基于QbD理念的雙葉枇杷顆粒成型工藝優(yōu)化及物理指紋圖譜研究Δ

毛小文 ，顧志榮 ，王園園 ，葛斌 #（.甘肅中醫(yī)藥大學藥學院，蘭州 730000；.甘肅省人民醫(yī)院藥劑科，蘭州 730000）

雙葉枇杷飲是甘肅省人民醫(yī)院用于治療痤瘡的臨床經(jīng)驗方，全方由桑葉、枇杷葉、酒黃芩、牡丹皮、地黃、枳殼、甘草7味中藥組成，具有清肺泄熱、涼血消痤的功效。該方療效顯著、安全性好，本課題組擬將其開發(fā)成顆粒劑，以便臨床使用。中藥顆粒劑的吸濕性、溶化率、流動性等物理屬性是關乎其運輸、儲存及最終質量的關鍵參數(shù)。質量源于設計（quality by design，QbD）理念目前被廣泛用于工藝研發(fā)控制，其從原料藥性質和工藝屬性參數(shù)著手，將源頭藥物、處方設計、工藝屬性參數(shù)與質量監(jiān)管相結合用作生產(chǎn)規(guī)范，以提高藥品質量[1]。本研究以QbD理念為指導，通過單因素實驗、熵權法結合Box-Behnken響應面設計，以總黃酮保留率、吸濕率（H）、溶化率、休止角（α）和成型率為指標對雙葉枇杷顆粒進行客觀評價，優(yōu)化該顆粒的成型工藝；并通過相對均齊度（Iθ）、水分（HR）、H、豪斯納比（IH）、α、松密度（Da）、振實密度（Dc）和孔隙率（Ie）共8個二級物理指標對該顆粒的均一性、穩(wěn)定性、流動性、堆積性及可壓性進行綜合表征，評價該顆粒工藝的一致性，以期為雙葉枇杷顆粒的工業(yè)化生產(chǎn)及質量控制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

UV8100A型紫外-可見分光光度計購自北京萊伯泰科儀器有限公司；YC-1000型實驗室噴霧制粒包衣機購自上海雅程儀器設備有限公司；BT125D型萬分之一電子天平購自賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；DHG-9140A型電熱鼓風干燥箱購自上海一恒科學儀器有限公司；DD-5M型低速離心機購自湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

桑葉、枇杷葉、酒黃芩、牡丹皮、地黃、枳殼、甘草7味中藥飲片由甘肅隴脈藥材有限公司提供，經(jīng)甘肅省人民醫(yī)院藥劑科鄭修麗主任中藥師鑒定為真品，各指標均符合2020年版《中國藥典》（一部）相關規(guī)定。蘆丁對照品（批號CHB201103，純度≥98%）購自成都克洛瑪生物科技有限公司；可溶性淀粉（批號20200416）購自上海賢鼎生物科技有限公司；微晶纖維素（批號20221026）購自上海源葉生物科技有限公司；甲基纖維素（批號20211022）購自蘭州天弘益華生物科技有限公司；麥芽糊精（批號20211015）購自廣州新如榮生物科技有限公司；羧甲基纖維素鈉（批號20210311）購自上海邁瑞爾生化科技有限公司；甘露醇（批號21081602）購自湖南新綠方藥業(yè)有限公司。

2 方法與結果

2.1 雙葉枇杷顆粒干浸膏粉的制備

參考本課題組前期優(yōu)化的提取工藝進行制備：稱取桑葉10 g、枇杷葉10 g、酒黃芩10 g、牡丹皮10 g、地黃15 g、枳殼10 g、甘草5 g，加純化水至沒過飲片，浸泡1 h；再加14倍量純化水，以武火加熱至沸騰后，采用文火煎煮提取，每次提取1 h，重復提取3次；合并3次提取液，用300目尼龍篩趁熱濾過，將煎煮液濃縮至一定體積并定容于250 mL容量瓶中，經(jīng)噴霧干燥后，得干浸膏粉24.26 g（得率為34.66%）。

