阻斷CXCR2對宮內絨毛膜羊膜炎大鼠胎盤組織NLRP3信號轉導及Th1/Th2平衡的影響*

林建麗 李慧 吳小妹 周玉華

(海南醫學院第一附屬醫院產科,海南 海口 570100)

早產是導致大約85%新生兒死亡的主要原因,而宮內感染是誘發早產的原因之一,占全球所有早產病例的40%左右[1]。絨毛膜羊膜炎(Chorioamnionitis,CA)是一種常見的妊娠并發癥,是世界范圍內早產、死產的主要原因。CA作為一種特異性的宮內感染性疾病,還與胎兒生長發育密切相關,此外,其能增加腦室內出血、腦室周圍白質軟化、支氣管肺發育不良等疾病的發生率[2-5],給個人和家庭造成較大壓力,并給社會帶來沉重的經濟負擔。胎盤組織對于胎兒多器官和系統的發育均十分重要,胎盤功能障礙會導致胎兒生長受限、早產、流產以及神經發育異常等[6-7]。已知CA會導致胎盤組織出現炎癥反應,炎癥細胞和炎癥因子均可誘導血管內皮發生損傷,導致胎盤血液灌注不良,這一現象與早期早產密切相關[8]。趨化因子配體1(Chemokine ligand 1,CXCL1)及其同源受體(CXC receptor 2,CXCR2)與CA的病理生理學過程有關,隨著宮內炎癥加劇而表達上調,此外,胎盤組織內炎癥的嚴重程度與CA中CXCL1水平呈正相關[9]。CXCR2是典型的G蛋白偶聯受體,作為特征明確的趨化因子受體之一,顯示出強大的嗜中性粒細胞或髓源性抑制細胞趨化性,在不同疾病中參與免疫介導的炎癥性病理過程[10-11]。目前,CXCR2被認為是控制發病機制中炎癥損傷的潛在藥理學靶點。關于CXCR2在CA進程中的作用及機制尚未明確,本研究旨在通過給予孕鼠羊膜腔注射脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)誘導CA模型,觀察CXCR2 拮抗劑SB225002對CA的影響并探討可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級健康成年SD大鼠,雌性50只,雄性25只,體質量270～310 g,由海南藥物研究所有限責任公司[生產許可證號:SCXK(瓊)2020-0007]提供,雌鼠和雄鼠分籠飼養。動物房溫度保持在22～26 ℃之間,相對濕度為40%～60%,每天照明12 h,按時清潔排泄物,并補充食物,期間所有大鼠均自由攝食、飲水。本研究獲得我院倫理委員會審核批準(批準文號:KT20210610188)

1.2 主要材料與試劑 CXCR2拮抗劑SB225002(英國Biorbyt公司),LPS(美國Sigma公司),HE染色試劑盒(北京雷根生物技術公司),Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司),第一鏈cDNA合成試劑盒(上海生工生物工程公司),熒光定量SYBR?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)試劑盒(日本Takakra公司),IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5及IL-10特異性ELISA試劑盒(北京索萊寶科技公司),RIPA裂解液、BCA蛋白測定試劑盒和DAPI染料(上海碧云天生物研究所),高敏型ECL化學發光檢測試劑盒(南京諾唯贊生物公司),大鼠外周血淋巴細胞分離液(北京凱詩源生物科技公司),免疫熒光染色試劑(上海晶萊生物公司),兔抗NLRP3單克隆抗體、兔抗ASC多克隆抗體及兔抗Caspase-1多克隆抗體(英國Abcam公司),FITC標記山羊抗兔IgG抗體、FITC標記的CD4抗體、PE-A標記的IFN-γ抗體以及PE-A標記的IL-4抗體(北京百奧萊博科技有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 實驗動物模型制備與分組處理 將雌雄大鼠按2∶1的數目比例進行合籠飼養,記錄時間,以發現雌性大鼠陰道栓形成或顯微鏡下觀察到陰道分泌物涂片有大量精子則視為交配成功,記為受孕第1天。將孕鼠單籠飼養,隨機選取48只分為4組:對照組、SB225002組、LPS組、LPS+SB225002組,每組12只。LPS組和LPS+SB225002組的孕鼠在受孕第18天時,10%水合氯醛腹腔麻醉,無菌環境下備皮開腹,向孕鼠羊膜腔內分別注射0.5 mg/kg的LPS,對照組和SB225002組的孕鼠同時注射等體積生理鹽水;接著給予SB225002組和LPS+SB225002組的孕鼠羊膜腔內注射3 mg/kg的CXCR2拮抗劑SB225002,對照組和LPS組同時注射等體積生理鹽水。注射完畢后,將胚胎放回腹腔中,無菌生理鹽水沖洗腹腔并分層關閉,監測孕鼠活動、攝食、陰道流血和感染等情況,各孕鼠實驗前的體質量無統計學差異。

