不同添加劑處理筍殼對其發酵品質及湖羊瘤胃微生物的影響

覃娟清，黨浩千，金華云，郭宇康，張富，劉慶華

（福建農林大學動物科學學院（蜂學學院），福建 福州 350002）

我國竹子種類達500 多種，位居世界之首；竹林面積占600 萬～700 萬hm2［1-2］。筍殼是竹筍（Bambuseaespp.）加工過程中產生的主要廢棄物，筍殼年產量超3000 萬t，其利用率極低［3-4］。筍殼一般指竹筍的鞘和基部區域，占竹筍的70%，具有豐富的木質纖維、粗蛋白和易酵解的膳食纖維［5-6］。筍殼易被反芻動物消化，總可消化營養物質高達68.5%［7］。筍殼高溫處理發酵后，可提升蛋白質等營養成分含量，是優良的反芻動物粗飼料來源［8］。因此，合理開發利用筍殼，不僅能變廢為寶，還可以緩解飼料資源短缺，降低生產成本，提高經濟效益。

至今，在飼料開發方面，主要采用干燥、青貯和微貯對筍殼進行加工處理，從而實現飼料化利用［9-10］。青貯是通過微生物發酵產生有機酸，使飼料得以長期保存。不同類型的青貯添加劑對青貯品質改善作用不同，常見的發酵青貯添加劑有酶類、有機鹽類、有機酸類和益生菌復合制劑等［11-13］。甲酸是一種結構簡單、用途廣泛的復合有機酸，可抑制有害菌，降低pH 值，提升有氧穩定性，常與其他酶制劑等混合青貯，改善飼料發酵品質［14］。在青貯飼料過程中添加外源性纖維素酶能降低pH 值、氨態氮含量，與乳酸菌聯合使用，可顯著降低酸性洗滌纖維、中性洗滌纖維含量，并能提高青貯品質，抑制有害菌生長［15］。EM（effective microorganisms）菌是一種以光合細菌群、酵母菌群等為主的有益微生物群，其能夠對抗致病菌群，改善消化系統微生物平衡及肉質［16-17］。研究表明，在青貯筍殼發酵過程中，適當添加乳酸菌、玉米粉等可不同程度地提升筍殼發酵品質和營養價值［18-19］。目前，單一青貯筍殼的研究甚多，不同添加劑處理筍殼對其發酵品質及肉羊瘤胃微生物的影響研究較少，降低了筍殼在生產中的有效利用率。因此，本試驗以當季新鮮的馬蹄筍（Bambusa oldhami）筍殼為材料，并以斷奶期湖羊為試驗動物，研究分析不同添加劑小罐青貯筍殼對其營養成分及發酵品質的影響，隨之開展青貯筍殼飼喂湖羊試驗，探究青貯筍殼營養品質及其在湖羊上的飼用效果，為優化筍殼的加工方式及其在肉羊生產中的應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 筍殼青貯試驗

1.1.1 試驗材料 2021 年2 月于寧德市龍林牧業有限公司選取新鮮馬蹄筍殼進行本試驗。甲酸（85%）和纖維素酶（1.0×104U·g-1）150 g 均為分析純，購自福州佰泉生物技術有限公司。在河南農富康生物科技有限公司購買EM 菌300 mg（10 g·瓶-1，其主要成分為枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌、糞腸球菌等多種微生物組群及生物酶，復合菌劑活菌總數≥1×1010CFU·g-1）。在市場購買拉伸筋膜。

1.1.2 試驗設計 采用單因素隨機試驗設計，將試驗分為8 組，分別是甲酸組（formic acid， FA）（10 mL·kg-1）、 EM 菌組（effective microorganisms， EM）（20 mg·kg-1）、纖維素酶組（cellulase enzyme， CE）（150 mg·kg-1）、甲酸+EM 菌組（formic acid+effective microorganisms， FM）（10 mL·kg-1+20 mg·kg-1）、甲酸+纖維素酶組（formic acid+cellulase enzyme， FC）（10 mL·kg-1+150 mg·kg-1）、纖維素酶組+EM 菌組（cellulase enzyme+effective microorganisms， CM）（20 mg·kg-1+150 mg·kg-1）、甲酸+纖維素酶組+EM 菌組（formic acid+cellulase enzyme+effective microorganisms， FCM）（10 mL·kg-1+20 mg·kg-1+150 mg·kg-1），對照組（control group， CK）不添加青貯劑。每組3 個重復，每個發酵罐中裝2.5 kg 筍殼。

