基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的中藥防治缺血性腦卒中的研究進展

劉躍 王佳樂 黃文韜 趙程龍 馮琦 于文霞 翟鳳國

腦卒中又稱中風(fēng)，分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，在臨床上絕大部分的腦卒中屬于缺血性腦卒中。近年來缺血性腦卒中在我國的發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]，且發(fā)病群體逐漸趨于年輕化，當(dāng)代年輕人的生活壓力是該疾病的主要誘發(fā)因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，中藥能夠防治缺血性腦卒中，具有療效好、不良反應(yīng)少等優(yōu)勢[2]，但因中藥成分繁多、作用機制復(fù)雜，故很難準(zhǔn)確定位其有效成分和治療靶點，而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以預(yù)測中藥有效成分對疾病靶點及通路的影響，因此可用來輔助篩選防治缺血性腦卒中的中藥及其有效成分，定位疾病關(guān)鍵治療靶點。

早在1999 年，我國李梢[3]就提出了中藥與生物分子網(wǎng)絡(luò)之間互相關(guān)聯(lián)的假說。在2007 年，英國藥理學(xué)家Hopkins[4]首次提出“網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)”一詞。2011 年李梢[5]又提出了“網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)”這一名詞，并指出網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的核心就是“網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)”。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可以實現(xiàn)“中藥-成分-靶點-疾病”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)圖，以“網(wǎng)絡(luò)”為核心，運用大量的數(shù)據(jù)庫和生物信息技術(shù)手段，篩選藥物的有效成分和疾病的靶點信息，經(jīng)過VENNY 線上平臺篩選出兩者的交叉靶點，使用Cytoscape 軟件構(gòu)建“中藥有效成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，進行基因本體論（GO）富集分析和京都基因與基因組百科全書數(shù)據(jù)庫（KEGG）富集分析，篩選潛在的相關(guān)靶點和作用通路[6]。基于以上研究背景，我們將重點概述網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在單味中藥以及復(fù)方中藥防治缺血性腦卒中的研究進展。

1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在單味中藥防治缺血性腦卒中的應(yīng)用

1.1 梔子

1.1.1 中藥有效成分研究 孫瑜等[7]使用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫及分析平臺（TCMSP 數(shù)據(jù)庫）檢索“梔子（Gardenia jasminoides Ellis）”，并設(shè)置類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18、口服生物利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%，篩選出17 個有效活性成分。使用Cytoscape 軟件構(gòu)建有效成分-缺血性腦卒中疾病靶點網(wǎng)絡(luò)圖，共獲得94 個節(jié)點，237 個關(guān)系，經(jīng)拓撲分析后得出梔子中共有12 個核心有效成分可用于治療缺血性腦卒中，其中包括槲皮素、山奈酚和梔子苷等有效成分。趙唯宇等[8]在實驗研究中證明，槲皮素可通過抑制炎癥因子白細胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）、白細胞介素-6（Interleukin-6，IL-6）改善小鼠腦卒中的程度。鄭紅麗等[9]研究發(fā)現(xiàn)，山奈酚通過抗氧化、抗炎、抑制凋亡三種途徑對缺血性腦卒中的神經(jīng)元發(fā)揮保護作用。研究表明梔子苷也可有效治療心腦血管疾病[10]，吳杰[11]在實驗中證明，黃芪苷與梔子苷聯(lián)用可以保護損傷的神經(jīng)元細胞，也可通過抑制小膠質(zhì)細胞的M2 極化間接保護神經(jīng)元細胞。此外，丁嵩濤等[12]實驗研究表明，梔子苷通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)的一氧化氮合酶（NOS）活性，促進NO 生成的正常水平，并表現(xiàn)出抗凋亡的作用，保護血管內(nèi)皮細胞，從而起到預(yù)防腦卒中的效果。

