UPLC法同時測定復(fù)方龍膽碳酸氫鈉片中10種大黃蒽醌類成分及土大黃苷的含量Δ

陳學(xué)艷 ，魏文芝 ，張敏娟 ，張耀元 ，阿玉梅 ，彭雙 [1.青海省藥品檢驗檢測院，西寧 810016；2.國家藥品監(jiān)督管理局中藥（藏藥）質(zhì)量控制重點實驗室，西寧 810016；3.青海省中藏藥現(xiàn)代化研究重點實驗室，西寧 810016]

復(fù)方龍膽碳酸氫鈉片是由碳酸氫鈉、龍膽膏（粉）、大黃膏（粉）、丁香油、薄荷油與適量輔料組成的中西藥復(fù)方制劑，主要用于肝胃不和所致的胃脹反酸作痛、積食停滯、食欲不振、消化不良等癥的治療。組方中的大黃藥材始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，為蓼科植物掌葉大黃RheumpalmatumL．、唐古特大黃R.tanguticumMaxim.ex Balf.或藥用大黃R.officinaleBaill.的根和根莖，具有瀉下攻積、清熱瀉火、利濕退黃之功效[1]。大黃中蒽醌類物質(zhì)主要為大黃素型蒽醌，其在腸內(nèi)親和力高，可調(diào)節(jié)腸道蠕動，對胃腸道疾病有良好的療效[2]。

據(jù)統(tǒng)計，2020年版《中國藥典》（一部）中收載的150余個含大黃的復(fù)方制劑中，大黃的質(zhì)量控制多采用顯微、薄層色譜、高效液相色譜法；土大黃苷作為偽品大黃中的特征性成分，在大黃和大黃流浸膏中均不得檢出[3]。本課題組前期采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS/MS）法測定了來自8家生產(chǎn)企業(yè)的45批次復(fù)方龍膽碳酸氫鈉片，結(jié)果在10批次樣品中檢出了土大黃苷，檢出率達(dá)22%[4]。因此，亟須建立一種高效的檢測方法以控制含大黃制劑的質(zhì)量。當(dāng)采用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)時，由于中成藥成分復(fù)雜，直接進(jìn)樣容易導(dǎo)致質(zhì)譜污染，致使檢測結(jié)果出現(xiàn)假陽性，并且高效液相色譜法分析時間長、溶劑消耗量大，不利于大批量及應(yīng)急樣品的快速檢測[5—6]。鑒于此，本研究建立了UPLC法，并用該法同時測定了復(fù)方龍膽碳酸氫鈉片中大黃素、大黃酸、大黃酚、蘆薈大黃素、大黃素甲醚、蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷共10種發(fā)揮主要藥理作用且含量較高的大黃蒽醌類成分以及偽品特征成分土大黃苷的含量，從而實現(xiàn)土大黃苷的快速篩查及大黃蒽醌類成分的準(zhǔn)確測定，為含大黃復(fù)方制劑的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器包括AcQuity型UPLC儀（美國Waters公司），BS224S型萬分之一電子天平、CP225D型十萬分之一電子天平（德國Sartorius公司），KQ-500DE型數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司），Milli-Q型超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

40批復(fù)方龍膽碳酸氫鈉片來自國內(nèi)8家藥品生產(chǎn)企業(yè)，每家企業(yè)的樣品均有5個批次（樣品編號從a1～a5至h1～h5，批號略），處方中大黃以大黃粉或大黃膏的形式投料，均相當(dāng)于大黃原生藥50 mg/片。對照品大黃素（批號110756-201512，純度98.7%）、大黃酸（批號110757-201607，純度99.3%）、大黃酚（批號110796-201621，純度99.2%）、蘆薈大黃素（批號110795-201710，純度98.3%）、大黃素甲醚（批號110758-201616，純度99.0%）、土大黃苷（批號110794-201708，供檢查用）均購自中國食品藥品檢定研究院；對照品蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷（批號AF20042706，純度98%）、大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷（批號AF20030303，純度98%）、大黃素-8-O-葡萄糖苷（批號AF20042708，純度98%）、大黃素甲醚-8-Oβ-D-葡萄糖苷（批號AF20042709，純度98%）、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷（批號AF20041628，純度98%）均購自成都埃法生物科技有限公司；乙腈、甲醇均為色譜純，水為純化水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 11種成分的含量測定

