其中萼片原基分化消耗了部分花芽內的可溶性糖含量。5月8日至5月16日,花芽中可溶性糖含量顯著下降,說明花器官分化需要消耗可溶性糖。

圖2 穗花牡荊花芽分化進程中可溶性糖、可溶性蛋白變化

隨著花芽分化時期推進,葉片中蛋白質含量呈“降-升-降-升”變化趨勢,花芽中蛋白質含量呈“升-降-升”變化趨勢。總軸花序原基分化時期葉片可溶性蛋白比花芽中多,葉片中的蛋白質向花芽轉移保證了花芽分化的順利進行,花芽需要大量的蛋白質供應。4月15日至4月22日分軸花序原基葉片需要大量的蛋白質積累,為后序小花原基分化提供所需的物質和能量;5月1日至5月16日花器官分化期,說明花器官分化葉片中需要較高水平的蛋白質含量。

4月6日至4月22日,花芽中蛋白質含量持續上升,說明花序原基的分化需要大量的蛋白質積累;4月22日至5月1日,花芽內蛋白質的消耗保證了小花原基分化順利進行;5月1日至5月16日,花芽中蛋白質含量上升而葉片中蛋白質含量下降,說明葉片的蛋白質輸送到花芽促進花器官的分化。

穗花牡荊花芽分化進程中全碳、全氮含量變化如圖3所示,葉片中全碳含量的變化呈升-降-穩定-升趨勢,花芽中全碳含量的變化整體呈先升后降趨勢。全碳含量在4月9日最低,葉片和花芽中全碳含量接近,達到平衡,大多數混合芽的生長錐逐漸從營養生長轉向生殖生長,逐步上升到4月19日出現峰值。

圖3 穗花牡荊花芽分化進程中全碳、全氮含量、碳氮比變化

4月19日至4月25日次級花序原基大量分化,葉片和花芽中全碳含量降低。4月25日至5月8日,花芽中碳含量迅速上升,保證小花原基大量分化。5月8日后,花芽中的全碳含量降低,葉片中全碳含量上升,與花瓣原基和雌雄蕊原基分化有關。葉片中全氮含量的變化呈先小幅度上升-下降-小幅度上升趨勢,花芽中全氮含量的變化整體呈下降趨勢。葉片中全氮含量在4月13日達到最高值48.75 mg/g,且在次級花序原基、小花原基以及萼片原基分化期間低于花芽中的全氮含量,5月8日后由小幅度上升。隨著花芽分化推進,花芽與葉片碳氮比整體上升的趨勢。5月1日花器官分化期,花芽中的碳氮比高于葉片,說明花芽中保持較高的碳氮比水平有利于花器官的分化。

綜上所述,穗花牡荊花芽分化過程中的不同時期葉片和花芽中可溶性糖和可溶性蛋白質含量均有波動,總體上葉片中營養物質含量高于花芽。葉片的大量可溶性糖充足保證了花序原基分化有足夠的能量來源,花芽中可溶性糖含量整體上升積累有利于花器官分化。葉片中需要較高水平的蛋白質有利于混合芽向花芽形成,花芽中大量的蛋白質積累促進了花序原基的分化,葉片的蛋白質輸送到花芽保證了花器官的分化順利進行。

2.3 花芽分化進程中內源激素含量變化及動態平衡

花芽分化進程中內源激素含量變化如圖4。隨著花芽分化進程的推進,葉片中IAA含量呈現波動式上升后下降,其中最低值出現在4月15日(初級分軸花序原基分化期)為85.01 μg/L,最高值出現在5月1日(小花原基分化期)為101.08 μg/L,后期IAA降低對從花器官原基大量分化有著重要的作用。ABA含量總體呈先波動時式上升后下降趨勢,低含量的ABA有利于總軸花序原基形成,較高水平的ABA有利于小花原基的分化,ABA含量下降可以促進成花器官分化,其中4月15日和4月25日2個峰值分別為初級花序原基和次級花序原基分化盛期。GA3含量總體呈先上升后下降趨勢,在花序分化期即將結束后處于低水平狀態,說明GA3含量上升有利于花芽分化。CTK含量呈“上升-下降-上升-下降”波動狀態,4月9日至4月22日,CTK含量上升有利于頂部花序原基和腋間花序原基的分化;4月22日至4月25日,CTK含量下降,此時初級花序軸上的次級花序原基大量分化。5月5日達到最高值,隨后下降,這說明高水平的CTK含量有利于小花原基的分化和CTK含量下降有利于花器官原基的分化。IAA、ABA和CTK在5月1日至5月8日含量均處于較高狀態,說明在這期間以上3種激素達到一定的累積,進而調控花器官分化。

