四磨湯口服液改善功能性消化不良模型大鼠的作用機(jī)制Δ

符佳，周賽男 （湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院脾胃病科，長沙 410007）

功能性消化不良（functional dyspepsia，F(xiàn)D）是最常見的功能性胃腸疾病之一，以餐后飽脹、上腹部疼痛和上腹部燒灼感為典型癥狀[1]。目前，胃動力障礙被認(rèn)為是FD的病理生理學(xué)特征之一，并與消化不良癥狀密切相關(guān)[2]。雖然促動力藥、抗酸劑和抗抑郁藥可用于治療FD，但其存在副作用和耐藥性，因此開發(fā)新的FD治療藥物成為必要[3]。

四磨湯口服液是根據(jù)明代《痘疹金鏡錄》中四磨湯所研制的一種中藥制劑，由檳榔、烏藥、枳殼、木香組成[4]，主要用于治療消化系統(tǒng)疾病，其作用可能是通過調(diào)節(jié)消化系統(tǒng)的胃腸激素和促進(jìn)平滑肌收縮來促進(jìn)胃腸動力[5]。卡哈爾間質(zhì)細(xì)胞（interstitial cells of Cajal，ICC）是胃腸慢波活動的“起搏器”，通過傳遞興奮性和抑制性信號影響胃腸運(yùn)動，在腸運(yùn)動中發(fā)揮重要作用[6]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，抑制ICC線粒體自噬能夠改善FD模型大鼠線粒體損傷并促進(jìn)其胃動力[7]。PTEN誘導(dǎo)假定激酶1（PTEN-induced putative kinase 1，Pink1）/E3泛素連接酶（E3ubiquitin ligase，Parkin）軸是最經(jīng)典的自噬途徑，Pink1和Parkin之間的相互作用對線粒體自噬的啟動和調(diào)節(jié)至關(guān)重要[8]。四磨湯口服液是否可通過影響Pink1/Parkin軸改善FD尚不明確?；诖耍狙芯拷D模型大鼠，并基于線粒體自噬和Pink1/Parkin軸探討四磨湯口服液對FD模型大鼠的改善作用機(jī)制，以期為臨床治療FD提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

Thermo型熱電FC酶標(biāo)儀購自上海聯(lián)邁生物工程有限公司；VHX-7000N型透射電子顯微鏡購自日本Keyence公司；STELLARIS 5型激光共聚焦顯微鏡購自德國Leica公司；iBright FL1500型凝膠成像系統(tǒng)購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 主要藥品與試劑

四磨湯口服液（國藥準(zhǔn)字Z20025044，批號221026，每1 mL相當(dāng)于飲片0.15 g）購自湖南漢森制藥股份有限公司；多潘立酮片（批號220809，規(guī)格10 mg）購自西安楊森制藥有限公司；胃動素（motilin，MTL）、胃泌素（gastrin，GAS）、膽囊收縮素（cholecystokinin，CCK）酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）檢測試劑盒（批號分別為R38269、R38270、R37102）均購自上海酶研生物科技有限公司；兔源微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubule-associated protein light chain 3，LC3）、p62單克隆抗體和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體及鼠源細(xì)胞色素C氧化酶Ⅳ（cytochrome C oxidase Ⅳ，COX Ⅳ）、Pink1、Parkin單克隆抗體（批號分別為ab128025、ab207305、ab9485、ab33985、ab186303、ab77924）均購自英國Abcam公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號12L026）購自和元李記（上海）生物技術(shù)有限公司；過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗和過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG二抗（批號分別為33116、33101）均購自翌圣生物科技（上海）股份有限公司；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG二抗（批號1041）購自武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司。

1.3 動物

本研究所用動物為SPF級SD雄性大鼠，共90只，6周齡，體重160～180 g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（湘）2019-0004。所有大鼠均飼養(yǎng)在湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科學(xué)實(shí)驗室中，動物使用許可證號為SYXK（湘）2019-0009。飼養(yǎng)環(huán)境的溫度為24～26 ℃，相對濕度為50%～60%。本研究經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實(shí)驗動物倫理委員會批準(zhǔn)后實(shí)施，批準(zhǔn)號為ZYFY20210915。

