PI3K/Akt 在膝骨關節炎中調控軟骨細胞凋亡的作用機制

陳永洪，顧興科

（宜賓市中西醫結合醫院骨傷科，四川 宜賓 644100）

骨關節炎（osteoarthritis，OA）在退行性關節疾病中占比較大，可損害全身各類關節（如手、膝和髖關節）。迄今為止，針對OA 的醫療難題對于專科醫師而言仍是巨大挑戰，其定義、潛在致病因素和病理生理學研究仍處在進展中[1]。疼痛、短時間晨僵和骨擦音是其主要癥狀，晚期可致關節失穩和肢體殘疾，極大影響患者日常生活。OA 可分為原發性（或特發性）和繼發性（根據公認的病因，如創傷、關節結構手術和出生時關節異常等）。原發性OA 常由聯合風險因素致病，高齡和肥胖是最突出的致病因素[2]，其它危險因素包括膝關節錯位、關節生物力學負荷增加、遺傳以及最近提出的低度全身炎癥[3]。近期研究發現在眾多危險因素作用下，膝關節骨性關節炎（knee osteoarthritis，KOA）在高齡國民群體中的患病率以及發病率均為最高[4]。隨著KOA 相關研究的深入，眾多學者認為KOA不屬于一種膝關節局部病變，而是一種膝關節內軟骨、膝關節囊、膝關節軟骨下骨、膝關節內韌帶、和膝關節內滑膜的整體病變[5]。然而，在KOA 的發生發展眾多環節中，關節內軟骨的損傷及凋亡屬于不可逆性病變，有關軟骨細胞凋亡的病因病理機制至今仍存在爭議[6]。長期以來，雖然眾多學者對KOA 的研究都聚焦在關節軟骨的變化上[7，8]，但是對調控軟骨細胞凋亡的相關因子缺乏重視。近年來，有研究發現[9]，腫瘤細胞眾多增殖、凋亡過程可以被磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylin ositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，別名Akt）信號傳導通路調控，而軟骨細胞的凋亡程序亦可被其調控。這一過程主要由PI3K/Akt 通路下游的關鍵分子主導，如凋亡加速蛋白Bad、細胞核轉錄因子（nuclear factor-κB，NF-κB）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinas，Caspase）等出現轉錄、表達情況的不同，從而調節細胞凋亡的活動。本文對PI3K/Akt 信號通路在分子水平上調控軟骨細胞凋亡的作用機制進行了總結，以期為臨床醫師的相關診斷和治療工作提供參考。

1 PI3K/Akt 信號通路概述

PI3K/Akt 信號通路是各種信號通路中熟為人知的一條經典信號通路，其在各類組織、細胞中主要調控細胞的基本活動及細胞周期等，作用重大[10]。脂質酶PI3K 包含Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3 類激酶，其中研究與應用最廣泛的是Ⅰ類。因激活Ⅰ類激酶受體的不同，Ⅰ類激酶又有ⅠA 與ⅠB 兩個不同的亞類之分。從結構上看，ⅠA 類激酶包含了兩個重要的部分，一是調控亞基p85，另一部分則是催化亞基p110[11，12]，由酪氨酸激酶激活；ⅠB 類激酶同樣包括兩個部分，一是催化亞基p110γ，另一部分則是調節亞基p101，G蛋白可直接激活或由G 蛋白偶聯受體激活[13，14]。當細胞膜受體被膜外生長因子、激素、細胞因子等適宜因子刺激時，此時PI3K 的p85 調控亞基的SH2 結構域發生磷酸化，募集Akt 使其朝著細胞膜聚集；此時位于細胞膜上的4,5-二磷酸脂酰肌醇（phosphatidylinositol-4，5-bisphosphate，PIP2）被催化亞基p110 磷酸化，由此PIP2 磷酸化成為3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇（phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate，PIP3）[15]。胞內Akt 最終被PIP3 激活，啟動下游反應。