2.1.1 對照品溶液的制備

分別精密稱取上述11種對照品適量，分別加少量氯仿溶解后再加甲醇稀釋，制成0.2 mg/mL的單一對照品儲備液。精密量取各單一對照品儲備液適量，加甲醇制成約含各成分10 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備

取本品20片，稱定質(zhì)量，研細(xì)，取約相當(dāng)于大黃原生藥100 mg的細(xì)粉，精密稱定。精密加入甲醇25 mL，稱定質(zhì)量，于25 ℃超聲（功率250 W，頻率40 kHz）提取60 min，放冷至室溫，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.1.3 陰性樣品溶液的制備

按復(fù)方龍膽碳酸氫鈉片的處方比例，制成缺大黃藥材的陰性樣品，按“2.1.2”項下方法制得陰性樣品溶液。

2.1.4 色譜條件

采用Agilent Eclipse Plus C18（3.0 mm×150 mm，1.8 μm）色譜柱，以乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫（0～10 min，20%A→60%A；10～11 min，60%A→80%A；11～15 min，80%A→85%A；15～18 min，85%A→20%A）；流速為0.3 mL/min；檢測波長為254 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為5 μL；檢測時間為20 min。

2.1.5 系統(tǒng)適用性試驗及專屬性考察

取上述混合對照品溶液、陰性樣品溶液和供試品溶液（樣品編號a1、b1、c1、d1、e1、f1、g1、h1）各5 μL，按“2.1.4”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，見圖1。結(jié)果表明，在該色譜條件下，理論板數(shù)均不小于33 820，各色譜峰與相鄰峰的分離度均大于1.5，各成分測定不受其他組分的干擾，并且陰性樣品在11種檢測成分出峰時間處均未出現(xiàn)干擾峰。

圖1 混合對照品、陰性樣品和供試品的UPLC圖

2.1.6 線性關(guān)系考察及檢測限、定量限測定

分別精密吸取“2.1.1”項下11種單一對照品儲備液，以甲醇逐步稀釋制成各成分質(zhì)量濃度均分別約為0.5、1.0、5.0、10.0、20.0 μg/mL的11種混合對照品溶液，其中大黃酚及大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷的線性最高點質(zhì)量濃度放寬至約50.0 μg/mL，土大黃苷放寬至約80.0 μg/mL。按“2.1.4”項下色譜條件進(jìn)樣測定，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、各對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立回歸方程（表1）。結(jié)果表明，各成分在各自檢測的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r≥0.999 3）。

表1 蘆薈大黃素等11種成分的線性關(guān)系考察結(jié)果及檢測限、定量限

另按“2.1.1”項下方法稀釋各成分的單一對照品儲備液，按“2.1.4”項下色譜條件分別進(jìn)樣5～10 μL測定，以信噪比3∶1測得各成分的檢測限；同法分別進(jìn)樣15～25 μL測定，以信噪比10∶1測得各成分的定量限。結(jié)果見表1。

2.1.7 精密度試驗

精密吸取“2.1.1”項下混合對照品溶液5 μL，按“2.1.4”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果顯示，蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、土大黃苷、大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.02%、1.55%、0.61%、0.49%、0.90%、0.74%、1.18%、0.83%、0.86%、0.77%、1.32%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.1.8 重復(fù)性試驗