2021 年2 月采集新鮮筍殼，將其除去泥土后用粉碎機（26 型，浙江）粉碎至約3 cm，各處理組定量噴灑添加劑。發酵前，活化菌劑，即按1 kg 溫水+0.5 kg 白糖+10 g 菌劑的劑量活化24 h，隨后根據所需添加量稀釋原液。每個發酵罐裝填2.5 kg 筍殼，充分混勻青貯劑與筍殼，之后層層緊密壓入塑料發酵罐中，常溫儲存于無強光照處，厭氧發酵80 d 后開封取樣測定分析，進行飼養試驗。

1.1.3 測定指標與方法 80 d 后，根據劉建新等［20］所示方法對各組青貯品質進行評定（表1）。

表1 青貯飼料質量評定標準Table 1 Quality evaluation standard of silage

常規營養成分的測定：用常規方法［21］測定樣品粗蛋白（crude protein， CP）含量，用Van Soest［22］所示方法測定酸性洗滌纖維（acid detergent fiber， ADF）和中性洗滌纖維（neutral detergent fiber， NDF）含量；ADF-NDF=半纖維素（hemicellulose， HC）含量；原料經105 ℃烘干至恒重后，即為干物質（dry matter， DM）含量。

發酵參數測定：發酵參數主要測定pH、乳酸（lactic acid， LA）、總氮（total nitrogen， TN）、氨態氮（ammoniacal nitrogen， AN）。用pH 測定儀（pHS-3D 型，上海）測定pH 值；采用高效液相色譜儀（LC-20AT 型，日本島津）測定乳酸含量［23］；采用凱氏定氮法［24］測定總氮含量；采用苯酚-次氯酸鈉比色法［25］測定氨態氮含量。

1.2 湖羊飼養試驗

1.2.1 試驗設計及飼糧配方 2021 年7-9 月在寧德市古田縣黃田鎮龍林牧業有限公司羊場進行試驗，選取3月齡［初始體重（16.68±1.05） kg］健康公湖羊30 只，采用單因素隨機試驗設計，將試驗羊隨機分為3 組（CK、FM和FCM 組），每組10 只。CK、FM 和FCM 組分別飼喂基礎日糧、甲酸+EM 菌和甲酸+EM 菌+纖維素酶，試驗期間飼糧按照黨浩千等［26］所示基礎飼糧組成及營養水平表進行配制。

1.2.2 飼養管理 試驗開始前對欄舍、器具清潔并消毒，統一對試驗羊進行編號和驅蟲。預飼期7 d，正飼期60 d。采取全舍飼由專人飼養，每天飼喂兩次（8：00 和16：00），每次投喂日飼喂量的1/2，定時清理消毒羊舍，自由飲水。

1.2.3 樣品采集與保存 用瘤胃管采集瘤胃液，后用4 層紗布進行過濾，隨之分裝于15 mL 凍存管中；之后清空瘤胃，剪取約2 cm2厚的瘤胃背囊部組織（2 片），用生理鹽水沖洗干凈存放于15 mL 平底試管中，并于4%多聚甲醛溶液中固定。

1.2.4 測定指標與方法 瘤胃乳頭長度和肌層厚度：4%多聚甲醛固定，按照“修剪、脫水、包埋、切片、染色、封片”的順序制作石蠟切片，最后鏡檢篩選出合格的樣片。用正置白光拍照顯微鏡（Eclipse Ci-L， Nikon， 日本）觀察并測量瘤胃乳頭長度和瘤胃肌層厚度。