PKB 是整個PI3K/Akt 轉導路徑中重要的一環，其來源于逆轉錄病毒Akt8，由病毒的v-Akt 基因轉錄后產生，因此，也稱Akt。Akt 也被分為Akt1/2/3（PKBα/β/γ）三種不同的亞型，各亞型雖有不同，但各個亞型間具有極高相似性，它們都具有三個不同作用的蛋白結構域，分別是PH、催化與調節結構域，第一個PH 結構域負責蛋白、脂質兩種不同物質間的作用過程；第二個催化結構域包含了蘇氨酸，對Akt 的活化過程有一定輔助作用；第三個則是包含了絲/蘇氨酸的調節結構域，是Akt 徹底被激活后傳遞信號的必須功能區。PI3K/Akt 信號通路首先在Akt 被激活后便可啟動，隨后發生串聯反應，活化的Akt 具有使Bad、Caspase-9 等凋亡前蛋白、凋亡相關死亡基因磷酸化的功能，抑制細胞凋亡，進而達到經多種傳導通路抑制細胞凋亡的目的[16]。

2 PI3K/Akt 信號通路對軟骨細胞凋亡的調節途徑

在現有研究中，與KOA 發生發展相關的經典信號通路眾多，如內質網應激反應通路、線粒體通路、死亡受體通路等[17-20]。隨著對KOA 相關信號通路臨床研究的深入，臨床醫師們發現了幾條可調控軟骨細胞凋亡的關鍵信號通路被，例如PI3K/Akt[21]、p38 MAPK[22]、Piezo1[23]、HIF-1[24]、Wnt/β[25]、NF-κB[26]。醫師們通過對信號通路中關鍵調節因子的調控，控制效應分子的表達水平，延緩、減少了軟骨細胞的凋亡，最終達到預防、治療KOA 的目的。在眾多與軟骨細胞凋亡相關信號通路中PI3K/Akt 起到至關重要的作用近年來關于該信號通路在膝骨關節炎中的研究相對較少，其在膝骨關節軟骨細胞中的作用機制主要包括以下途徑。

2.1 Bad 途徑 促凋亡蛋白Bad 是一種促凋亡因子的伴侶分子，通過調節B 細胞淋巴瘤/白血病-2 基因（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）/抗凋亡蛋白Bcl-xL的比例來發揮其促凋亡的作用。在細胞凋亡調控中，Bad 其作用與Bcl-2 不同，Bcl-2 具有明顯抑制細胞凋亡的作用，Bcl-2 二聚體大量合成誘導軟骨細胞存活。在KOA 患者中，高濃度Bad 使Bcl-xL/BAX、Bcl-2/BAX 中的BAX 游離出來，BAX 二聚體因此而占主導，使得軟骨細胞凋亡加速[27]。與之不同的是，活化的Akt 可以磷酸化Bad 的殘基位點絲氨酸136/112，Bad 與Bcl-2、Bcl-xL 分離，此時因抗凋亡蛋白的存在，分離出的Bad 不會促進細胞凋亡，因與其相結合而抑制凋亡。同時分離出的還有Bcl-2，其本身具有抑制細胞凋亡的功能，因此延緩KOA 的發生發展[28]。此外，122Bad 分子是Akt 下游的一個重要效應因子，對caspase-9 和caspase-3 一類可以加速凋亡的相關因子有至關重要的激活作用[9]，PI3K/Akt 信號通路正是對Bad 表達控制，可以間接地對上述凋亡相關因子的活性起抑制作用，最終完成對軟骨凋亡的抑制。王春玲等[27]通過小鼠H22 細胞株的凋亡活動對PI3K/Akt 信號通路下游的Bad蛋白表達水平呈現出劑量依賴性，驗證了細胞凋亡活動對PI3K/Akt 通路的Bad 蛋白的依賴性。高玲等[29]在研究益髓解毒方時發現上調大鼠Akt 及Akt mRNA 表達，使Bad mRNA 及Bad 蛋白表達得到抑制后大鼠的細胞損害、凋亡明顯減少，表明了此通路與抗細胞凋亡功能的相關性。由此可知，可利用PI3K/Akt 通路的Bad 途徑，抑制Bad 蛋白的表達，可有效抑制軟骨細胞凋亡。

