基于ISSR標記的蜂糖李親緣關系分析

麥鵬坤, 鄭乾明, 趙雅楠, 張 敏, 馬玉華

(1.貴州大學生命科學學院/農業(yè)生物工程研究院,山地植物資源保護與保護種質創(chuàng)新教育部重點實驗室,山地生態(tài)與農業(yè)生物工程協(xié)同創(chuàng)新中心, 貴陽 550025;2.貴州省農業(yè)科學院果樹科學研究所, 貴陽 550006)

蜂糖李(Prunussalicina'Fengtangli')為薔薇科(Rosaceae)李亞科(Prunoideae)李屬(Prunus)植物,蜂糖李肉質細,清脆爽口,汁液中多,味濃甜,離核,品質優(yōu)異,是貴州名特優(yōu)水果[1],由貴州省安順市本地李子優(yōu)株選育而成,起源于貴州省安順市鎮(zhèn)寧縣六馬鎮(zhèn)。2017年,蜂糖李被評為中國國家地理標志保護產品[2],同年,“鎮(zhèn)寧蜂糖李”在第四屆全國優(yōu)質李鑒評大會上獲得評審專家的一致好評,被評為“全國優(yōu)質李金獎”。蜂糖李作為貴州獨特的地方李品種,因其果實風味濃郁,且?guī)в歇毺氐南銡舛哂休^高的商品價值。現貴州省種植面積約3.67萬hm2,安順種植面積1.4萬hm2,投產面積5 580 hm2[1],并推廣到廣西、四川等省(區(qū))。隨著蜂糖李種植面積的迅速擴大,種苗生產混亂、接穗來源異質化,果苗質量得不到保障,果實品質參差不齊,對蜂糖李產業(yè)造成不利影響。因此,對貴州蜂糖李進行DNA分子標記技術研究,開展貴州蜂糖李種質資源保護和培育優(yōu)異品系研究十分重要。

DNA分子標記具有變異位點豐富、遺傳穩(wěn)定、多態(tài)性高和受環(huán)境影響小等優(yōu)點,因而被廣泛應用于物種種質鑒定、物種遺傳多樣性分析、品種親緣關系鑒定、指紋圖譜的構建等領域[3]。分子標記中ISSR是簡便、快速、易行的分子標記技術[4],引物的設計流程簡單,既無需知道擴增位點的信息,又具有比RPAD標記更強的可重復性[5-6]。近年來,ISSR標記已在李屬植物遺傳多樣性研究中得到了廣泛應用。經建永等[7]以22份野生歐洲李為材料,利用ISSR對其種質進行了遺傳多樣性研究,為歐洲李野生種質資源的開發(fā)和保護提供了科學的理論依據。方智振等[8]利用ISSR分子標記區(qū)分了寧岡和福建芙蓉李,并建立了寧岡芙蓉李與福建芙蓉李的ISSR指紋圖譜,為芙蓉李的種質利用提供了依據。目前,基于ISSR分子標記的貴州蜂糖李遺傳多樣性分析未見相關報道,可見對其分子水平的研究相對滯后。本研究基于ISSR分子標記技術,對采自鎮(zhèn)寧縣等5個地區(qū)的52份蜂糖李種質進行親緣關系分析,遺傳多樣性評價,為今后蜂糖李新種質的培育與資源的保存提供參考和技術支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

本實驗所用的52份蜂糖李材料采自貴州省5個不同區(qū)(縣)(見表1),于2022年7月中旬由同一實驗者取樣,采集完整無損傷幼嫩葉片分別置于對應的采集袋內,低溫下帶回實驗室,-80 ℃超低溫冰箱保存,用于后續(xù)基因組DNA提取。

表1 用于ISSR分子標記的52份蜂糖李種質材料

1.2 實驗方法

1.2.1蜂糖李基因組DNA的提取

通過植物基因組DNA提取試劑盒DP320(北京,天根,提取方法見試劑盒說明書)提取52份供試材料幼嫩葉片DNA后,根據1%瓊脂糖凝膠電泳圖,篩選出條帶清晰、質量達標的DNA,用于后續(xù)群體遺傳分析。經紫外分光光度計檢測質量及濃度后,將DNA稀釋至約40 ng/μL,置于-20 ℃保存防止DNA降解,用于后續(xù)實驗。