2.2 雙葉枇杷顆粒的制備

經(jīng)前期研究，取“2.1”項下的干浸膏粉，與輔料以1∶1（m/m）的比例過80目篩混合均勻，以乙醇為潤濕劑制軟材，過20目篩制粒，于65 ℃下干燥，整粒，即得。

2.3 評價指標的測定方法

（1）總黃酮保留率：總黃酮在雙葉枇杷顆粒中含量占比最高，對評價顆粒內部活性成分的變化具有重要意義。本研究參考文獻[2]，采用硝酸鋁顯色法測定雙葉枇杷顆粒中總黃酮的含量，并計算總黃酮保留率，總黃酮保留率（%）＝雙葉枇杷顆粒制粒后總黃酮含量/雙葉枇杷顆粒制粒前總黃酮含量×100%。（2）成型率：按2020年版《中國藥典》（四部）通則“0982”中的“雙篩分法”進行測定[3]。將制備好的雙葉枇杷顆粒稱重（W過篩前），收集能過一號篩（10目）但不能過五號篩（80目）的顆粒并稱重（W過篩后），然后計算成型率，成型率（%）＝W過篩后/W過篩前×100%。（3）Da：取上述合格顆粒5.0 g（W），緩慢倒入25 mL量筒中，讀取顆粒體積（V0），計算Da，具體公式為Da＝W/V0。（4）Dc：將上述在量筒中待測的顆粒以2 s/次的頻率上下重復振搖200次，讀取顆粒體積（V1），計算Dc，具體公式為Dc＝W/V1。（5）IH：具體公式為IH＝Dc/Da。（6）Ie：具體公式為Ie＝（Dc-Da）/（Dc×Da）。（7）α：參考文獻[4]，采用固定漏斗法進行測定。取半徑（r）為3.2 cm的表面皿放置于水平的桌面上，且中心與上方漏斗呈垂直狀態(tài)，將“（2）”項下的顆粒緩慢倒入漏斗使其自然流下，當漏斗下方顆粒與表面皿邊緣重合時，測定錐體高度（h），并計算α，具體公式為α＝arctan（h/r）。（8）Iθ：將“（2）”項下的合格顆粒按順序分別過二、三、四、七、八、九號篩，振蕩5 min，分別記錄每個篩網(wǎng)截留的顆粒質量。取平均孔徑分別為0.603、0.303、0.188、0.108、0.083 mm的篩網(wǎng)截留的顆粒，并計算Iθ，具體公式參考文獻[5]。（9）H：參考文獻[6]，將稱量瓶（蓋打開）置于室溫下、相對濕度為75%、底部盛有過飽和NaCl溶液的干燥器中平衡24 h，取“（2）”項下的顆粒2 g（W1）置于平衡后的扁平稱量瓶（蓋打開）中，平鋪使厚度約為2 mm，吸濕平衡待其質量不變，稱定質量（W2），并計算H，具體公式為H＝（W2-W1）/W1。（10）溶化率：參考文獻[7]，取“（2）”項下的顆粒5 g（W總），置于干燥恒重的50 mL離心管中，加100 mL熱水在振蕩器上振搖5 min，4 000 r/min離心15 min，棄去上清液，在干燥箱中于65 ℃下烘干至恒重，稱定質量（W殘渣），計算溶化率，具體公式為溶化率（%）＝（W總-W殘渣）/W總。（11）HR：按2020年版《中國藥典》（四部）通則“0832”第三法“減壓干燥法”[3]，取“（2）”項下合格顆粒測定其含水量。

2.4 熵權法客觀賦權

熵權法客觀賦權降低了主觀賦權的人為影響，通過對輔料種類、藥輔比、潤濕劑用量、干燥溫度、干燥時間等客觀存在的不確定性數(shù)據(jù)進行整合，來表征復雜的原始數(shù)據(jù)的信息量[8—9]，具體步驟為：

（1）建立原始數(shù)據(jù)矩陣：現(xiàn)有m個樣本、n個評價指標，原始數(shù)據(jù)矩陣R＝（Xij）m×n，以總黃酮保留率（Y1）、吸濕率（Y2）、溶化率（Y3）、α（Y4）和成型率（Y5）為評價指標，建立原始數(shù)據(jù)矩陣R。Xij表示第i個樣本的第j個指標的測量值。