2.2 mTOR 途徑 在眾多哺乳動物體內可以發現雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR），其調控著細胞的新陳代謝、增殖活動及細胞周期等多個方面，其中mTOR 主要參與細胞的自噬活動。在真核細胞中，為了應對損害性的刺激，自噬活動主要是針對已產生功能障礙的胞內細胞器進行降解并回收其中可以循環利用的原材料，以供給新的胞內物質合成活動[30]。mTOR 在細胞自噬活動中以mTORC1 復合物和mTORC2 復合物兩種形式起作用，研究表明前者主要負責負向調節細胞的自噬活動。當軟骨細胞處于炎性不利環境，上游磷酸化的Akt 會負向調節結節性硬化復合物1/2 的生物學功能，使得mTORC1 復合物活化，最終使得人自噬啟動蛋白1（unc-51-like kinase 1，ULK1）的起始功能抑制點位磷酸化，軟骨細胞的自噬活動因此獲得負向調節[31]。除此以外，mTOR 控制著PI3K/Akt/mTOR 通路下游分子LC3、ATG、Beclin-1 等效應分子的活化，軟骨細胞內自噬得到負向調節[32，33]。

KOA 的發生與機體的自噬調節關系甚密，當KOA 發生時，PI3K/Akt 的mTOR 途徑啟動，而自噬抑制基因可被mTOR 信號調控，軟骨細胞的自噬活動可出現明顯抑制，軟骨細胞自噬活動對軟骨細胞的保護作用明顯降低，此時KOA 患者關節內軟骨細胞凋亡明顯增加，加速了KOA 的發生發展[34，35]。Zhang Y 等[36]在OA 患者及體外試驗中發現mTOR過表達，而且在關節內軟骨細胞觀察到mTOR 表達上調與凋亡加速、自噬抑制密不可分。隨后，其研究證明，軟骨細胞自噬活動會被細胞內特異性的mTOR 消解而增強，并顯著保護了由內側半月板不穩定誘導的KOA，同時軟骨的降解、細胞的凋亡和滑膜的纖維化都得到明顯抑制。此外，其實驗還表明mTOR 對ULK1/一磷酸腺苷活化蛋白激酶信號通路的調節可能在一定程度上負責調節關節軟骨中的自噬信號以及分解代謝和合成代謝因子之間的平衡。Shi X 等[37]發現沉默泛素樣含植物同源結構域和環指結構域1 蛋白（ubiquitin-like with PHD and ring finger domains 1，UHRF1）可以減弱哺乳動物軟骨細胞中IL-1β 對PI3K/Akt/mTOR 信號通路靶點的上調，然后，通過對UHRF1 的敲除增強細胞自噬性，可保護OA 軟骨細胞免受凋亡影響。哺乳動物體內經mTOR 途徑的自噬活動，不論是炎性環境的被動負向調節，還是人為主動的基因敲除正向調節，都證明了可經PI3K/Akt 通路中的mTOR 途徑調節軟骨細胞凋亡活動，從而影響KOA 的發生發展。

2.3 NF-κB 途徑 NF-κB 在腫瘤細胞存活過程中的典型作用是抑制細胞凋亡，使腫瘤細胞在增殖和凋亡動態變化過程中獲得生存優勢。而NF-κB 需要IKB 激酶（inhibitor of nuclear factor kappa-B kinase，IKK）激活，使得NF-κB 轉位入核，激活抗凋亡相關基因轉錄，促進細胞存活。同時，NF-κB 轉錄開始后，可以促進下游Bcl-2 蛋白家族成員的高表達，當Bcl-2/Bcl-xL 占主導時，相關細胞會促進存活而抑制凋亡。Yu M 等[38]發現黃岑素可輔助化療藥物抑制腫瘤進展的作用機制是通過抑制PI3K/Akt/NF-κB信號通路，從而抑制了上皮-間質化過程并減少了抗凋亡基因的轉錄。楊鑫等[39]也證明在大鼠關節炎誘導模型中，PI3K/Akt 及下游的IKKαβ、IKBα 的磷酸化均得到抑制，加強了關節炎模型的軟骨細胞凋亡。在KOA 發展過程中，其中細胞外基質可因為基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）的互相作用而快速降解，同時抑制NF-κB 的轉錄、加速關節內軟骨的損傷、凋亡[40]。但Lin C 等[41]從另一方面在成骨前細胞內發現激活PI3K/AKT 下游的NFκB 可以增強細胞的增殖、分化和MMP-13 的表達，誘導了OA 小鼠模型的異常骨形成，加速了軟骨的退變。盡管目前經PI3K/Akt 通路下游的NF-κB 途徑調節軟骨細胞增殖、凋亡仍存在爭議，但NF-κB途徑在抑制軟骨細胞凋亡中的作用不可忽視，該途徑在軟骨細胞增殖、凋亡中的完整機制有待進一步深入研究。

