桂皮醛對關節炎大鼠炎癥因子及骨橋蛋白的作用*

楊云皓 李發菊 許望東 何成松

(西南醫科大學附屬醫院風濕免疫科,四川 瀘州 646000)

類風濕關節炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種受多種內源性和外源性因素影響的慢性炎癥性自身免疫性疾病,病理表現主要為滑膜炎,逐漸出現關節軟骨和骨破壞,最終導致關節畸形、功能障礙。該病發病率高,致殘率高,嚴重影響患者的生活質量,是造成人類喪失勞動力和致殘的主要原因之一,亦給家庭和社會帶來沉重負擔。目前臨床上以非甾體抗炎藥(Nonsteroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs)、糖皮質激素、改善病情抗風濕藥(Disease modifying antirheumatic drugs, DMARDs)、生物制劑及外科手術治療為主,但上述治療手段因副作用或價格昂貴仍不能完全滿足臨床訴求[1-2]。中醫運用桂類藥材治療痹癥歷史悠久、方便有效且廉價,RA屬于中醫“痹證”范疇。研究發現,肉桂具有抗關節炎作用,但具體有效成分尚不清楚。肉桂樹皮揮發油的主要成分是桂皮醛(Cinnamaldehyde,Cin),其具有藥理活性強、毒性低、成本低等特點,具有抗炎、抗腫瘤等廣泛的藥理作用[3-4]。骨橋蛋白(Osteopontin,OPN)是一種多功能的細胞外基質蛋白,被認為是一種在RA發病過程中發揮重要作用的促炎因子[5]。本研究擬采用Ⅱ型膠原誘導的關節炎(Collagen-induced arthritis,CIA)大鼠模型,探究Cin對Ⅱ型CIA大鼠的作用及對OPN水平的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD雄性大鼠20只,6～8周齡,體重(200±20)g,購自西南醫科大學實驗動物中心,動物生產許可證號:SCXK(川)2018-017,動物使用許可證號:SYXK(川)2018-065。實驗由西南醫科大學實驗動物倫理委員會批準(倫理批準號:SWMU20220023)。

1.2 主要試劑和儀器 桂皮醛(上海邁瑞爾化學技術有限公司,純度>98%),牛Ⅱ型膠原蛋白(上海金穗生物科技有限公司),OPN、白介素-6(IL-6)、IL-17、腫瘤壞死因子-α(TNF-α) ELISA試劑盒和定量PCR試劑(武漢科鹿生物科技有限責任公司),中性樹膠、DAB顯色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司),RIPA裂解液、BCA蛋白質濃度測定試劑盒、ECL化學發光檢測試劑盒、PMSF、脫脂奶粉、羊抗兔二抗(艾斯本技術有限公司),GAPDH兔源單克隆抗體(武漢三鷹生物技術有限公司),OPN兔源單克隆抗體(上海abcam公司);RM2016切片機(上海徠卡儀器有限公司),IX51顯微鏡(日本奧林巴斯),熒光定量PCR儀:StepOneTM實時熒光定量PCR系統(美國生命技術公司),TGL-16冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司),DR-200Bs酶標儀(Diatek公司),DYY-6C電泳儀(北京六一儀器廠)。

1.3 方法

1.3.1 造模、分組及給藥 20只大鼠隨機分為對照組、模型組、低劑量Cin組、高劑量Cin組,每組5只。除對照組外,其余3組均按以下方法建立CIA大鼠模型,將牛Ⅱ型膠原與乙酸溶液混合,并在4 ℃下持續搖擺12 h,以獲得8 mg/mL膠原蛋白溶液。將膠原蛋白溶液與完全弗氏佐劑(體積比為1∶1)混合,以獲得終濃度為4 mg/mL膠原蛋白乳劑,按0.3 mL/只于造模大鼠足跖部及尾根部多點皮下注射,7 d后再進行1次加強免疫,對照組以同樣的方法注射等量0.9%氯化鈉溶液,造模14 d[6]。造模后根據足趾腫脹、變形情況進行關節炎評分:0分為無足趾腫脹;1分為輕微腫脹;2分為中度腫脹;3分為嚴重腫脹;4分為嚴重腫脹伴有變形。每個足趾最高評分為4分,總分最大為16分,總分大于4分的大鼠表示造模成功[7]。造模第14 d后開始給藥,低、高劑量Cin組按照100、200 mg/kg灌胃,1次/d,持續3周;對照組和模型組灌胃等量0.9%氯化鈉溶液,1次/d,持續3周。

1.3.2 ELISA法檢測大鼠血清中OPN及炎癥因子IL-6、IL-17、TNF-α的水平 最后一次給藥24 h后,通過腹腔注射戊巴比妥將大鼠麻醉,采集腹主動脈血,置于4 ℃冰箱中靜置2 h,然后2 000 r/min離心10 min,收集上層血清。采用ELISA試劑盒檢測大鼠血清OPN、IL-6、IL-17和TNF-α含量,嚴格按試劑盒說明書進行操作。