2 方法

2.1 FD大鼠模型的制備

將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取20只大鼠作為空白組，正常飼養(yǎng)。其余大鼠均采用不可預(yù)知的慢性應(yīng)激法制備FD大鼠模型[9]，每日隨機(jī)選取下述9種刺激之一，且相鄰2 d不重復(fù)：（1）食物剝奪（24 h）；（2）飲水剝奪合并空瓶刺激（12 h）；（3）倒懸（30 min）；（4）束縛（30 min）；（5）夾尾（1 h）；（6）明暗顛倒（24 h）；（7）濕籠飼養(yǎng)（24 h）；（8）超聲刺激（2 h）；（9）強(qiáng)迫游泳（45 ℃，5 min）。連續(xù)刺激21 d。當(dāng)大鼠表現(xiàn)出易怒、行動緩慢、體重增長以及排稀便等癥狀，表明FD模型建立成功[10]。

2.2 動物分組及給藥處理

將造模成功的60只大鼠隨機(jī)分為模型組、陽性對照組、四磨湯組，每組20只。陽性對照組大鼠灌胃3.5 mg/kg多潘立酮片溶液[11]，四磨湯組大鼠灌胃5.4 mL/kg四磨湯口服液（為臨床等效劑量），空白組和模型組大鼠均灌胃等體積生理鹽水，每天1次，持續(xù)14 d。

2.3 樣本采集

末次給藥結(jié)束后，用1%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）麻醉大鼠，然后腹主動脈采血3 mL于離心管中，放置2 h后在4 ℃下以3 000 r/min離心15 min，收集上清液保存于-20 ℃冰箱中備用。每組隨機(jī)選取15只大鼠，斷頸處死后對大鼠進(jìn)行剃毛消毒，無菌條件下解剖并分離胃竇組織，然后每組隨機(jī)挑取5個組織立即置于2.5%戊二醛中固定2 h，另每組取5個組織置于4%多聚甲醛中固定，剩余組織均凍存于-80 ℃冰箱中。

2.4 大鼠血清中胃腸激素的含量檢測

取出“2.3”項下保存的血清，置于冰上溶解，然后按試劑盒說明書方法操作，檢測大鼠血清中胃腸激素MTL、GAS和CCK的含量。

2.5 大鼠胃排空率檢測

采用酚紅含量法進(jìn)行檢測。將每組剩余的5只大鼠禁食18 h，然后灌胃含有0.05%酚紅的1.5%羧甲基纖維素鈉鹽溶液0.5 mL，20 min后麻醉并處死大鼠，取出胃組織。以10 mL的0.1 mol/L碳酸氫鈉溶液沖洗胃組織，收集胃內(nèi)容物并以3 500 r/min離心15 min，收集上清液。使用酶標(biāo)儀在558 nm波長處測定吸光度（A），記為實(shí)測酚紅A。在另外的容器中加入含有0.05%酚紅的1.5%羧甲基纖維素鈉鹽溶液0.5 mL和0.1 mol/L碳酸氫鈉溶液10 mL，攪拌均勻后測定其在558 nm波長處的A，記為標(biāo)準(zhǔn)酚紅A。計算各組大鼠的胃排空率：胃排空率（%）＝（1-實(shí)測酚紅A/標(biāo)準(zhǔn)酚紅A）×100%。

2.6 大鼠小腸推進(jìn)率檢測

在“2.3”項下取出胃組織后，各組大鼠隨機(jī)取5只剪下幽門至回盲部的一段腸道組織，將其置于無菌的玻璃板上，不設(shè)任何牽引力，測量取下的腸管總長以及酚紅溶液自幽門向盲腸推進(jìn)的距離。計算小腸推進(jìn)率：小腸推進(jìn)率（%）＝酚紅溶液自幽門向盲腸推進(jìn)距離/腸管總長×100%。

2.7 大鼠胃竇組織中ICC線粒體結(jié)構(gòu)觀察

將“2.3”項下固定2 h后的胃竇組織沖洗干凈，再以1%鋨酸固定2 h；經(jīng)雙蒸水沖洗后，以乙醇脫水10 min，再以環(huán)氧丙烷孵育20 min后，以Spurr樹脂包埋劑進(jìn)行包埋。采用透射電子顯微鏡觀察并拍照。