1.3.2 胎盤組織形態學檢查 將各組孕鼠麻醉,剖腹留取胎盤組織,生理鹽水清洗后濾紙吸干水分,置入4%多聚甲醛固定24 h,通過梯度酒精脫水與二甲苯透明后,浸蠟包埋,在病理切片機上制備4 μm 厚的組織切片。將切片脫蠟至水,置入蘇木精水溶液中染色5 min,在酸水與氨水中進行分色,浸泡數秒鐘,流水沖洗,再置入伊紅染色液染色2 min,進行脫水、透明,滴加樹膠在已透明的組織切片上,晾干,在光學顯微鏡下觀察胎盤組織病理學形態變化并采集圖像。每張切片隨機選取3個視野,通過Image-Pro Plus軟件分析血竇面積,結果取平均值。

1.3.3 免疫熒光染色 取制備的胎盤組織切片,經梯度酒精脫水與二甲苯透明后,放入檸檬酸修復液里微波爐加熱煮沸,室溫冷卻,PBS洗滌,浸入0.3% TritonX-100中孵育處理15 min,滴加10%山羊血清覆蓋切片,37 ℃封閉2 h。甩去殘液,加入兔抗NLRP3單克隆抗體(1∶200)作為一抗進行標記,4 ℃孵育過夜;次日,甩去殘液,PBS洗滌,以FITC標記山羊抗兔IgG(1∶1 000)作為二抗,37 ℃濕盒避光孵育1 h,PBS洗滌后,加入DAPI染料,37 ℃濕盒避光染色10 min,滴加熒光抗淬滅劑封片,晾干,在熒光顯微鏡下觀察各組大鼠胎盤組織內染色情況,并采集圖像,每張切片隨機取5個視野,計數該視野下NLRP3陽性表達數目,結果取平均值。

1.3.4 實時熒光定量PCR反應 取胎盤組織剪碎并研磨勻漿,Trizol試劑液提取總RNA,按說明步驟操作,經分光光度計檢測樣品純度與濃度。根據第一鏈cDNA合成試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA。以cDNA為模板,在熒光定量PCR系統進行定量擴增,檢測目的基因在mRNA上的表達,具體按照SYBR?Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)試劑盒說明書來配制反應體系,依次加入各試劑和引物,GAPDH基因作為內參。擴增程序設置如下: 95 ℃ 30 s,1個循環;95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s,40個循環。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成,具體如下:NLRP3,上游引物5’-CCATCGGCAAGACCAAGA-3’,下游引物5’-ACAGGCTCAGAATGCTCATC-3’; ASC,上游引物5’-AACCCAAGCAAGATGCGGAAG-3’,下游引物5’-TTAGGGCCTGGAGGAGCAAG-3’;Caspase-1,上游引物5’-CAGACAAGGGTGCTGAACAA-3’,下游引物5’-TCGGAATAACGGAGTCAATCA-3’;GAPDH,上游引物5’-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3’,下游引物5’-CACCCTGTTGCTGT AGCCAAA-3’,擴增結束后,采用2-ΔΔCt法計算基因相對表達量。