瘤胃微生物的測定：解凍瘤胃液樣品，根據十六烷基溴化銨裂解緩沖液法（cetyl trimethyl ammonium bromid，CTAB）［27］提取瘤胃液DNA，按照基因組提取試劑盒說明書對樣品進行提取，之后在1%瓊脂糖凝膠上依次進行濃縮與純化。使用引物序列（5′-3′）為341F：CCTAYGGGRBGCASCAG；806R：GGACTACNNGGGTA TCTAAT，使用Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer 和高效高保真酶進行PCR 擴增。根據PCR 產物濃度進行等量混樣，充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR 產物進行檢測，對目的條帶使用膠回收試劑盒（購自Qiagen 公司）回收產物。再使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit 建庫試劑盒進行文庫構建，構建好的文庫經過Qubit 和q-PCR 定量，文庫合格后，使用Illumina NovaSeq PE 250 平臺（美麗莎生物科技有限公司，上海）進行16S rRNA 高通量測序。

基于有效數據進行操作分類單元（operational taxonomic units，OTUs）聚類和物種分類分析［28］，同時，對OTUs 進行豐度、Alpha 多樣性計算、繪制Venn 圖，以得到樣品內物種豐富度和均勻度信息、不同樣品或分組間的共有和特有OTUs 信息；通過主坐標分析（principal co-ordinates analysis， PCoA）展示樣本群落結構；選用LEfSe 分析檢測各組間的物種差異。

1.3 數據分析

采用Excel 2019 統計軟件整理數據，采用SPSS Statistics 21 進行單因素方差分析及Duncan 氏法多重比較，結果用平均值±標準差表示，以P＜0.05 作為差異顯著判斷標準。

2 結果與分析

2.1 不同添加劑處理對筍殼青貯感官的影響

由表2 可知，CE 和CM 組青貯筍殼腐敗味較濃郁，顏色變褐發黑，腐敗嚴重且散發出刺鼻性霉味，莖葉結構較為緊湊完整，青貯品質較差，為劣等。

表2 不同添加劑處理筍殼青貯的感官評定Table 2 Sensory evaluation of silage treated with different additives

FA、EM 和FC 組青貯筍殼有酒酸味，較為刺鼻，顏色暗綠，筍殼保存基本緊湊完整，略微黏連，無明顯腐敗味，青貯品質一般。與對照組相比，各項指標提升明顯，青貯品質改善顯著。

FM 和FCM 組筍殼芳香果味和甘酸味濃郁，結構完整，青貯品質良好，明顯優于對照組。

2.2 不同添加劑處理對筍殼營養成分的影響

根據上述筍殼青貯質量感官評定標準，對一般、良好的各處理組及對照組進行營養成分測定，劣等處理組不予以測定。

由表3 可知，試驗組干物質（DM）和CP 含量均顯著高于CK 組（P＜0.05），FM 和FCM 組均顯著高于其他試驗組（P＜0.05）；試驗組NDF 含量均顯著低于CK 組（P＜0.05），且FCM 組顯著低于其他試驗組（P＜0.05）；FM、FCM 和FC 組ADF 含量顯著低于CK 組（P＜0.05）；FA 組半纖維素（HC）含量顯著低于CK 組（P＜0.05）。

表3 不同處理青貯80 d 對筍殼飼料營養成分的影響Table 3 Effects of 80 days silage with different treatments on nutrient composition of bamboo shell feed（%）

2.3 不同添加劑青貯筍殼80 d 對青貯發酵品質的影響

由表4 可知，除EM 組pH 值與對照組差異不顯著外（P＞0.05），其他組pH 值均顯著低于CK 組（P＜0.05），且FA 和FCM 組顯著低于FM 和FC 組（P＜0.05）；試驗組乳酸（LA）含量顯著高于CK 組（P＜0.05），且FCM 和FM 組顯著高于其他試驗組（P＜0.05）；除EM 組氨態氮/總氮（AN/TN）值與對照組差異不顯著外（P＞0.05），其他組均顯著低于CK 組（P＜0.05）。

表4 不同處理青貯80 d 對筍殼pH 和青貯品質的影響Table 4 Effects of different treatments on pH and silage quality of bamboo shell silage for 80 days