1.2.2引物合成與篩選

選擇實驗室現有已合成的(University of British Columbia公布的)100條 ISSR 引物(上海生工生物工程公司合成),使用蜂糖李編號為1,3,4,7,9,10,17,34的樣品基因組為模板,獲得10條重復性好且多態(tài)性高的引物用于本研究材料的分析。且進行預實驗的多重因素比較。最終優(yōu)化的ISSR PCR體系的總體積為10 μL,其中含5 μL 天根2×TaqPCR Master Mix Ⅱ、0.8 μL 引物(0.8 μM)、1.2 μL(40 ng/μL)模板DNA,用ddH2O補足至總體積10 μL。ISSR擴增程序參照文獻[9]的方法并稍作修改:94 ℃預變性5 min;后經94 ℃變性45 s,50.7～57.9 ℃引物退火45 s,72 ℃延伸1 min,共計循環(huán)40次;最后72 ℃延伸10 min;擴增后的產物4 ℃保存。產物由2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,電泳液為1×TAE,用DL2000 Marker為DNA分子量參照標準,電泳電壓設為180 V,電泳時間30 min,利用自動凝膠成像系統(tǒng)記錄電泳的結果。

1.2.3數據統(tǒng)計與分析

每條ISSR引物實驗重復3次,僅統(tǒng)計每條引物擴增出來的清晰且能重復出現的條帶。在位點處存在擴增條帶的記為“1”,沒有則記為“0”。最后獲得供試樣本對應每個引物的0/1數據矩陣。通過Popgene32[10]軟件計算遺傳多樣性指數,其中包括等位基因數量(Na),有效等位基因數量(Ne),Nei's基因多樣性指數(H)和Shannon's信息指數(I)。PIC_CALC軟件計算多態(tài)性信息含量(Polymorphism Information Content PIC)。使用NTSYS2.10根據非加權平均法UPGMA對供試種質進行聚類分析。并利用iTOL(https://itol.embl.de/)進行聚類圖美化。

2 結果與分析

2.1 蜂糖李DNA檢測

利用試劑盒提取的52份供試樣本的基因組DNA,部分基因組DNA經1%瓊脂糖凝膠電泳結果如圖1所示。DNA電泳條帶距上樣孔較近,且條帶明亮清晰,不存在拖尾、降解等現象。使用全波長掃描型酶標儀測定所提DNA樣品的OD260/OD280值及濃度。結果顯示,所提DNA的OD260/OD280值在1.75～1.93之間,濃度在85～457 ng/μL之間,表明提取的DNA質量較高,可作為分子標記的DNA模板,將DNA模板統(tǒng)一稀釋至40 ng/μL用于研究。

注:M為2 000 bp Marker,1～14與表1樣品編號相同。

2.2 ISSR引物篩選

利用100條ISSR引物對8個隨機挑選的蜂糖李DNA模板進行擴增,獲得在8份模板中能擴增出條帶的35條ISSR引物,并對35條ISSR引物進行復篩。最終篩選出10條擴增位點清晰、可重復性好的引物,用于52份蜂糖李種質的PCR擴增。余下的ISSR引物因無法擴增出位點或者擴增出的位點不具有多肽性而被舍棄。所篩選出來的10條ISSR引物的信息詳見表2,部分引物篩選的電泳結果見圖2。圖2中部分引物擴增出的位點出現模糊不清晰,或無擴增位點的現象,具體原因可能是設定的PCR擴增的退火溫度沒有達到實驗引物的最適退火溫度,或者是所選引物在擴增模板中的特異性較低。在后面的實驗過程中,通過對試驗引物進行多次的PCR擴增體系調整、優(yōu)化以及對部分引物進行舍棄,可以有效避免上述情況的出現。