1.3.5 Western blot法 取胎盤組織剪碎并研磨勻漿,預冷的RIPA裂解液裂解組織提取總蛋白,BCA法測定濃度。制備10% SDS-PAGE,將上樣緩沖液與樣本混合,沸水煮10 min使蛋白變性,取等量蛋白樣品加入SDS-PAGE膠孔內,經電泳分離蛋白,電轉至PVDF膜。制備封閉液,將轉好的膜浸入5%脫脂奶粉中封閉2 h,TBST洗膜,加入一抗工作液,4 ℃孵育過夜。次日,TBST洗膜,加入二抗工作液,室溫孵育2 h。TBST再次洗膜后,利用ECL試劑顯色,在凝膠成像系統下曝光,通過Image-Pro Plus分析軟件統計各蛋白條帶灰度值,GAPDH蛋白作為內參,以目的蛋白與內參蛋白的灰度值之比作為目的蛋白的相對表達量。

1.3.6 酶聯免疫吸附法 各組大鼠眼眶靜脈叢采血,樣品室溫靜置2 h,以4 000 r/min離心15 min,獲取上清,使用特異性ELISA試劑盒測定各組樣本血清中IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5以及IL-10的水平,實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行,并制作標準曲線,計算各細胞因子的含量。

1.3.7 流式細胞術 采集各組大鼠外周血,將100 μL血液樣本與200 μL PBS緩沖液混合,加入大鼠淋巴細胞分離液分離單核細胞,以4 000 rpm離心30 min,吸取上中層交界處含淋巴細胞與單核細胞混合液,繼續以4 000 rpm離心30 min,保留沉淀。重懸沉淀,添加FITC標記的CD4抗體,室溫避光靜置30 min,再使用固定劑與破膜劑處理,分別加入PE-A標記的IFN-γ抗體、PE-A標記的IL-4抗體,室溫避光靜置30 min,離心后棄上清,PBS緩沖液重懸,通過流式細胞儀檢測Th1、Th2細胞比例變化情況,并計算Th1/Th2比值。

2 結果

2.1 各組大鼠胎盤組織病理學形態觀察結果 通過HE染色觀察各組大鼠胎盤組織形態學,可見對照組大鼠胎盤組織結構正常,血管規則,未見明顯的炎癥細胞浸潤;相較于對照組,SB225002組大鼠胎盤組織未發生明顯變化(P>0.05),而LPS組大鼠胎盤組織內蛻膜炎癥細胞浸潤及絨毛膜炎癥程度明顯,血管管腔不規則,胎盤血竇面積顯著增加(P<0.05),胎盤結構發育受到破壞;與LPS組比較,LPS+SB225002組大鼠胎盤組織內蛻膜炎癥細胞浸潤減輕,絨毛膜炎癥現象也得到改善,胎盤血竇面積顯著減小(P<0.05),見圖1。

2.2 各組大鼠胎盤組織內NLRP3表達水平比較 通過免疫熒光染色觀察各組大鼠胎盤組織內NLRP3表達,圖中紅色熒光代表NLRP3陽性表達,相較于對照組,SB225002組大鼠胎盤組織內紅色熒光強度未發生明顯變化,NLRP3陽性表達率變化無顯著差異(P>0.05),LPS組大鼠胎盤組織內紅色熒光強度明顯增強,NLRP3陽性表達率顯著升高(P<0.05);而LPS+SB225002組大鼠胎盤組織內紅色熒光強度明顯減弱,NLRP3陽性表達率顯著低于LPS組(P<0.05),見圖2。

圖2 各組大鼠胎盤組織NLRP3表達檢測

2.3 各組大鼠胎盤組織內NLRP3信號轉導途徑相關基因及蛋白表達水平比較 實時熒光定量PCR檢測結果顯示,與對照組比較,SB225002組大鼠胎盤組織內NLRP3、ASC及Caspase-1的mRNA相對表達量變化無顯著差異(P>0.05),LPS組大鼠胎盤組織內NLRP3、ASC及Caspase-1的mRNA相對表達量均顯著上調(P<0.05);與LPS組比較,LPS+SB225002組大鼠胎盤組織內NLRP3、ASC及Caspase-1的mRNA相對表達量均顯著下調(P<0.05)(圖3)。Western blot檢測結果顯示,SB225002組大鼠胎盤組織內NLRP3、ASC及Caspase-1的蛋白相對表達量與對照組之間均無顯著差異(P>0.05),而LPS組大鼠胎盤組織內NLRP3、ASC及Caspase-1的蛋白相對表達量均顯著高于對照組(P<0.05);與LPS組比較,LPS+SB225002組大鼠胎盤組織內NLRP3、ASC及Caspase-1的蛋白相對表達量均顯著下調(P<0.05),見圖4。