2.8 大鼠胃竇組織中COX Ⅳ、Parkin在線粒體中共定位表達(dá)的檢測

采用免疫熒光共定位法進(jìn)行檢測。將“2.3”項下固定于4%多聚甲醛中的胃竇組織取出，進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋和切片（4 μm）；切片經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟水化后，放入抗原修復(fù)液中，于95 ℃下水浴15 min；冷卻至室溫后，以0.5%牛血清白蛋白封閉1 h，加入COX Ⅳ、Parkin一抗（稀釋度為1∶200），4 ℃封閉過夜；加入FITC標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG二抗（稀釋度為1∶500），室溫避光孵育1 h；以磷酸鹽緩沖液清洗后，用含DAPI的抗熒光猝滅封片劑封片；10 min后在激光共聚焦顯微鏡下觀察COX Ⅳ、Parkin的染色情況，并利用Image J軟件分析其共定位表達(dá)的面積。其中，COX Ⅳ抗體標(biāo)記線粒體為紅色，Parkin抗體標(biāo)記Parkin為綠色，DAPI標(biāo)記細(xì)胞核為藍(lán)色；若Parkin進(jìn)入線粒體，則共定位顯示為黃色或橙色。

2.9 大鼠胃竇組織中LC3、p62、Pink1、Parkin蛋白表達(dá)的檢測

采用Western blot法進(jìn)行檢測。將“2.3”項下凍存的胃竇組織取出，加入RIPA裂解緩沖液進(jìn)行勻漿，并在4 ℃下以10 000 r/min離心15 min，取上清液用BCA試劑盒測定其中總蛋白濃度。將100 μg蛋白樣品溶解在溴酚藍(lán)上樣緩沖液中進(jìn)行煮沸變性，然后每孔上樣20 μg進(jìn)行10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并濕轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上。在室溫下用5%脫脂牛奶封閉孵育PVDF膜1 h，加入LC3、p62、Pink1、Parkin、GAPDH一抗（LC3、p62、Pink1稀釋度為1∶1 000，Parkin稀釋度為1∶2 000，GAPDH稀釋度為1∶2 500），4 ℃孵育過夜；洗膜后，加入過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗大鼠IgG二抗（稀釋度為1∶3 000），室溫孵育1 h；以TBST洗滌3次后，在ECL溶液中避光孵育5 min。采用凝膠成像系統(tǒng)成像并拍照，采用Image J軟件進(jìn)行灰度值分析。以目的蛋白與內(nèi)參蛋白（GAPDH）灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)水平；其中LC3在細(xì)胞中以LC3Ⅰ和LC3Ⅱ 2種形式存在，以LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值表示LC3蛋白的表達(dá)水平。

2.10 統(tǒng)計學(xué)方法

采用Graphpad prism 8.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Tukey檢驗。檢驗水準(zhǔn)α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 四磨湯口服液對大鼠血清中MTL、GAS、CCK含量的影響

與空白組比較，模型組大鼠血清中MTL、GAS含量均顯著降低（P＜0.05），CCK含量顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組和四磨湯組大鼠血清中MTL、GAS含量均顯著升高（P＜0.05），CCK含量均顯著降低（P＜0.05）；四磨湯組與陽性對照組比較，上述指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表1。

表1 各組大鼠血清中MTL、GAS、CCK含量測定結(jié)果（±s，n＝20，pg/mL）

表1 各組大鼠血清中MTL、GAS、CCK含量測定結(jié)果（±s，n＝20，pg/mL）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05。

組別空白組模型組陽性對照組四磨湯組CCK 176.82±17.87 246.38±25.10a 206.74±21.63b 201.92±22.51b MTL 238.69±14.68 82.97±6.74a 209.78±12.52b 216.37±13.93b GAS 259.16±18.37 91.68±9.32a 221.07±16.43b 232.25±15.94b