2.4 不同添加劑裹包混貯筍殼對湖羊瘤胃形態的影響

由圖1 和表5 可知，FCM 和FM 瘤胃乳頭長度分別比CK 組顯著提高了39.84%、34.38%（P＜0.05）；FM 和CK 組肌層厚度顯著低于FCM 組（P＜0.05）。

圖1 不同添加劑青貯筍殼對湖羊瘤胃上皮組織結構的影響Fig.1 Effects of silage bamboo shoot shells with different additives on rumen epithelial tissue structure of Hu Sheep（×200）

表5 不同添加劑青貯筍殼對湖羊瘤胃形態的影響Table 5 Effects of different additives on rumen morphology of Hu Sheep （mm）

2.5 不同添加劑裹包混貯筍殼對湖羊瘤胃微生物的影響

2.5.1 OTU 分析 測序后，以97% 的一致性（identity）將序列聚類成為OTUs，共得到15191 個OTUs。CK、FM 和FCM 組共有1174 個OTU，占總OTU 的7.73%（圖2）。

圖2 不同組別之間Venn 圖Fig.2 Venn diagram of different groups

2.5.2 瘤胃微生物Alpha 多樣性分析 由表6 可知，FCM 和FM 組Chao1 指數均顯著高于CK 組（P＜0.05）；各組Shannon 和Simpson 指數均無顯著差異（P＞0.05）。

表6 Alpha 多樣性指數Table 6 Alpha diversity index

2.5.3 瘤胃微生物Beta 多樣性分析 由圖3 可知，第一主成分的貢獻率為52.2%、16.4%，第二主成分的貢獻率為20.4%、13.8%，各組之間分布相距間隔較近，說明不同組之間瘤胃微生物菌群結構差異不大。

圖3 基于Unweighted Unifrac （A）和Weighted Unifrac （B）距離的瘤胃微生物群落結構的主坐標分析Fig. 3 Principal coordinate analysis of rumen microbial community structure based on Unweighted Unifrac （A） and Weighted Unifrac distance （B）

2.5.4 瘤胃微生物菌群門、科和屬水平相對豐度分析 如表7 所示，厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）起主導作用，占細菌總豐富度的90%以上。厚壁菌門相對豐度CK 組最高，為58.18%；FM組最低，為52.24%；擬桿菌門相對豐度CK 組最低，為37.26%，最高為FM 組，為39.95%。

表7 門水平微生物相對豐度Table 7 Relative abundance of microorganisms at phylum level （%）

由表8 可知3 組中最豐富的科水平類別，占主導作用的是未鑒定的擬桿菌科（unidentified_Bacteroidales），瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）、未鑒定的梭菌科（unidentified_Clostridiales）、毛螺菌科（Lachnospiraceae）。瘤胃球菌科相對豐度FM、FCM 組高于CK 組，其中FM 組最高，為20.98%，但均無顯著性差異（P＞0.05）。

表8 科水平微生物相對豐度Table 8 Relative abundance of microorganisms at family level （%）

由表9 可知，各組中屬水平微生物相對豐度類別，未鑒定的擬桿菌屬（unidentified_Bacteroidales）、未鑒定的瘤胃球菌屬（unidentified_Ruminococcaceae）、未鑒定的梭菌屬（unidentified_Clostridiales）、未鑒定的毛螺菌屬（unidentified_Lachnospiraceae）這4 個菌屬起主導作用，其中FM 組未鑒定的瘤胃球菌屬（unidentified_Ruminococcaceae）最高，CK 組最低，但均無顯著性差異（P＞0.05）。

2.5.5 組間差異物種分析 如圖4 所示，由LEfSe 分析（LDA score＞4）可知，FM 組生物標志物是鞘脂菌屬（Sphingobium），CK 組是RF16 和細菌屬（Bacteria）。

圖4 CK 和FM 組，CK 和FCM 組基于LEfSe分析的組間差異物種Fig. 4 Different species of CK and FM group， CK and FCM group based on LEfSe analysis