分別稱取同一批樣品（編號f1）6份，每份0.6 g，精密稱定，置于50 mL具塞錐形瓶中，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.4”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，以外標(biāo)法按峰面積計算樣品含量。結(jié)果顯示，樣品中蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的平均含量分別為0.020 2、0.021 5、0.175 9、0.136 7、0.016 6、0.012 3、0.014 5、0.018 7、0.189 0、0.084 5 mg/g，RSD分別為2.68%、1.72%、2.16%、2.66%、2.93%、2.04%、1.95%、1.55%、1.87%、1.36%（n＝6）。另取樣品（編號a1）同法操作，得樣品中土大黃苷的平均含量為2.891 2 mg/g，RSD為0.83%（n＝6）。上述結(jié)果表明本方法重復(fù)性良好。

2.1.9 穩(wěn)定性試驗

分別取按“2.1.2”項下方法制備的樣品編號為f1和a1的供試品溶液，在室溫下放置0、2、4、8、12、24 h后按“2.1.4”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果顯示，蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷、土大黃苷、大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷、蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.21%、0.82%、1.99%、0.85%、0.77%、0.86%、1.52%、1.21%、0.82%、1.40%、0.83%（n＝6），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.10 加樣回收率試驗

稱取已知含量的樣品（編號f1、a1）各6份，每份0.30 g，精密稱定，分別置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入各成分質(zhì)量濃度約為樣品含量100%的混合對照品溶液，按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.4”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算加樣回收率。結(jié)果顯示，各成分的平均加樣回收率為96.82%～98.92%，RSD均不大于1.74%（n＝6），表明本方法準(zhǔn)確度良好。

2.1.11 樣品含量測定

取各批次樣品適量，分別按“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.4”項下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，以外標(biāo)法按峰面積計算樣品含量。每個樣品測定3次，取平均值。結(jié)果見表2。

表2 40批樣品中10種大黃蒽醌類成分及土大黃苷的含量測定結(jié)果（n＝3，mg/g）

續(xù)表2

2.2 主成分分析

2.2.1 相關(guān)性分析

在進(jìn)行主成分分析前，先利用SPSS 25.0軟件進(jìn)行KMO檢驗和Bartlett檢驗，得KMO值為0.635（＞0.5）提示可以進(jìn)行主成分分析；Bartlett檢驗結(jié)果顯示，P＜0.001，提示各變量間存在顯著的相關(guān)性，可進(jìn)行因子分析及各變量間的共性評價。

2.2.2 特征值和方差貢獻(xiàn)率分析

利用SPSS 25.0軟件對樣品中11個指標(biāo)成分進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見表3。由表3可知，前3個主成分的累計方差貢獻(xiàn)率為95.533%，可反映樣品中11個指標(biāo)成分的大部分信息，因此提取這3個主成分對40批次樣品中11個指標(biāo)成分的含量進(jìn)行綜合分析，進(jìn)而對該復(fù)方制劑進(jìn)行質(zhì)量評價[7—8]。

表3 主成分的特征值、方差貢獻(xiàn)率及累計方差貢獻(xiàn)率

2.2.3 不同生產(chǎn)企業(yè)樣品的綜合評價

采用SPSS 25.0軟件，根據(jù)“成分矩陣”中各主成分對應(yīng)的載荷，選擇菜單中“轉(zhuǎn)換”“計算變量”，得到特征向量，根據(jù)特征向量矩陣建立主成分分析模型。F1、F2、F3為3個主成分的得分，計算公式為：F1＝向量1C1+向量2C2+向量3C3+……向量11C11，其中C1、C2、C3……C11分別為11個指標(biāo)成分標(biāo)準(zhǔn)化后的變量。F2、F3同法計算。以各主成分的方差貢獻(xiàn)率對主成分得分進(jìn)行加權(quán)平均，得到綜合得分（F）：F＝49.704F1+35.905F2+9.924F3，結(jié)果見表4。由表4可知，綜合得分排前3名的分別為d、c、h企業(yè)樣品，表明這3家生產(chǎn)企業(yè)投料用大黃藥材的指標(biāo)成分含量接近，且質(zhì)量較優(yōu)。