（2）將原始數(shù)據(jù)轉化為概率矩陣：根據(jù)“公式（1）”將原始數(shù)據(jù)矩陣R轉化為概率矩陣P，Pij表示在第j個指標下第i個樣本的概率。

（3）計算各指標的信息熵和權重系數(shù)：根據(jù)“公式（2）”求得各指標的信息熵（Hj）依次為0.99、0.98、0.98、0.97、0.98，Hj越小代表該指標數(shù)據(jù)的離散程度越高，所提供的信息量就越大，按“公式（3）”求得各指標的權重系數(shù)（Wj）依次為0.13、0.23、0.16、0.30、0.18。

（4）綜合評分的計算：綜合評分為各指標歸一化值與相應指標權重系數(shù)（Wj）乘積的和。

2.5 雙葉枇杷顆粒成型工藝的單因素實驗

本研究考察了輔料種類（可溶性淀粉、微晶纖維素、甲基纖維素、麥芽糊精、可溶性淀粉+麥芽糊精、可溶性淀粉+甘露醇、麥芽糊精+甘露醇、可溶性淀粉+麥芽糊精+甘露醇等）、藥輔比（1∶0.5、1∶0.8、1∶1.0、1∶1.2、1∶1.5，m/m）、潤濕劑（乙醇）質量分數(shù)（80%、85%、90%、95%、100%）、潤濕劑用量（占藥和輔料總量的26%、30%、34%、38%、42%）、干燥溫度（45、55、65、75、85 ℃）、干燥時間（10、20、30、40、50、60 min）等的影響，通過信息熵客觀賦權法進行賦權和綜合評分的計算，最后優(yōu)選輔料種類為可溶性淀粉+麥芽糊精+甘露醇（質量比為1∶1∶1）、藥輔比為1∶1、潤濕劑質量分數(shù)為95%、潤濕劑用量為藥和輔料總量的38%、干燥溫度為65 ℃、干燥時間為30 min。

2.6 Box-Behnken響應面實驗設計優(yōu)化成型工藝參數(shù)

2.6.1 實驗設計

根據(jù)單因素實驗結果，進行Box-Behnken響應面實驗設計，固定輔料為可溶性淀粉+麥芽糊精+甘露醇，潤濕劑（乙醇）質量分數(shù)為95%，以綜合評分為響應值，考察藥輔比（X1）、潤濕劑用量（X2）、干燥溫度（X3）、干燥時間（X4）對雙葉枇杷顆粒成型工藝的影響。具體因素與水平見表1，實驗設計及評價結果見表2。

表1 因素與水平表

表2 Box-Behnken響應面實驗設計及評價結果

2.6.2 模型建立及顯著性分析

采用Design-Expert 12.0.3.0軟件對上述綜合評分數(shù)據(jù)進行多元回歸和二項式分析，建立綜合評分對X1、X2、X3、X4的二次回歸模型方程，得綜合評分（Y）＝0.865 4-0.080 1X1+0.016 7X2-0.000 6X3-0.002 4X4+0.129 7X1X2+0.074 6X1X3-0.041 7X1X4+0.128 5X2X3-0.021 7X2X4+0.139 5X3X4-0.160 2X12-0.218 0X22-0.087 3X32-0.124 7X42，方差分析結果見表3。結果顯示，擬合模型F＝6.880，P＝0.000 4；失擬項F＝5.230，P＝0.062 5（P＞0.05）。這表明所建模型可靠，可用于工藝影響因素的預測與優(yōu)化。其中，一次項X1，交互項X1X2、X2X3、X3X4，二次項X12、、X32、X42對成型工藝具有顯著影響（P＜0.05），其他項影響不顯著。由此可知，4個因素對雙葉枇杷顆粒成型工藝影響程度依次為X1＞X2＞X4＞X3。