3 討論

3.1 不同添加劑處理對筍殼營養成分和發酵品質的影響

筍殼含水量高達90%以上［29］，營養物質豐富，且粉碎后容易被氧化。因此，自然條件下筍殼的儲存和發酵易產生霉變，從而造成青貯失敗。然而，適當使用青貯劑可有效改善發酵品質，提升營養價值［30］。本研究發現添加纖維素酶組均腐敗嚴重，有強烈刺鼻性氣味，發黏結塊，可能是因為EM 菌中的乳酸菌和纖維素酶在青貯發酵過程中無法產生協同作用，抑制了乳酸菌等有益菌活性，導致乳酸含量降低，從而導致青貯嚴重腐敗。黃小云等［31］在添加乳酸菌和纖維素酶對狼尾草（Pennisetumspp.）和圓葉決明（Chamaecrista rotundifolia）混合青貯效果的試驗中發現，其青貯品質沒有得到明顯提升。楊烈等［32］在探究乳酸菌與纖維素酶對‘Tifton 85’狗牙根（Cynodonsp. cv.Tifton 85）青貯發酵品質影響的結果表明，乳酸菌和纖維素酶之間可能存在拮抗作用，降低了青貯效果。

采用小罐青貯筍殼，層層壓實筍殼排出空氣，降低氧氣濃度，減緩筍殼自身氧化速率［33］。在本研究中，添加青貯劑后筍殼DM 含量顯著升高，其營養物質在一定程度上得到了有效保留。此外，在感官品質鑒定、營養成分方面，添加甲酸組均顯著優于其他各單獨處理組，其pH 值明顯降低，CP 含量顯著增加，這主要是因為甲酸可有效抑制腐敗微生物的活性，降低pH 值，提高青貯成功率［34］。本研究中，與甲酸+EM 菌組相比，甲酸+EM 菌+纖維素酶組CP 含量更高，NDF 含量更低，可能是因為纖維素酶能將筍殼中的纖維分解成可溶性多糖（water soluble carbohydrate， WSC），從而為EM 菌中厭氧菌的生長繁殖提供更多可利用的底物，促進了乳酸菌發酵，青貯中LA含量增加，有效改善了青貯品質。這與趙小雪等［35］的研究結果基本一致。說明適量添加甲酸、纖維素酶和EM 菌混合青貯筍殼能提升青貯品質，降低ADF 和NDF 含量。

青貯發酵過程是眾多微生物復雜動態變化過程，添加甲酸、纖維素酶和EM 菌可為筍殼發酵營造良好的環境，促進乳酸菌和枯草芽孢桿菌等優勢菌種生長繁殖［36-37］。LA 含量越低，發酵物的pH 值越高，營養物質損失越多，發酵效果越差［38］。AN/TN 是反映青貯飼料蛋白質降解的重要指標，AN/TN 值越低，說明青貯品質越好［39］。在本試驗中，添加甲酸組能夠迅速酸化青貯筍殼，降低pH 值，從而抑制有害菌生長繁殖。研究表明，pH 值與LA含量密切關聯，pH 值小于3.5 時，乳酸菌基本上停止生長，最終導致乳酸濃度降低［40］。本研究結果顯示，試驗組pH 值顯著低于CK 組，LA 含量顯著高于CK 組，AN/TN 顯著低于CK 組，其中FM、FCM 組LA 含量較高，且FCM 組pH 值最低，AN/TN 最小，表明添加劑混合青貯發酵效果最佳，能夠明顯改善青貯發酵品質，這與周迪等［41］的研究結果一致。

3.2 不同添加劑處理對湖羊瘤胃發育的影響

瘤胃是營養物質消化、吸收、存儲的主要場所，瘤胃組織形態學中瘤胃乳頭長度、寬度和肌層厚度是衡量瘤胃發育的關鍵指標［42-43］。瘤胃乳頭長度是最重要的指標，其次為瘤胃乳頭寬度及肌層厚度［44］。瘤胃乳頭長度越長，瘤胃上皮與瘤胃內容物的接觸表面積越大，因而，瘤胃上皮對營養物質的吸收能力增強，利于瘤胃的健康發育［45］。合理的精粗比可維持瘤胃乳頭正常形態，可增加瘤胃蠕動，促進肌層發育，促進瘤胃乳頭發育［46］。本試驗表明，FM 和FCM 組瘤胃乳頭長度顯著大于CK 組，FCM 組肌層厚度顯著高于FM 和CK 組，表明不同添加劑處理青貯筍殼能促進湖羊瘤胃形態發育。