3.2 四磨湯口服液對大鼠胃排空率和小腸推進(jìn)率的影響

與空白組比較，模型組大鼠的胃排空率和小腸推進(jìn)率均顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組和四磨湯組大鼠的胃排空率和小腸推進(jìn)率均顯著升高（P＜0.05）；四磨湯組與陽性對照組比較，上述指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

表2 各組大鼠胃排空率和小腸推進(jìn)率測定結(jié)果（±s，n＝5，%）

表2 各組大鼠胃排空率和小腸推進(jìn)率測定結(jié)果（±s，n＝5，%）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05。

組別空白組模型組陽性對照組四磨湯組胃排空率58.97±3.61 34.16±2.54a 47.62±3.15b 50.31±3.47b小腸推進(jìn)率84.56±6.27 51.63±3.71a 69.12±5.69b 72.84±5.73b

3.3 四磨湯口服液對大鼠胃竇組織中ICC線粒體結(jié)構(gòu)的影響

空白組大鼠ICC形態(tài)和結(jié)構(gòu)清晰，核膜完整，線粒體嵴密度高。與空白組比較，模型組大鼠ICC線粒體數(shù)量減少，線粒體空泡化，線粒體嵴模糊，并在其周圍觀察到大量自噬溶酶體。與模型組比較，陽性對照組和四磨湯組大鼠ICC線粒體結(jié)構(gòu)逐漸恢復(fù)，線粒體嵴清晰，自噬溶酶體減少。結(jié)果見圖1。

3.4 四磨湯口服液對大鼠胃竇組織中COX Ⅳ、Parkin共定位表達(dá)的影響

與空白組[（354.52±31.68） μm2]比較，模型組大鼠胃竇組織中COX Ⅳ、Parkin在線粒體中的共定位表達(dá)面積[（1 258.97±72.94） μm2]顯著增大（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組和四磨湯組大鼠胃竇組織中COX Ⅳ、Parkin在線粒體中的共定位表達(dá)面積[分別為（483.54±38.64）、（465.76±35.47） μm2]均顯著減小（P＜0.05）。四磨湯組與陽性對照組比較，上述指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見圖2。

圖2 各組大鼠胃竇組織中COX Ⅳ、Parkin共定位表達(dá)的觀察結(jié)果

3.5 四磨湯口服液對大鼠胃竇組織中LC3、p62、Pink1、Parkin蛋白表達(dá)的影響

與空白組比較，模型組大鼠胃竇組織中LC3、Pink1、Parkin蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05），p62蛋白表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，陽性對照組和四磨湯組大鼠胃竇組織中LC3、Pink1、Parkin蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.05），p62蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P＜0.05）；四磨湯組與陽性對照組比較，上述指標(biāo)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見圖3、表3。

圖3 各組大鼠胃竇組織中LC3、p62、Pink1、Parkin蛋白表達(dá)的電泳圖

表3 各組大鼠胃竇組織中LC3、p62、Pink1、Parkin蛋白表達(dá)水平測定結(jié)果（±s，n＝5）

表3 各組大鼠胃竇組織中LC3、p62、Pink1、Parkin蛋白表達(dá)水平測定結(jié)果（±s，n＝5）

a：與空白組比較，P＜0.05；b：與模型組比較，P＜0.05。

組別空白組模型組陽性對照組四磨湯組LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ0.94±0.06 1.65±0.12a 1.16±0.08b 1.13±0.07b p62/GAPDH 1.08±0.06 0.37±0.02a 0.81±0.05b 0.85±0.06b Pink1/GAPDH 0.97±0.07 1.72±0.14a 1.20±0.09b 1.17±0.08b Parkin/GAPDH 1.02±0.07 1.79±0.12a 1.26±0.08b 1.23±0.08b