1.1.2 有效成分靶點與疾病靶點研究 孫瑜等[7]通過檢索大量的疾病數(shù)據(jù)庫得到4 409 個缺血性腦卒中的相關(guān)靶點，經(jīng)Venny2.1 繪圖工具繪制韋恩圖可知梔子中潛在的活性成分靶點與缺血性腦卒中相關(guān)的靶點有80 個。在PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中，按照degree 值排序，前6 位的靶點為血管內(nèi)皮生長因子A（Vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、G1/S-特異性周期蛋白D1（cyclin D1）、MYC 基因、胱天蛋白酶3（Caspase3，CASP3）、絲裂原活化蛋白激酶3（Mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、表皮生長因子受體（Epithe-lial growth factor receptor，EGFR）。VEGFA 具有促進新生血管的形成及增加血管通透性的作用，王富明[13]在實驗研究中發(fā)現(xiàn)，藥物和針刺治療可通過下調(diào)VEGFA 的表達而改善大鼠腦部缺血、缺氧造成的損傷。

1.1.3 GO 功能分析和KEGG 通路分析 孫瑜等[7]通過Metascape 平臺進行GO 功能分析得出，梔子防治缺血性腦卒中時涉及細胞對激素的反應(yīng)、對酮的反應(yīng)以及凋亡信號通路等，其主要功能為轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、激酶結(jié)合等生物學(xué)過程，參與這些過程的細胞組分有膜筏、轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物等；KEGG 富集分析結(jié)果表明梔子治療缺血性腦卒中的通路主要有核因子κB（Nuclear factor kappa-B，NF-κB）、血小板活化、液體剪切力、MAPK 信號通路、動脈粥樣硬化，其中NF-κB 是一種蛋白復(fù)合物，其控制轉(zhuǎn)錄的DNA、細胞因子產(chǎn)生和細胞存活。楊華等[14]實驗研究證明，丹參酮ⅡA 通過降低NF-κB 表達而減輕大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞的炎癥損傷；馮曼莎等[15]研究顯示，降低血小板的活化率和黏附率可使大腦中動脈血液流量增加，改善大腦微循環(huán)，對腦組織有保護作用；孫飛一等[16]通過患者的調(diào)查、資料的整理以及圖像與數(shù)據(jù)的分析得出，動脈粥樣硬化斑塊是缺血性腦卒中的危險因素之一，預(yù)防斑塊的形成也是預(yù)防該疾病的一種有效途徑。

梔子中的有效成分可以通過抗氧化、抗炎、抑制凋亡三種途徑防治缺血性腦卒中；通過構(gòu)建“中藥有效成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)梔子有效成分可通過VEGFA 減輕腦缺血再灌注損傷，血小板活化率、動脈粥樣硬化程度和NF-κB 信號通路與缺血性腦卒中有關(guān)。

1.2 漏蘆

1.2.1 中藥有效成分研究 李媛媛等[17]使用TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索“漏蘆（Rhaponticum uniflorum（L.）DC.）”，并設(shè)置DL ≥0.18、OB ≥30%，篩選出5 種有效活性成分，包括β-谷甾醇、甘草素、谷甾醇、甘草苷、黃獨素B。陳元堃等[18]研究指出，β-谷甾醇具有抗炎、抗氧化、抗動脈粥樣硬化以及對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有一定的保護作用。Choi 等[19]在研究中發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可以使蒙古沙鼠受損傷的腦血管再生，令沙鼠恢復(fù)一定的運動能力。

1.2.2 有效成分靶點與疾病靶點研究 李媛媛等[17]以“ischemic stroke”為檢索詞在疾病數(shù)據(jù)庫中檢索，獲得1 026 個與缺血性腦卒中相關(guān)的靶點信息，漏蘆活性成分的相關(guān)靶點信息有375 個，經(jīng)過VENNY 線上平臺篩選出118 個漏蘆可以防治缺血性腦卒中的靶點。在PPI 網(wǎng)絡(luò)圖中，degree 值排行前5 位的靶點為白蛋白（Albumin，ALB）、IL-6、腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor，TNF）、CASP3、MAPK1。Zhang 等[20]研究指出，低ALB 血癥的患者腦卒中發(fā)生率高于常人，ALB 通過抑制血小板活化，改善腦血管微循環(huán)，從而達到神經(jīng)保護作用。TNF、IL-6都是強有力的促炎因子，可以直接參與炎癥反應(yīng)過程，加重腦組織損傷。肖東芳等[21]研究表明，IL-6和TNF-α 水平與缺血性腦卒中的嚴(yán)重程度成正比。