3.3 不同添加劑裹包處理筍殼對湖羊瘤胃微生物多樣性的影響

瘤胃中分布著豐富的微生物，且微生物菌群處于一定的動態平衡中。Alpha 多樣性分析主要反映瘤胃微生物菌群的豐富度和均勻度，Chao1 指數反映微生物豐度，數值越大，說明群落的豐富度越高，Shannon 和Simpson指數反映物種多樣性，數值越高，說明群落多樣性越高。瘤胃細菌多樣性和豐度是影響瘤胃功能的關鍵因素［47］。在本試驗中，FM 和FCM 組Chao1 指數均顯著高于CK 組，說明不同添加劑青貯筍殼可在一定程度上改變試驗羊瘤胃菌群豐富度，其中FCM 組高于FM 組，這是由于添加纖維素酶青貯筍殼改善了試驗羊瘤胃發酵功能，體內建立了優勢菌群，增加了瘤胃內活菌總數，提升了微生物多樣性［48-49］。陳宇［50］研究表明添加木聚糖酶和纖維素酶可以提高培養液中細菌總濃度，促進纖維降解菌繁殖，與賈鵬［51］研究結果相近。由Beta 多樣性分析可知，各組間瘤胃微生物菌落結構差異不大，表明不同添加劑青貯筍殼增加瘤胃微生物群落多樣性的作用不明顯，與姜碧薇［52］采用酶菌青貯粗飼料提高了試驗羊瘤胃內微生物多樣性的研究結果不一致。

3.4 不同添加劑裹包處理筍殼對湖羊瘤胃微生物菌群的影響

反芻動物瘤胃微生物由細菌、原生動物、真菌、古細菌和病毒組成，構成了復雜的共生網絡，菌群受日齡、品種、精粗比、添加劑以及日常管理方式等因素影響，菌群的動態平衡對于維持宿主反芻動物的免疫功能和整體生產效率至關重要［53］。反芻動物瘤胃微生物菌群豐富多樣，其中優勢菌門是擬桿菌門和厚壁菌門，且其豐度較高，厚壁菌門可以降解纖維生成揮發性脂肪酸，而擬桿菌門可以降解蛋白質和非纖維素植物多糖［54］。在本試驗中，試驗組湖羊瘤胃內主要為厚壁菌門和擬桿菌門，占比約90%，與陳麗娟等［55］采用體外發酵法研究不同比例構樹（Broussonetia papyrifera）與苜蓿（Medicago sativa）混合對安格斯母牛瘤胃細菌多樣性影響的結果一致。瘤胃球菌科可水解纖維素、木質素等大分子物質，轉化成糖類物質。本試驗表明，試驗組瘤胃球菌科相對豐度高于CK組，且FM 組相對豐度最大，這是由于EM 菌中的枯草芽孢桿菌等提高了筍殼在瘤胃內粗纖維的降解速率。普雷沃氏菌也是反芻動物瘤胃內的優勢菌群之一，主要參與淀粉、纖維素、蛋白質的分解轉化，促進營養物質降解［56］。在本試驗結果中，FCM 組普雷沃氏菌科、瘤胃球菌科相對豐度均與CK 和FM 組相比無顯著差異，表明添加劑處理筍殼增加瘤胃內菌群結構及微生物多樣性的作用不太明顯。

4 結論

單一或復合添加青貯劑發酵筍殼可提高CP、乳酸含量，降低pH 值，提升發酵品質，同時能降低ADF、NDF 以及HC 含量，其中甲酸+EM 菌組和甲酸+纖維素酶+EM 菌組青貯筍殼感官品質、發酵特性和營養品質較好，用于飼喂湖羊，但改善瘤胃微生物組成和結構的作用不太明顯。