表2 用于供試樣品鑒定的10條ISSR引物信息

2.3 ISSR標記引物多態(tài)性分析

將篩選出的10條ISSR引物分別對52份蜂糖李材料的基因組DNA進行PCR擴增實驗,經脂糖電泳后,統(tǒng)計結果見表3。10條引物共擴增出76個位點,平均每條引物擴增7.6個,其中多態(tài)性位點有73個,平均多態(tài)性位點比率為96.05%,UBC842與UBC856擴增最多,達10個,UBC834擴增最少,僅6個。每條引物的多態(tài)性信息量在0.721 6～0.860 3之間,均值0.802 2,等位基因數在1.625 0～2.000 0之間,均值1.888 9,有效等位基因數在1.324 4～1.696 5之間,均值1.509 3,Nei's基因多樣性指數在0.221 4～0.391 6之間,均值0.300 4,Shannon's信息指數在0.336 5～0.571 4之間,均值0.452 3。結果表明,篩選獲得的10條ISSR引物的綜合表現較好,適合進行蜂糖李種質親緣關系和遺傳多樣性評價,能有效區(qū)分供試種質。引物UBC880、UBC899的部分電泳結果如圖3所示。

注:M為2 000 bp Marker,1～24與表1編號相同。

表3 10條ISSR引物在52份蜂糖李種質的擴增結果

2.4 聚類分析

利用最終篩選出的10條核心引物,統(tǒng)計52份蜂糖李種質在篩選的10條ISSR引物擴增位點的數據,利用NTSYS2.10e軟件計算52份蜂糖李供試種質的DICE遺傳相似性系數,并對52個個體進行聚類分析(圖4),以遺傳相似系數0.683為閾值,52個樣品可以歸為3個類群,從聚類樹中可知,蜂糖李第一組共15份種質,其中10份種質采自黔南州惠水縣,4份采自安順市紫云縣,1份采自六馬鎮(zhèn)。第二組共17份種質,14份種質采自六馬鎮(zhèn),2份采自息烽縣,1份采自安順市紫云縣。第三組共20份種質,僅1份種質采自六馬鎮(zhèn),其余19份種質均采自紫云縣。52個蜂糖李種質間的遺傳相似性系數在0.487～0.932之間,其中采自紫云縣的F6種質和F7種質親緣關系最近,相似性系數為0.932,采自惠水縣的FB種質與F19種質親緣關系最遠,遺傳相似系數僅為0.487?；谶z傳相似性系數和聚類樹狀圖表明,聚類結果呈現一定的地理規(guī)律性,即相同地區(qū)的大多數蜂糖李種質聚為一類,但未完全按照地理來源分類。表明52份蜂糖李種質雖然具有不同程度的親緣關系及基因交流,但親緣關系最近的仍是相同地區(qū)的蜂糖李。

3 討 論

果樹類植物多為多年生植物,育種周期相對其他植物較長。因此,開展對果樹類植物的種質資源遺傳多樣性分析顯得十分重要[11]。遺傳多樣性,一般指的是種群之間或種群內部個體之間遺傳信息的總和,能夠反映出物種的遺傳背景、遺傳分化程度及育種潛力等,是研究物種起源與進化的重要依據,也是種質資源開發(fā)利用及保護的基礎[12]。對種質的遺傳多樣性進行研究一直是育種工作者在研究中最為側重的方面,也是在培育新品種過程中研究者最為關注的參考指標。ISSR分子標記技術已廣泛應用于各類植物種群的遺傳多樣性分析[13],例如ISSR分子標記技術已應用于龍眼[14]、金花茶[15]、火龍果[16]、貴州大櫻桃[17]、柑橘[18]、櫻花[19]等植物的遺傳多樣性研究中,說明ISSR的應用已十分廣泛。蜂糖李雖然是貴州的一優(yōu)質李品種資源,但是關于蜂糖李資源開發(fā)利用的研究卻十分罕見。因此本實驗通過使用ISSR分子標記技術對蜂糖李進行遺傳多樣性方面的研究。