圖3 各組大鼠胎盤組織NLRP3、ASC及Caspase-1 mRNA表達水平比較

圖4 各組大鼠胎盤組織NLRP3、ASC及Caspase-1蛋白表達水平比較

2.4 各組大鼠血清炎性因子水平比較 ELISA檢測各組大鼠血清內IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5及IL-10水平結果顯示,與對照組比較,SB225002組大鼠血清內IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-5及IL-10水平變化均無顯著差異(P>0.05),LPS組大鼠血清IL-2、IFN-γ水平顯著升高,IL-4、IL-5及IL-10水平顯著降低(P<0.05);與LPS組比較,LPS+SB225002組大鼠血清IL-2、IFN-γ水平顯著降低,而IL-4、IL-5及IL-10水平均顯著升高(P<0.05),見表1。

表1 各組大鼠血清細胞分泌因子水平比較

2.5 各組大鼠外周血Th1/Th2細胞比例分布比較 流式細胞術檢測結果顯示,與對照組比較,SB225002組大鼠外周血Th1細胞比例、Th2細胞比例及Th1/Th2比值變化均無顯著差異(P>0.05),LPS組大鼠外周血Th1細胞比例和Th1/Th2比值均顯著升高,Th2細胞比例顯著降低(P<0.05);與LPS組比較,LPS+SB225002組大鼠外周血Th1細胞比例和Th1/Th2比值均顯著降低,Th2細胞比例顯著升高(P<0.05),見圖5。

圖5 各組大鼠外周血Th1/Th2細胞比例分布

3 討論

CA主要表現為母體發熱、白細胞增多、心動過速、子宮壓痛以及胎膜早破等,臨床CA的診斷最常在臨產或足月分娩時進行。CA可引起胎兒炎癥反應綜合征,這是由于胎兒免疫系統被激活后釋放了大量炎癥因子,這些炎癥因子會干擾胎兒腦細胞因子的正常表達,導致早產兒腦損傷[12]。也有一些臨床前研究表明,CA引起的胎兒肺上皮損傷導致血管滲透壓受損和細胞凋亡,使肺泡壁變薄,此外,炎癥因子也會損傷胎兒肺毛細血管內皮細胞,使得肺泡及血管結構受損,最終引起支氣管肺發育不良[13-14]。LPS是革蘭氏陰性菌致炎的主要成分,用于建立妊娠相關的炎癥性疾病模型,本研究采用孕鼠羊膜腔注射LPS誘導構建宮內CA模型,探討了使用SB225002阻斷CXCR2可對CA胎盤組織損傷起到明顯的改善作用,為CA的臨床診療提供新思路。

CXCR2作為一種在嗜中性粒細胞中表達的趨化因子受體,在癌癥和各種炎癥或免疫疾病中都起著至關重要的作用,阻斷CXCR2是多種疾病治療的潛在新途徑。Saintigny等[15]研究表明CXCR2的表達水平與肺癌的侵襲和轉移有關,肺癌細胞中CXCR2高表達與臨床患者的預后不良有關,抑制 CXCR2 及其配體CXCL8可顯著抑制肺癌細胞的增殖和遷移,并減少腫瘤血管生成。Zhu等[16]研究指出在活動性潰瘍性結腸炎患者的結腸黏膜組織和外周血細胞中CXCR2的表達顯著增加,CXCR2在中性粒細胞中也高表達,并與疾病活動度呈正相關,用SB225002阻斷CXCR2可以顯著改善DSS誘導的小鼠潰瘍性結腸炎,并降低了中性粒細胞中促炎介質的產生,該研究表明了CXCR2通過調節中性粒細胞的免疫反應在潰瘍性結腸炎的發病機制中起關鍵作用。Sharma等[17]研究表明CXCR2在乳腺癌骨轉移過程中調節破骨細胞活化,利用Cl66-shCXCR2敲低乳腺癌細胞中CXCR2表達并植入雌性Balb/c小鼠顱骨背側皮瓣上后發現腫瘤生長和腫瘤誘導的骨溶解顯著減少,同時,觀察到注射乳腺癌Cl66-Luc細胞的CXCR2-/-小鼠骨骼中的骨破壞和轉移也較野生型小鼠中明顯減少。Nie等[18]研究發現在血管緊張素II誘導的腹主動脈瘤組織中的CXCR2表達增加,利用SB265610阻斷CXCR2可減輕腹主動脈瘤中膠原沉積、彈性蛋白降解、金屬基質金屬蛋白酶表達以及巨噬細胞積累,從而降低腹主動脈瘤的形成。在本研究中,通過SB225002阻斷CXCR2后CA大鼠胎盤組織內蛻膜炎癥細胞浸潤和絨毛膜炎癥現象減輕,胎盤血竇面積也減小,由此推測,CXCR2可能在CA的發病機制中起著重要作用。