表4 8個生產(chǎn)企業(yè)樣品的主成分分值、綜合得分及排序

將40批樣品中11個指標(biāo)成分的含量測定結(jié)果導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，生成二維散點圖，詳見圖2。由圖2可知，40批樣品可分成4類：a和d企業(yè)的樣品分別自成一類，f、b、g、e企業(yè)的樣品為一類，c、h企業(yè)的樣品為一類。

圖2 主成分分析的散點圖

2.3 聚類分析

采用SPSS 25.0軟件，將40批次樣品中11個指標(biāo)成分的含量經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)化處理后，以瓦爾德法、歐氏距離為度量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行聚類分析，輸出垂直方向譜系圖，結(jié)果見圖3。由圖3可知，當(dāng)歐氏距離為14時，40批次樣品可聚為4類：a和d企業(yè)的樣品分別自成一類，f、b、g、e企業(yè)的樣品為一類，c、h企業(yè)的樣品為一類。聚類分析結(jié)果與主成分分析結(jié)果一致。

圖3 8家生產(chǎn)企業(yè)40批次樣品的聚類分析樹狀圖

3 討論

目前，業(yè)界對含大黃的復(fù)方制劑中大黃等多種處方成分的測定多采用高效液相色譜法，該法分析時間較長，約60～80 min。本研究采用小顆粒填料色譜柱（粒徑＜2 μm）結(jié)合超高壓輸液泵（壓力＞105 kPa），可同時測定復(fù)方龍膽碳酸氫鈉片中10種大黃蒽醌類成分及1種偽品特征成分土大黃苷的含量，并可縮短分析時間至20 min，檢測靈敏度高、準(zhǔn)確性良好，可顯著改善色譜峰展寬和拖尾的現(xiàn)象，實現(xiàn)在含大黃的復(fù)方制劑中土大黃苷的快速篩查及大黃蒽醌類成分的準(zhǔn)確測定。同時，本研究考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液等不同流動相系統(tǒng)的洗脫效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇洗脫能力較乙腈弱，且色譜峰較寬影響分離度，存在大黃素-8-O-葡萄糖苷峰與大黃酚-8-O-β-D-葡萄糖苷峰、蘆薈大黃素峰與大黃酸峰不能有效分離的情況；而采用乙腈洗脫時，大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黃素甲醚的色譜峰峰形在以0.1%磷酸溶液為水相時較好，故最終采用乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫。在此流動相系統(tǒng)下，11個成分各相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)均不小于33 820。

本研究分別考察了甲醇體積分?jǐn)?shù)為50%、70%、100%，提取時間為30、60、90 min的樣品提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大黃素甲醚、大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黃素甲醚-8-O-β-D-葡萄糖苷等成分在甲醇體積分?jǐn)?shù)大于70%且提取時間達(dá)30 min時，其含量才能逐漸增加，而提取60 min與提取90 min時的含量無明顯差別。考慮到實際操作的可行性，本研究最終確定了文中提取方法，即采用100%甲醇超聲提取60 min。

本研究應(yīng)用主成分分析法提取的前3個主成分可以概括40批次樣品中11個指標(biāo)成分的大部分信息；利用綜合得分排序，可得到d、c、h企業(yè)樣品的綜合質(zhì)量較優(yōu)。聚類分析和主成分分析結(jié)果一致，均將40批次樣品分為4類：a和d企業(yè)的樣品分別自成一類，c、h企業(yè)的樣品為一類，f、b、g、e企業(yè)的樣品為一類。a企業(yè)的樣品中檢出了偽品特征成分土大黃苷，且未檢出大黃酸和大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷，與其他企業(yè)樣品質(zhì)量差異較大，可判定該企業(yè)使用了偽品大黃投料，樣品質(zhì)量較差。

綜上所述，本研究所建UPLC方法穩(wěn)定、可靠，可用于同時測定復(fù)方龍膽碳酸氫鈉片中10種大黃蒽醌類成分及土大黃苷的含量；結(jié)合主成分分析、聚類分析等化學(xué)計量學(xué)方法，可用于該制劑的質(zhì)量控制。