4 討論

FD是一種胃腸道運(yùn)動障礙綜合征，其臨床癥狀包括慢性上腹部疼痛和不適。FD的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，包括胃和十二指腸的功能性運(yùn)動障礙、心理壓力以及不良飲食習(xí)慣等[12]。如果沒有及時治療，F(xiàn)D可能發(fā)展為消化性潰瘍或胃癌。目前，針對FD癥狀的治療方法主要包括飲食調(diào)節(jié)、藥物治療和心理治療[13]。長期以來，傳統(tǒng)中醫(yī)理論被廣泛用于功能性胃腸疾病的初始治療[14]。在中醫(yī)上，根據(jù)FD癥狀特點(diǎn)，可將其歸屬于“痞滿、胃脹”范疇，多從健脾益氣、疏肝消痞角度用藥，療效優(yōu)勢明顯[15]。本研究通過不可預(yù)知的慢性應(yīng)激法建立FD大鼠模型來探討四磨湯對FD的作用。結(jié)果顯示，模型組大鼠的胃排空率和小腸推進(jìn)率較空白組降低，表明模型大鼠制備成功。四磨湯口服液給藥后，大鼠的胃排空率和小腸推進(jìn)率較模型組升高。這表明四磨湯口服液可改善FD模型大鼠的胃腸動力。

MTL、GAS是廣泛分布在胃腸道的胃腸激素。MTL是一種能刺激胃腸平滑肌的活性肽，能促進(jìn)胃蛋白酶的分泌，提高胃排空率，縮短食物在小腸中的時間；GAS由十二指腸黏膜和胃竇的G細(xì)胞分泌，可以調(diào)節(jié)胃腸蠕動，促進(jìn)胃排空，并刺激胃酸分泌[16]。CCK是一種腦腸肽，在攝入含有高脂肪或蛋白質(zhì)的食物時，由小腸上部的I細(xì)胞釋放。而有研究報道，CCK拮抗劑加速了胃排空率，這可能有益于FD患者的恢復(fù)[17]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中MTL、GAS含量低于空白組，CCK含量高于空白組；而陽性對照組和四磨湯組大鼠血清中MTL、GAS含量較模型組升高，CCK含量較模型組降低。這表明四磨湯口服液可促進(jìn)FD模型大鼠血清中胃腸激素MTL、GAS的分泌，抑制腦腸肽CCK的釋放，進(jìn)而加速胃排空，促進(jìn)胃腸運(yùn)動。

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，ICC中自噬的過度激活以及線粒體形態(tài)和結(jié)構(gòu)的異?？蓪?dǎo)致胃腸節(jié)律紊亂[18]。Pink1和Parkin是參與調(diào)節(jié)自噬的2個關(guān)鍵分子。線粒體的去極化阻斷了Pink1的轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致Pink1在線粒體膜上積累，然后促進(jìn)Parkin磷酸化并使其從細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)募集到線粒體外膜上，從而觸發(fā)線粒體自噬[19]。線粒體呼吸鏈上的COX主要包含4個酶復(fù)合體（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），其中COX Ⅳ是COX中的關(guān)鍵亞型，對線粒體呼吸鏈的裝配與功能至關(guān)重要，其表達(dá)正常與否可以影響整條呼吸鏈的功能狀態(tài)以及細(xì)胞的能量生成[20]。本研究通過檢測COX Ⅳ、Parkin在線粒體中共定位表達(dá)發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠胃竇組織中COX Ⅳ、Parkin在線粒體中的共定位表達(dá)升高，表明模型組大鼠Pink1/Parkin軸被激活。p62的功能是連接受損的線粒體和線粒體溶酶體，其中線粒體溶酶體是由線粒體吞噬體和溶酶體融合形成，可介導(dǎo)受損線粒體的降解[21]。LC3蛋白在自噬體的形成中也起著關(guān)鍵作用，其包含Ⅰ型和Ⅱ型，LC3Ⅰ蛋白的含量與自噬活動密切相關(guān)[22]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠胃竇組織中Pink1、Parkin及LC3蛋白的表達(dá)均升高，p62的表達(dá)降低；而陽性對照組和四磨湯組大鼠胃竇組織中Pink1、Parkin、LC3蛋白的表達(dá)均降低，p62蛋白表達(dá)均升高。這表明四磨湯口服液可抑制Pink1/Parkin軸，阻斷自噬，進(jìn)而改善大鼠FD。

綜上所述，四磨湯口服液可改善FD模型大鼠的胃腸動力和胃腸激素水平，其作用機(jī)制可能與抑制Pink1/Parkin軸、阻斷自噬有關(guān)。