NLRP3炎性體可作為多種炎性疾病的潛在治療靶點。在羊膜腔感染或炎癥下,絨毛膜羊膜中NLRP3炎性體激活與自發性早產有關,此外,在患有CA的自發性早產婦女的胎膜組織中也已檢測到炎癥小體相關基因NLRP3和Caspase-1的表達上調,同時表明了抑制NLRP3炎性體可延長妊娠期,不僅可以將CA誘發的早產率降低30%,而且還可以顯著提高新生兒存活率[19]。奇異變形桿菌、陰道加德納菌和B族鏈球菌是羊膜腔內感染常見的微生物,可誘導巨噬細胞中NLRP3炎性體激活[20-22],這進一步暗示該途徑與導致早產的機制有關,阻斷NLRP3炎性體激活可作為相關疾病的治療方案。本研究結果顯示,利用SB225002阻斷CXCR2后發現CA大鼠胎盤組織內NLRP3表達的熒光強度明顯減弱,NLRP3、ASC及Caspase-1的mRNA相對表達量和蛋白相對表達量均顯著下調,說明阻斷CXCR2抑制了NLRP3途徑的激活,這可能是其在CA中發揮保護作用的途徑之一。

在CA中各種交聯免疫因素從而導致患者的適應性免疫系統被激活,各細胞因子分泌及釋放的變化可能會改變T細胞發育以促進T輔助細胞效應反應的發展[23-25]。母體與胎兒間的免疫相容是妊娠成功的必備條件,其中Th1/Th2細胞極性的調節是保證胎兒健康生長的關鍵。已知CA孕婦外周血中Th1細胞分泌因子IL-2、TNF-ɑ及IFN-γ水平均升高,而Th2細胞分泌因子IL-4和IL-6水平降低,說明Th1/Th2細胞極性狀態向Th1偏移,Thl/Th2平衡狀態被打破[26]。本研究同樣顯示,CA大鼠血清IL-2、IFN-γ水平顯著升高,IL-4、IL-5及IL-10水平顯著降低,外周血Th1細胞比例和Th1/Th2比值均顯著升高,Th2細胞比例顯著降低;而在CXCR2阻斷劑SB225002作用下,CA大鼠血清IL-2、IFN-γ水平表現為降低,IL-4、IL-5及IL-10水平均表現為升高,同時,外周血Th1細胞比例和Th1/Th2比值均顯著降低且Th2細胞比例顯著升高,由此推測,阻斷CXCR2參與調控CA中Th1/Th2失衡現象,抑制了Th1/Th2向Th1偏移。

4 結論

CXCR2可能參與了孕鼠CA進程,阻斷CXCR2可通過抑制NLRP3信號轉導途徑及調控Th1/Th2趨于平衡狀態,從而對CA孕鼠起到一定的保護作用。由于受到產前產后諸多因素的干擾,CA在妊娠中多發,對母嬰結局造成了不良影響,本研究通過構建CA孕鼠大鼠模型并給予CXCR2拮抗劑SB225002處理后,取得了良好的實驗效果,這為CA的治療提供了提供理論依據與實驗支持。但也存在一定不足,需進一步從新生幼鼠角度進行相關功能檢測,并深入探究相關的調控機制,以期為臨床上治療CA提供新思路。