圖4 穗花牡荊花芽分化進程中內源激素含量變化

內源激素對穗花牡荊花芽分化的調控與不同激素動態平衡有關,如圖5所示。花序原基分化期,葉片中GA3/ABA和IAA/CTK趨勢變化大致相同,比值處于較低水平。ABA/CTK和ABA/IAA升高伴隨著小花原基和小花萼片原基分化。花器官分化期,IAA/CTK下降。葉片中GA3/CTK、GA3/ABA和GA3/IAA的變化趨勢大致相同。

圖5 穗花牡荊花芽分化進程中內源激素含量比值變化

其最低值均在5月1日,此時處于小花原基分化盛期,小花原基上的兩側花萼片原基逐漸開始分化形成花萼片,說明花萼片原基分化需要較低的GA3/CTK、GA3/ABA和GA3/IAA誘導;其最高值出現均在5月11日,此時花器官大量分化,說明花器官的分化尤其是花瓣原基、雄雌蕊原基分化需要較高的GA3/CTK、GA3/ABA和GA3/IAA;花器官的分化完成后則GA3/CTK、GA3/ABA和GA3/IAA降低,這一變化有利于花器官進一步發育。

3 討 論

3.1 穗花牡荊花芽分化的特點

穗花牡荊作為藍紫色系夏季時令花灌木,研究其花芽分化對花期調控和花質量提升有著重要意義。觀察穗花牡荊花芽分化進程,這與復合花序的植物的研究結果[18-19]基本相符。由于穗花牡荊屬于復合圓錐式的聚傘花序,且同一花序中不同的單花處于不同的分化時期和發育狀態,不同空間位置花序開花時間順序也存在差異,即枝條頂端的花序先發育成熟,花序分支底端小花和分支中間的花先開放。這與具有典型聚傘花序開花特征的皺葉膏桐花序(二歧聚傘花序)開花順序存在差異[21]。穗花牡荊屬于無限花序,不同枝位的小花原基分化期、花器官分化前期和花器官分化前期階段存在部分的重疊現象。穗花牡荊1年有明顯的兩季開花現象,與皺葉膏桐[20]、麻瘋樹[21]、‘L6’萱草[22]的2次開花特征相似。郭娜[23]研究發現2次成花的丁香第1季的花芽屬于夏秋分化型,第2季的花芽屬于當年分化型;而穗花牡荊的第1季花芽屬于當年分化型,其能多次誘導成花的主要原因在于花芽不需要經過低溫休眠,溫度和營養條件達到便可多次開花。根據花芽分化進程,可推測在分軸花序原基分化期到小花原基分化期之前,即小花原基形成之前的階段,通過一些外源激素或物理手段影響花序與小花的數量,進行花期調控和提升花品質。

3.2 生理指標與花芽分化的關系

花芽分化是十分復雜的生理生化的過程,需要大量的碳水化合物、可溶性蛋白等營養物質積累以及碳氮物質的比例平衡來保證花芽分化順利進行[24-25]。吳秋潔等[26]表明可溶性糖、淀粉和可溶性蛋白含量均顯著上升有利于花器官發育過程。張詩艷等人[12]表明海南蒲桃花芽形態分化過程花芽可溶性糖和淀粉含量變化趨勢為先降后升趨勢,花芽形態分化和開花需要大量碳水化合物積累。何文廣等[16]表明山雞椒雌花在花芽分化期間從葉片部位輸送大量的可溶性蛋白來供花芽分化進行。本研究的結果也表明隨著穗花牡荊花芽分化時間推進,花芽可溶性糖總量整體的升高有利于花芽分化。在花芽分化前期花序原基的分化需要葉片中大量的蛋白質積累,花芽分化后期花芽中蛋白質含量上升而葉片中蛋白質含量下降說明葉片中蛋白質輸送到花芽促進花器官的分化。葉片中的可溶性蛋白含量在花芽分化中呈現上升下降再上升趨勢,最小值出現在花序分軸原基大量的分化時,最大值出現在花器官大量分化時。幾個重要的花芽分化時刻存在峰值;其次,碳氮比學說認為,樹木碳和氮的比例合適,花芽分化旺盛[11]。從碳氮比看,穗花牡荊碳氮比逐步上升,花芽中后期的碳氮比高于葉片說明花芽中保持較高的碳氮比水平有利于花器官的分化。這一點與山雞椒的研究結果[16]一致。因此,穗花牡荊在生產上可通過調節氮肥的比例和環剝等園藝手段增加碳氮比,從而調控其花芽分化進程。