1.2.3 GO 功能分析和KEGG 通路分析 李媛媛等[17]通過DAVID 數(shù)據(jù)庫進行GO 功能分析，依據(jù)P<0.05選取相關(guān)生物過程。GO 分析集中細胞生物過程包括一氧化氮生物合成過程的正向調(diào)控、藥物的反應(yīng)等。與細胞組成相關(guān)的條目有30 個，主要包括細胞外間隙、細胞質(zhì)等。涉及分子功能的靶點包括酶結(jié)合、蛋白結(jié)合等。KEGG 分析顯示，漏蘆治療缺血性腦卒中的通路主要有TNF 信號通路、低氧誘導(dǎo)因子-1（Hypoxia inducible factor-1，HIF-1）信號通路、Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）信號通路。HIF-1 有兩個亞型即HIF-1α 和HIF-1β。有研究指出，當(dāng)細胞輕度缺氧時，HIF-1 會抑制細胞凋亡，保護細胞存活，當(dāng)細胞長時間處于缺氧狀態(tài)，HIF-1 會誘導(dǎo)細胞凋亡，從而保護正常細胞[22]。TLR 家族中成員眾多，其亞型TLR4 對缺血性腦卒中的炎癥反應(yīng)起到調(diào)控作用。黎艷等[23]的實驗表明，通過給大鼠灌胃薯蕷皂苷元，可以下調(diào)TLR4，使TNF-α 和IL-6 的水平降低，從而抑制腦組織炎癥反應(yīng)的進展，保護受損的腦神經(jīng)。

β-谷甾醇可有效防治缺血性腦卒中。ALB、TNF、IL-6 的表達在缺血性腦卒中發(fā)揮重要作用，構(gòu)建“中藥有效成分-靶點-疾病”網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)TLR4 信號通路可通過調(diào)控TNF-α、IL-6 的表達，對腦缺血的神經(jīng)起到保護作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在單味藥防治缺血性腦卒中的應(yīng)用見表1。

表1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在單味中藥防治缺血性腦卒中的應(yīng)用

2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在復(fù)方中藥防治缺血性腦卒中的應(yīng)用

2.1 黃芪-川芎

2.1.1 中藥有效成分研究 陳紅陽等[24]通過TCMSP數(shù)據(jù)庫對“黃芪（Astragalus membranaceus（Fisch.）Bunge）”和“川芎（Ligusticum chuanxiong Hort.）”進行有效成分檢索，設(shè)置條件OB ≥30%、DL ≥0.18、Caco-2 ≥-0.4、血腦屏障（BBB）≥-0.3、HL ≥4h，篩選后得到黃芪11 個有效活性成分，包括黃芪甲苷、丁子香萜、梔子醇、聯(lián)苯雙酯等。川芎6 個有效活性成分包括谷甾醇、楊梅酮、川芎嗪等。Li 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷可以抑制信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白3（Signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）的表達，從而抑制小鼠腦缺血急性期NK細胞的活化，對急性腦缺血損傷有保護作用。于迎春等[26]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的手段說明了川芎嗪治療缺血性腦卒中的分子機制。在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的理論基礎(chǔ)上同時有動物實驗證實了川芎嗪對腦缺血的神經(jīng)具有保護作用[27]。