1.3.3 免疫組織化學法(IHC)檢測大鼠滑膜組織中OPN表達 將石蠟組織切片脫蠟至水,切片置于0.01 M檸檬酸鹽緩沖液(PH 6.0)中,加熱進行抗原修復,冷卻至室溫,用組化筆在組織周圍畫圈,3% H2O2室溫孵育20 min,封閉內源性的過氧化物酶。用5% BSA稀釋抗體,滴加適量OPN兔源一抗稀釋液,一抗稀釋比例1∶150,4 ℃過夜。復溫,滴加山羊抗兔二抗稀釋液,二抗稀釋比例為1∶200,37 ℃水浴鍋孵育30 min。配制DAB工作液,顯微鏡下控制顯色,陽性為棕黃色。進行顯色后,蘇木素復染,鹽酸乙醇分化,氨水泛藍,脫水、透明、中性樹膠封片。顯色結果進行半定量分析,光鏡下胞質及胞膜呈棕色為陽性細胞,用光學顯微鏡放大400倍拍照,每張切片隨機選取3個視野,采用Image-Pro Plus 6.0軟件進行圖像分析,表達水平以平均光密度計算。

1.3.4 Western blot法檢測大鼠滑膜組織中OPN的蛋白表達 取大鼠膝關節滑膜組織,組織塊用預冷的PBS緩沖液漂洗2～3次,剪成小塊置于勻漿器中,加入200 μL蛋白裂解液,冰浴徹底勻漿;將勻漿液轉移至離心管中,冰浴30 min,期間用移液器反復吹打,12000 r/min離心5 min,吸取上清液,BCA法測定蛋白濃度。配制10%的分離膠和5%的濃縮膠進行SDS-PAGE電泳,上樣后先80 V電泳30 min,再調整為120 V電泳30 min,按300 mA恒流轉膜90 min,加入5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,隨后將條帶加入OPN兔源一抗蛋白稀釋液中,一抗稀釋比例為1∶1 000,4 ℃過夜,第2天回收已稀釋的一抗,用TBST洗三次,每次5 min。加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔二抗,二抗稀釋比例為1∶10 000,室溫孵育30 min,用TBST在室溫下搖床上洗四次,每次5 min,后滴加ECL發光液,反應1 min后置于暗室中曝光,隨后顯影、定影。以GAPDH為內參蛋白,用AlphaEaseFC軟件處理系統分析目標帶的光密度值。

1.3.5 RT-QPCR方法檢測大鼠軟骨中OPN mRNA水平 取大鼠膝關節軟骨組織,每個組織稱取50 mg。采用TRIpure法提取SD大鼠軟骨總RNA,取總RNA 15 μL反轉錄合成cDNA第一鏈(M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒) ,取反轉錄產物1 μL進行內參基因GAPDH及目的基因OPN的擴增。引物由武漢金開瑞生物工程有限公司完成引物合成,引物序列:GAPDH(164bp)引物序列上游:5’-AACAGCAACTCCCATTCTTCC-3’,下游:5’-TGGTCCAGGGTTTCTTACTCC-3’;OPN(206bp)引物序列上游:5’-AGCACACAAGCAGACGTTTTG-3’,下游:5’-GCAACTGGGATGACCTTGATAG-3’。反應條件:預變性95 ℃ 1 min,95 ℃ 15 s,58 ℃ 20 s,72 ℃ 45 s,40次循環。采用2-△△CT公式計算和比較相關基因表達水平的CT值。

1.3.6 HE染色觀察大鼠關節組織病理學改變 將大鼠膝關節標本置于4%多聚甲醛中固定,隨后進行脫鈣、徹底脫去鈣鹽后進行常規石蠟包埋、切片(厚度為2～3 μm)。組織切片置于載玻片上,二甲苯脫蠟,乙醇溶液復水,HE染色,最后脫水封片,顯微鏡下觀察大鼠關節組織的病理改變。

2 結果

2.1 Cin對CIA大鼠關節情況和關節炎評分影響 造模第14天,與對照組比較,各組大鼠足跖出現明顯腫脹,關節炎評分顯著升高(P<0.05);造模第21、28、35天,與模型組比較,低、高劑量Cin組足跖腫脹緩解,大鼠關節炎評分顯著降低(P<0.05);造模第35天,與低劑量Cin組比較,高劑量Cin組大鼠關節炎評分顯著降低(P<0.05),見表1。