植物內源激素含量及激素平衡對花芽分化的順利進行起著重要的調控作用。生長素對花芽分化的影響存有分歧。研究表明低濃度IAA有利于竹葉蘭[26]和板栗[27]花序分化和生長。本試驗IAA含量整體先上升后下降,呈波動式,低水平IAA有利于穗花牡荊的花序原基形成。GA3作為調控成花信號的重要激素之一,關于蘋果、葡萄、桃、梨等植物的眾多研究表明低水平GA3有利于花芽分化,高水平GA3抑制花芽分化[28],但這并不絕對。本試驗穗花牡荊葉片的GA3水平在花芽分化進程持續上升累積,與山雞椒葉片中的GA3含量趨勢變化[29]一致。這可能是由于穗花牡荊植物存在大量萜類物質[30],二者在合成通路中擁有共同的前體途徑[31],導致赤霉素隨之累積。ABA和CTK作為促花激素,大量研究表明高水平ABA和CTK可以促進花芽分化[32-34]。從試驗結果來看,低含量的ABA有利于花序原基分化,較高水平的ABA有利于小花原基的分化,ABA含量下降可以促進成雄雌蕊原基分化,與薇甘菊[35]和棗[36]花芽分化的研究相似;葉片中高水平的CTK含量有利于穗花牡荊小花原基的分化和CTK含量下降有利于其花器官原基的分化。

內源激素調控花芽分化常體現在不同種類激素的動態平衡。各類植物激素不僅會在花芽分化進程中呈現出一定的調控作用,而且還彼此拮抗或促進。多種的激素比例變化就會生成平衡狀態。越來越多的學者從激素平衡角度去解釋花芽分化的規律。如髙比值的ZT/IAA、ABA/IAA、ZT/GA3、ABA/GA3促進枇杷花芽分化[37];龍眼頂芽花序主軸分化前期IAA/GA3處于低水平,后期ZT/GA3升高能促進花芽分化,所有的形態分化期ZT/ABA及GA3/ABA較低[38]。在本研究中,較低水平GA3/ABA也有利于花序分化。小花原基分化期間,ABA/CTK、ABA/IAA比值升高有利于小花原基和小花萼片原基形成。GA3/CTK、GA3/ABA和GA3/IAA快速上升有利于花瓣原基、雄雌蕊原基發育。

4 結 論

通過研究花芽分化過程中的形態和生理變化,表明穗花牡荊花芽分化為一年多次分化型,其分化過程可劃分為7個時期:未分化期、總軸花序原基分化期、初級分軸花序原基分化期、次級分軸花序原基分化期、小花原基分化期、花器官分化前期和花器官分化后期。相同一株植物不同枝條的花芽及相同花序中不同小花分化的進程存在差異,第1季花期后各階段的花芽分化形態多同時出現。穗花牡荊花芽分化過程中整體葉片中碳水化合物含量比花芽高有利于提供營養,且較高的C/N比保證了花芽分化的順利進行。花芽分化過程中,IAA、ABA、CTK和GA3整體水平上先升后降有利于花芽分化進行。低水平的GA3/ABA和IAA/CTK有利于花序的形成,ABA/CTK和ABA/IAA升高促進小花原基和小花萼片原基的分化, GA3/CTK、GA3/ABA和GA3/IAA升高促進花瓣原基、雄雌蕊原基發育。