表3 Box-Behnken響應面實驗設計的方差分析結果

2.6.3 響應面交互作用影響

根據(jù)回歸方程繪制響應面圖和其投影的等高線圖，投影形狀由圓趨向橢圓并依次降低則表示交互作用由弱變強，具體見圖1。由圖1可知，X1X2、X2X3、X3X4趨向橢圓，交互作用強弱依次為X3X4＞X1X2＞X2X3。該結果表明，藥輔比與95%乙醇用量、干燥溫度與干燥時間的交互作用明顯；其余各交互組未趨向橢圓，交互作用不明顯。預測的最優(yōu)成型工藝為藥輔比為1∶0.77、潤濕劑用量為37%、干燥溫度為59.38 ℃、干燥時間為27.74 min，綜合評分為0.881 9分。

圖1 交互作用對成型工藝綜合評分影響的響應面圖和等高線圖

2.6.4 成型工藝參數(shù)驗證

為便于實際操作并結合實際生產(chǎn)條件，將成型工藝參數(shù)調整為藥輔比1∶0.8、潤濕劑（95%乙醇）用量37%、干燥溫度59 ℃、干燥時間28 min。按上述最優(yōu)條件制備10批（編號S1～S10）雙葉枇杷顆粒，取其中3批進行驗證實驗。結果顯示，驗證實驗的平均綜合得分為0.879 6分，與模型預測值（0.881 9分）的RSD為1.97%（n＝3），可見所建立的模型可用于雙葉枇杷顆粒成型工藝優(yōu)選，模型準確可靠，成型工藝重現(xiàn)性好。

2.7 雙葉枇杷顆粒的物理指紋圖譜分析

2.7.1 物理質量指標轉換

取10批雙葉枇杷顆粒，測定其8個二級物理指標，將測量值進行標準化轉換，轉換方法參考文獻[10—11]，選擇5個批次樣品（S1～S5）進行轉換結果展示，見表4。

表4 物理指紋圖譜測定指標的轉換結果（部分）

2.7.2 物理指紋圖譜的建立及相似度分析

以“2.7.1”項下測量值標準化轉換結果繪制雷達圖，展示各批次雙葉枇杷顆粒的物理指紋圖譜，并以二級物理指標標準值的平均值繪制雷達圖，作為雙葉枇杷顆粒的對照物理指紋圖譜，結果見圖2。進一步采用夾角余弦法對10批雙葉枇杷顆粒的物理指紋圖譜及其均值進行相似度分析，結果發(fā)現(xiàn)，10批雙葉枇杷顆粒的物理指紋圖譜與對照物理指紋圖譜的相似度均在0.99以上，表明該顆粒的物理性狀穩(wěn)定、可控。

圖2 10批雙葉枇杷顆粒的物理指紋圖譜

3 討論

本研究基于QbD理念，以總黃酮保留率、成型率、H、α等為評價指標，采用熵權法結合Box-Behnken響應面設計優(yōu)化雙葉枇杷顆粒的成型工藝。單因素實驗時，筆者對輔料種類、藥輔比、潤濕劑（乙醇）質量分數(shù)及用量、干燥溫度和干燥時間進行了考察，確定輔料為可溶性淀粉+麥芽糊精+甘露醇，潤濕劑（乙醇）質量分數(shù)為95%。進一步采用Box-Behnken響應面實驗設計優(yōu)化藥輔比、潤濕劑用量、干燥溫度、干燥時間。結果顯示，最優(yōu)成型工藝為藥輔比1∶0.8，95%乙醇用量37%，干燥溫度59 ℃，干燥時間28 min。

中藥顆粒物理指紋圖譜是對顆粒物理屬性更深層次的挖掘，通常基于均一性、穩(wěn)定性、流動性、堆積性等4個一級物理指標（對應的二級物理指標為Iθ、HR、H、IH、α、Da、Dc、Ie）建立指級圖譜，并與實際生產(chǎn)工藝相結合用于評價不同批次的顆粒質量，是基于QbD理念更深層次的表征。結果顯示，10批雙葉枇杷顆粒的物理指紋圖譜與對照物理指紋圖譜的相似度均在0.99以上。

綜上所述，本研究所優(yōu)化的成型工藝穩(wěn)定可行，以此工藝制得的雙葉枇杷顆粒的物理性狀穩(wěn)定、可控。