表1 Cin對CIA大鼠關節炎評分的影響

2.2 Cin對CIA大鼠血清中OPN及炎癥因子水平的影響 與對照組比較,模型組大鼠血清中OPN、IL-6、IL-17、TNF-α表達水平顯著增加(P<0.05);與模型組比較,低、高劑量Cin組大鼠血清中OPN、IL-6、IL-17、TNF-α的表達水平均顯著減少(P<0.05);與低劑量Cin組比較,高劑量Cin組大鼠血清中OPN、IL-6、IL-17、TNF-α的表達水平顯著減少(P<0.05),見表2。

表2 各組大鼠血清OPN、IL-6、IL-17、TNF-α含量比較

2.3 IHC法檢測Cin對CIA大鼠滑膜組織OPN蛋白表達的影響 IHC結果顯示棕黃色的陽性產物主要分布于胞膜及胞質。IHC圖像表明對照組滑膜組織可見OPN少量表達,與對照組相比,模型組大鼠滑膜的OPN蛋白表達更高,低劑量Cin和高劑量Cin治療可降低CIA滑膜OPN蛋白表達(圖1)。半定量分析結果表明,與對照組比較,模型組滑膜組織OPN表達明顯增加(P<0.05);與模型組比較,低、高劑量Cin組滑膜組織OPN表達均明顯減少(P<0.05);高劑量Cin組滑膜組織OPN表達減少更顯著(P<0.05),見圖2。

圖1 各組大鼠滑膜組織免疫組織化學變化(IHC 400×)

圖2 各組大鼠滑膜OPN表達的平均光密度值

2.4 Western blot法檢測Cin對CIA大鼠滑膜組織OPN蛋白表達的影響 與對照組比較,模型組滑膜組織中OPN蛋白相對表達水平顯著增加(P<0.05);與模型組比較,低、高劑量Cin組中OPN蛋白相對表達水平顯著減少(P<0.05),表明Cin抑制了滑膜組織中OPN蛋白的表達,且具有劑量依賴性,見圖3。

2.5 Cin對CIA大鼠軟骨中OPN mRNA表達的影響 各組大鼠軟骨中OPN mRNA的相對定量分析結果顯示,與對照組比較,模型組大鼠軟骨OPN mRNA表達顯著增加(P<0.05);與模型組比較,低、高劑量Cin組大鼠軟骨OPN mRNA表達顯著減少(P<0.05),其中高劑量Cin組大鼠軟骨中OPN mRNA表達較低劑量Cin組減少(P<0.05),見圖4。

圖4 各組大鼠OPN mRNA在軟骨中的表達

2.6 Cin對CIA大鼠關節組織病理形態的影響 各組大鼠滑膜組織HE染色結果顯示,對照組滑膜組織無炎癥細胞浸潤和滑膜增生,模型組滑膜組織出現炎性細胞浸潤和滑膜增生,低劑量Cin組以及高劑量Cin組經過Cin治療后都可減輕大鼠關節炎誘導的滑膜組織炎性細胞浸潤和滑膜增生,見圖5。

圖5 各組大鼠滑膜病理組織變化(HE 400×)

3 討論

RA是一種慢性自身免疫性關節炎,其特征是關節腫痛、晨僵、關節畸形和殘疾。目前,RA主要通過藥物治療,其中NSAIDs和糖皮質激素能有效緩解RA患者的疼痛,但對病情的改善無明顯作用,其嚴重的胃腸反應、肝腎毒性、心血管事件等副作用限制了其臨床應用。DMARDs治療對RA病情控制至關重要,但長期使用也有較明顯副作用,同時DMARDs對部分患者治療效果不佳。生物制劑常用于對傳統DMARDs無反應的中重度RA患者。雖然有效,但由于其副作用(易受嚴重感染和癌癥風險)和高昂價格,這些靶向藥物的使用受到限制。 RA屬于中醫“痹證”范疇。在過去的數千年里,中醫為RA的治療提供了許多有用且廉價的方法和藥物[8]。肉桂是樟科樟屬植物,習稱“桂類藥材”,藥食用途廣泛,具有補火助陽、溫里散寒的功效;Cin是從肉桂樹皮中分離得到的一種活性化合物,是肉桂的代表性成分,具有積極的抗菌、抗炎、抗腫瘤和降糖等作用,可用于治療血液循環障礙、消化不良和炎癥等[3-4]。