2.1.2 有效成分靶點與疾病靶點研究 陳紅陽等[24]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪、川芎治療缺血性腦卒中的潛在靶點有97 個。通過檢索OMIM、TDD 等疾病數(shù)據(jù)，檢索出393 個治療該疾病的相關(guān)靶點。將這兩類靶點進行對比，篩選出18 個共同靶點。構(gòu)建PPI 蛋白網(wǎng)絡(luò)，其中節(jié)點連接的邊數(shù)越多表示在該疾病中越重要。其中較重要的蛋白靶點包括血管生成素1（Angiopoietins 1，ANGPT1）、CASP3、NOS3、IL-6、TNF、IL-10、IL-1β 等。內(nèi)皮細胞NOS3 是NOS 的一種亞型，NOS3 的多肽位點可使其表達下調(diào)從而減少NO 的生成。朱殊等[28]研究發(fā)現(xiàn)，NOS3 與缺血性腦卒中的發(fā)病有關(guān)，并且TT 型基因患病風(fēng)險高于GG 型基因。ANGPT1 在大腦中的星形膠質(zhì)細胞中表達，ANGPT1 的血管再生及抗炎作用可能有助于保護缺血后的腦神經(jīng)。Du 等[29]研究表明，ANGPT1 通過與內(nèi)皮細胞密切接觸的星形膠質(zhì)細胞調(diào)節(jié)缺血性腦卒中的神經(jīng)損傷。

2.1.3 GO 功能分析和KEGG 通路分析 有研究[23]對治療缺血性腦卒中的潛在靶點進行GO 富集分析，主要涉及NOS 活性調(diào)節(jié)、蛋白激酶B 信號的正調(diào)控、VEGF 的正調(diào)控等生物過程。參與的細胞組成主要包括細胞外間隙、質(zhì)膜等。涉及的分子功能主要包括細胞因子活性、生長因子活性等。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，黃芪-川芎治療缺血性腦卒中參與的通路主要包括HIF-1 信號通路、TNF 信號通路、磷脂酰肌醇3 激酶B（Phosphati.dylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶（Protein kinase B，AKT）信號通路、NOD 樣受體（NLR）信號通路、NF-κB信號通路、Tie 信號通路等。其中，血管生成素-1（Ang-1）和酪氨酸激酶受體-2（Tie-2）是近些年發(fā)現(xiàn)的一種介導(dǎo)血管生長的信號通路，主要表達于內(nèi)皮細胞和造血細胞。劉婷婷等[30]建立局灶性腦缺血大鼠模型后給予模型鼠莫諾苷，發(fā)現(xiàn)Ang-1 和Tie-2 水平均有升高的趨勢，改善了腦部血管的微循環(huán)，在一定程度上保護缺血后腦部損傷的神經(jīng)。此外，張涓等[31]研究顯示，Ang-1 和Tie-2 的表達上調(diào)可以促進血管的新生和神經(jīng)再生。

黃芪甲苷和川芎嗪從不同程度上預(yù)防缺血性腦卒中；NOS3 與缺血性腦卒中的發(fā)病具有相關(guān)性；ANGPT1 在大腦中的表達可以調(diào)節(jié)缺血性腦卒中導(dǎo)致的神經(jīng)損傷；Ang-1/Tie-2 信號通路可促進腦部血管新生，從而治療缺血性腦卒中。

2.2 丹參-紅花

2.2.1 中藥有效成分研究 朱慧淵等[32]利用TCMSP數(shù)據(jù)庫，分別以“丹參（Salvia miltiorrhiza Bunge）”、“紅花（Carthamus tinctorius L.）”為檢索詞進行檢索，設(shè)置條件OB ≥30%、DL ≥0.18，篩選得到紅花22個有效活性成分、丹參65 個有效活性成分，主要包括豆甾醇、黃芩苷、木犀草素、山柰酚、槲皮素等。Sun 等[33]研究發(fā)現(xiàn)豆甾醇對腦缺血再灌注損傷具有神經(jīng)保護作用，其機制是通過磷酸腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）、雷帕霉素靶蛋白（mTOR）和c-Jun氨基末端激酶（JNK）通路增強內(nèi)源性抗氧化防御系統(tǒng)，抑制自噬激活。焦紅蕾[34]實驗表明，山奈酚激活Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路使神經(jīng)生長因子上調(diào)，達到保護腦部神經(jīng)的效果。