2.4 Caspase 途徑 Caspase 本質是促凋亡因子，而其中經線粒體途徑促進細胞凋亡活動的最重要的啟動者是Caspase-9。細胞色素C 和凋亡酶激活因子Apaf-1 兩者是啟動促凋亡活動的關鍵因子，兩者結合Caspase-9 后，Caspase-9 立即從無生物學活性的前體酶形式被活化，形成新的具有促凋亡活性的Caspase-3 和Caspase-7。在KOA 發生發展中，Caspase 可以發生級聯反應，首先是Caspase-9 被活化，而后其效應者Caspase-3 將被進一步活化，兩者共同促進軟骨細胞的凋亡活動[42]。而在PI3K/Akt 通路中，Akt 一旦被活化，Caspase 促凋亡因子的Ser196基團會因其而失活，達到抑制軟骨細胞凋亡的目的[9]。朱思行等[43]在大鼠模型上的研究再次證明，激活PI3K/Akt 通路后，活化的Akt 會直接抑制Caspase-9 的表達，然后Caspase 串聯反應隨之被負向調節，促凋亡的Caspase-3 難以被激活，細胞凋亡明顯減少。有研究[44]證明了軟骨細胞中肌醇需要酶1α（inositol-requiring enzyme 1α，IRE1α）的缺乏下調了Bcl-2，而增加促凋亡因子caspase-3 增強軟骨細胞的凋亡。同時，關節軟骨內IRE1α 的激活增加了細胞的生存率并減少了凋亡。由此可知，激活PI3K/Akt 通路可以有效抑制Caspase 的活化，經Caspase途徑直接抑制軟骨細胞的凋亡活動，減緩KOA 的發生發展。

2.5 GSK3β 途徑 糖原合成激酶3β（Glycogen synthase kinase 3β，GSK3β）屬于一類相對保守的蛋白激酶，許多細胞功能的調控與之有關，其生物學活性主要由Akt 負向調節。在各類細胞培養中發現，GSK3β 的過表達會引發細胞凋亡程序。KOA 患者膝關節軟骨細胞會高表達Akt、GSK3β mRNA，低表達GS mRNA，誘發軟骨細胞凋亡活動。有研究在KOA模型兔中發現[45]，物理治療干預后，其Akt-GSK3β信號通路中關鍵分子Akt、GSK3β 和GS mRNA 明顯低表達，證明Akt-GSK3β 信號通路被抑制后，可緩解軟骨基質的退變。Huang PY 等[46]最近對OA 樣本的miRNA 和mRNA 表達譜進行生物信息學分析，GSK3β 是篩選出的6 個關鍵基因之一，并利用qRT-PCR 驗證表達水平，發現GSK3β 的表達與OA的發生呈負相關。An X 等[47]利用小針刀聯合脂肪源性干細胞（Adipose-derived stem cells，ASCs）對KOA兔模型進行干預后發現，關節軟骨內GSK3β mRNA 及蛋白表達顯著降低，細胞變性減少、細胞凋亡活動受抑制。結合臨床OA 患者樣本回顧與動物實驗，證明了軟骨細胞的凋亡活動可以經PI3K/Akt通路中的GSK3β 途徑進行調節，抑制GSK3β 的轉錄、表達可有效抑制軟骨細胞凋亡活動。

3 總結

PI3K/Akt 信號通路緊密的與細胞凋亡活動具有密切聯系，其中的調控機制多種多樣，與之相關的細胞因子不勝枚舉。而軟骨細胞凋亡活動與KOA進程密切相關，如何利用好這條信號通路抑制軟骨細胞凋亡，將會為預防、治療KOA 提供一些新思路。PI3K/Akt 信號通路中有諸多特殊的細胞因子或蛋白標志物，今后的基礎研究和臨床試驗以此基礎，尋找有效靶點調控信號通路表達，針對性進行藥物、物理治療，多途徑對KOA 進行預防和治療。