RA的發病機制涉及多種細胞因子和細胞組成的復雜網絡,這些細胞釋放細胞因子會觸發滑膜細胞增殖,并對軟骨和骨骼造成損傷。細胞因子TNF-α和IL-6的參與是RA發病機制的核心,其他細胞因子如IL-17也在其中發揮重要作用[9]。在RA中,TNF-α可以通過激活NF-κB信號通路發揮促炎作用,TNF-α能夠誘導白細胞和內皮細胞的激活,細胞因子和趨化因子的級聯反應以及血管生成,此外,TNF-α還能夠調控破骨細胞的生成,抑制成骨細胞的分化,從而打破骨代謝平衡,產生骨質損傷[10]。IL-6是一種急性期蛋白,可增強機體的炎癥反應,RA患者急性期C反應蛋白生成、血管翳形成和貧血等典型表現可以用IL-6的許多生物學活性來解釋[11]。有研究表明,IL-6可調節Th17細胞、調節性T細胞(Regulatory T cell,Treg)的分化。Th17細胞發育也需要IL-6-STAT3通路,IL-6-SATA3信號軸的增強會導致大鼠出現IL-17A介導的自身免疫性關節炎[12]。此外,IL-6可以調節Treg與Th17細胞的平衡。Treg細胞轉化為Th17細胞是由滑膜成纖維細胞衍生的IL-6誘導的,轉化的Th17細胞具有更強破骨作用[13]。IL-6還與TNF-α、IL-17聯合調節破骨細胞生成,進而導致骨質破壞與骨侵蝕[11]。IL-17參與RA疾病發生發展進程,它主要可促進成纖維樣滑膜細胞的激活、破骨細胞的生成、中性粒細胞、巨噬細胞和B細胞的招募和激活。IL-17和TNF-α之間的協同作用可激活促炎介質的產生,如IL-1β、IL-6、IL-8、前列腺素E2和基質金屬蛋白酶,從而促進早期炎癥向慢性關節炎進展[14-15]。TNF-α、IL-17和IL-6在RA的發生發展過程中發揮著協同作用[16-17]。本研究結果顯示,與對照組比較,模型組大鼠足跖明顯腫脹,關節炎評分顯著升高,關節組織病理切片出現炎性細胞浸潤和滑膜增生,血清中炎癥因子IL-6、IL-17、TNF-α水平亦顯著升高,與模型組比較,桂皮醛治療組大鼠足跖腫脹明顯減輕,關節炎評分顯著降低,血清炎癥因子IL-6、IL-17、TNF-α的水平亦顯著降低,表明Cin可減少關節炎大鼠炎癥因子IL-6、IL-17、TNF-α的釋放,降低大鼠關節炎評分,減輕滑膜炎癥反應,進一步緩解大鼠關節組織損傷。

OPN是一種分布廣泛的細胞外基質蛋白,被認為是參與RA發病中的一種重要促炎因子。CD4+ T細胞分泌的OPN可通過IL-18促進Th1細胞因子在局部炎癥中的作用,Th1細胞因子在RA發病過程中發揮重要作用[5]。OPN還參與白細胞、淋巴細胞和單核細胞聚集、遷移的過程,并促進相關炎癥因子分泌,進而推動滑膜炎的發展[18]。OPN與骨代謝過程密切相關,OPN影響Th1/Th2細胞的平衡以及通過T細胞表面受體誘導Th17細胞分化均可調節IL-17水平,進而通過Syk/PI3K/Akt信號通路和NF-kB信號通路增強破骨細胞活性,最終導致骨和軟骨破壞[19]。OPN還通過與細胞表面avb3整合素和CD44相互作用促進破骨細胞與骨基質的附著。OPN與整合素和CD44等受體相互作用,調節軟骨細胞、成骨細胞和破骨細胞的增殖、分化、炎癥、代謝的生理和病理過程[20]。此外,有研究發現OPN缺乏可防止關節軟骨破壞,抑制OPN表達可改善CIA大鼠的關節炎癥反應和骨破壞,這支持OPN在RA的骨代謝過程中發揮重要作用[21]。本研究中,OPN在CIA大鼠血清、滑膜、軟骨中顯著升高,并且這一趨勢被Cin逆轉。OPN改變趨勢與CIA大鼠關節炎評分、HE病理改變一致,提示Cin可能通過下調OPN表達水平來減少炎癥因子釋放和恢復骨代謝的平衡改善Ⅱ型膠原誘導的大鼠關節炎。同時實驗發現高劑量組關節炎的緩解和OPN及炎癥因子的表達下調均較低劑量組更顯著,表明較高劑量Cin對RA可能具有更強的治療作用。因此,本研究未來將進一步探索Cin治療RA的更佳適用劑量,OPN在RA發生發展中起重要作用,未來需深入探索其在RA發病機制中的作用以及能否成為一種新的RA治療靶點。Cin可能為RA患者帶來更多治療選擇。但尚需進一步大樣本量動物試驗及臨床試驗予以證實。

4 結論

桂皮醛可改善大鼠II型膠原誘導性關節炎誘發的炎癥反應和關節損傷,其作用可能與下調OPN表達水平、降低IL-6、IL-17和TNF-α等炎癥因子水平、減輕骨與軟骨的破壞有關。