李作為銷量比較大的水果之一,對于李資源的遺傳多樣性方面的研究十分常見。魏瀟等[20]基于熒光毛細管電泳技術對17份南方品種的李種質資源進行了多樣性分析,結果顯示,17份李種質的平均Shannon's多樣性指數為1.709,認為供試材料具有豐富的遺傳多樣性。結果與王紅林等[21]利用熒光毛細管電泳技術對貴州省內的16份李種質資源進行分析的結果相似(I=1.59),實驗結果均明顯高于本實驗的結果(I=0.452 3),這可能跟二者使用的檢測方法更為精密有關。陳紅和楊迤然[22]通過ISSR技術研究了45份貴州當地李種質資源和3份外來引進品種的遺傳多樣性水平,結果顯示,48份李種質資源的平均H值為0.345,平均I值為0.508,明顯高于本實驗(H=0.300 4,I=0.452 3)的,原因可能是其研究的對象是不同品種李的遺傳多樣性,本實驗研究對象是單一品種。孫琪等[23]利用ISSR標記分析了30份歐李種質資源,供試單株的Nei's遺傳多樣性指數為0.266 6,平均Shannon's信息多樣性指數為0.399 1,低于本研究的Nei's遺傳多樣性指數值和Shannon's信息多樣性指數值,均認為這些李種具有較高的遺傳多樣性。目前在單一李品種內的遺傳多樣性研究相對較少。Basilio等[24]通過ISSR標記技術評價了29份同一品種的核心日本李種質資源的遺傳多樣性,結果顯示,29份日本李種質資源的平均Nei's遺傳多樣性指數為0.15,平均Shannon's多樣性指數為0.27;李興婷[25]通過ISSR標記分析179份脆李,遺傳特征指標如平均Nei's基因多樣性指數為0.086 6,平均Shannon's信息指數為0.156 7;經永健[26]用ISSR分析了歐洲李種質,其中平均Nei's基因多樣性指數為0.147 0,平均Shannon's信息指數為0.220 2。以上結果均低于本研究通過10條ISSR引物分析52份蜂糖李的結果(H=0.300 4,I=0.452 3),且均認為這些李品種遺傳多樣性水平較高。從側面證明了本研究供試52份蜂糖李具有較高的遺傳多樣性。

多態(tài)性信息量(PIC)也是評估基因變異程度的主要指標之一[27]。本研究利用10條ISSR多態(tài)性引物對52份蜂糖李種質資源進行遺傳多樣性分析,PIC平均值為0.802 2,大于0.5,表明位點具有高度多態(tài)性。綜合分析表明,篩選出的ISSR引物在單一品種中也具有較高水平的變異檢測能力?？捎糜诤罄m(xù)的蜂糖李間遺傳多樣性研究,為開展蜂糖李種質資源利用和保護提供分子生物學依據。

4 結 論

本研究對52份不同產地的蜂糖李種質資源進行了遺傳多樣性分析,10條引物共擴增出76個位點,其中多態(tài)性位點73個,占總位點的96.05%,引物的多態(tài)性信息量(PIC)在0.721 6～0.860 3之間,均值0.802 2,等位基因數(Na)在1.625 0～2.000 0之間,均值1.888 9,有效等位基因數(Ne)在1.324 4～1.696 5之間,均值1.509 3,Nei's基因多樣性指數(H)在0.221 4～0.391 6之間,均值0.300 4,Shannon's信息指數(I)在0.336 5～0.571 4之間,均值0.452 3,遺傳相似性系數在0.487～0.932之間,表明蜂糖李遺傳信息豐富,以遺傳相似系數0.683為閾值,52個樣品可以歸為3個類群,3個類群均未完全按照地理來源分類,但是3個類群中絕大部分種質來源于同一地區(qū),在一定程度上體現了供試種質地理來源的相似性。綜合研究結果表明,篩選出的ISSR 引物在研究蜂糖李的遺傳多樣性上可行的,可在分子水平上為蜂糖李種質資源的保存和利用提供參考,同時為蜂糖李優(yōu)良品種選育提供科學依據。