2.2.2 有效成分靶點與疾病靶點研究 朱慧淵等[32]通過疾病數(shù)據(jù)庫檢索出1 287 個治療缺血性腦卒中的相關(guān)靶點，丹參、紅花治療該疾病的潛在靶點有253 個，通過VENNY 線上平臺篩選出161 個交集靶點。構(gòu)建PPI 蛋白網(wǎng)絡(luò)，其中較為重要的靶點為CASP3、IL-6、TNF 等。Liu 等[35]研究表明，通過降低CASP3 誘導(dǎo)的組蛋白脫乙酰酶4（HDAC4）降解，可使少量HDAC4 在核內(nèi)積聚，增加肌細胞增強因子2A（MEF2A）轉(zhuǎn)錄水平，促進下游蛋白B 淋巴細胞瘤-xl（Bcl-xl）的表達，抑制細胞凋亡，對缺血性腦損傷具有保護作用。

2.2.3 GO 功能分析和KEGG 通路分析 朱慧淵等[32]使用DAVID 數(shù)據(jù)庫對治療該疾病的潛在靶點GO富集分析得出，主要的生物學(xué)過程包括RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、DNA 轉(zhuǎn)錄和調(diào)控、基因表達的正調(diào)控等。KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，涉及的信號通路主要包括PI3K/AKT、TNF、HIF-1、NF-κB 等。PI3K/AKT 信號通路由PI3K 和下游的AKT 組成。腦缺血發(fā)生后，機體釋放神經(jīng)細胞生長因子、整合素等，使PI3K、AKT 磷酸化，激活PI3K/AKT 信號通路，從而激活凋亡基因發(fā)揮抗凋亡作用[36]。Zhang 等[37]研究發(fā)現(xiàn)SRY-box 轉(zhuǎn)錄因子5 在轉(zhuǎn)錄上調(diào)控VEGF，能與細胞膜上的血管內(nèi)皮生長因子受體（VEGFR）結(jié)合，激活PI3K/AKT 信號通路，逆轉(zhuǎn)缺血性腦卒中引起的神經(jīng)損傷。

豆甾醇和山奈酚可通過不同機制保護腦部神經(jīng)，通過下調(diào)CASP3 的表達，保護大腦皮質(zhì)受損神經(jīng)；PI3K/AKT 信號通路可激活凋亡基因保護腦神經(jīng)；SRY-box 轉(zhuǎn)錄因子5 與VEGFR 結(jié)合進而激活PI3K/AKT 信號通路保護腦神經(jīng)損傷，該通路是防治缺血性腦卒中的一條重要途徑。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在復(fù)方中藥防治缺血性腦卒中的應(yīng)用見表2。

表2 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在復(fù)方中藥防治缺血性腦卒中的應(yīng)用

3 結(jié)論

我國中藥有著幾千年的悠久歷史，是發(fā)現(xiàn)多靶點藥物的源泉。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究策略符合中醫(yī)藥對疾病整體的認識，不僅有利于發(fā)現(xiàn)中藥配伍之間的內(nèi)在聯(lián)系，還為中醫(yī)藥的創(chuàng)新發(fā)展提供依據(jù)。

目前網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已滲入到醫(yī)藥學(xué)領(lǐng)域的多個方面，體現(xiàn)了從傳統(tǒng)模式到現(xiàn)代生物醫(yī)藥模式的轉(zhuǎn)變，并從新的角度來探索中藥的發(fā)展。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)作為基礎(chǔ)，構(gòu)建“中藥-有效成分-靶點-疾病”的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)圖，預(yù)測相關(guān)治療靶點、并建立網(wǎng)絡(luò)靶點與體外、體內(nèi)實驗的相關(guān)性。在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的幫助下，能夠快速地篩查出治療缺血性腦卒中的中藥有效成分及其作用靶點，對中藥防治缺血性腦卒中具有重大意義。